Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Denna studie har fått stöd av Vetenskapsrådet, Strategiska forskningsområdet Exodiab, Dnr 2009-1039, Stiftelsen för Strategisk Forskning Dnr IRC15-0067 till LUDC-IRC, Kungliga Fysiografiska Sällskapet i Lund, Diabetes och Barndiabetförbundetes.

Den regionala etikkommittén i Lund, Sverige, godkände studien enligt lagen Om etikprövning av forskning som involverar människor. Djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med den svenska etiken i djurförsök och godkändes av etikkommittéerna i Malmö och Lund. 6 till 8 veckor gamla immunodeficient NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA - tomat. Rag2-/-) mottagarmöss användes som mottagare för transplantation av mänsk...

<ol>
	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

En metod presenteras för att studera den mänskliga bukspottskörteln holme cell ympning processen genom att observera medverkan av mottagare och givare vävnad. Efter en minimal invasiv kirurgi implantera mänskliga holmar i främre kammaren av en immunodeficient mus öga, musen återhämtar sig snabbt inom några minuter efter operationen. Proceduren utförs på ett öga. Generellt, från 5 – 7 dagar postimplantation och framåt hornhinnan är tillräckligt läkt för att utföra intravital bildbehandling.
<p cl...

Diabetes mellitus beskriver en grupp av metabola sjukdomar som kännetecknas av förhöjda nivåer av blodglukos som resultat av otillräcklig insulinproduktion från förlust eller dysfunktion av bukspottskörteln holme betaceller, ofta åtföljs av insulinresistens. Typ 1 (T1D) och typ 2-diabetes (T2D) är komplexa sjukdomar där betacellernas progressiva dysfunktion orsakar sjukdomsutveckling. T1D fälls ut av en autoimmun attack på betacellerna, medan T2D anses vara driven av metabola faktorer, om än med ökande bevis på låggradig systemisk inflammation1. Transplantation av givaren mänskliga holmar, särskilt till T1D patienter, erbjuder potential för att ge fysiologiska glykemisk kontroll. Men, en brist på vävnad givare och dålig holme engraftment har förhindrat holme transplantation att bli en mainstream terapeutiska alternativ. En väsentlig andel av det funktionella holmetransplantatet går förlorat under den omedelbara posttransplantationsperioden (24–48 h) på grund av den hypoxiska, inflammatoriska, immunogena värdmiljön2,3. För att utvärdera effektiviteten av interventionsmetoder för förbättring av holmeöverlevnad är kontinuerlig övervakning av sådana transplantationer nödvändig.
In vivo tekniker för att bilden och spåra ödet för transplanterade mänskliga bukspottskörteln holmar efter transplantation fortfarande en utmaning för diabetes forskning4,5. Hittills visar noninvasive imaging tekniker, inklusive positron emissions tomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRI), eller ultraljud (US) potential för kvantifiering och funktionell utvärdering av transplanterade holmar i experimentella förhållanden5. Med tanke på de små storlekarna i skäret lider dock kvantitativa mätningar av dessa modaliteter av otillräcklig upplösning. Ögats främre kammare (ACE) som transplantationsplats för observation är en lovande noninvasiv avbildningslösning som erbjuder effektivt högre rumslig upplösning och frekvent övervakning under långa tidsperioder6. Denna metod har framgångsrikt utnyttjats för att studera mus holme biologi (granskas i Yang et al.7), autoimmuna immunsvar8, samt mänskliga holme ympning9,10.
Här ACE transplantation metoden kombineras med en 2-foton bildframställning strategi för att undersöka dynamiken i den mänskliga bukspottskörteln holme engraftment processen genom kontinuerliga och upprepade inspelningar på enskilda holme ympkvistar i upp till 10 månader efter transplantation. Multiphoton imaging egenskaper större bildframställning djup och minskad övergripande fotobleaching och fotoskador övervinna bildframställning begränsningar konfokalmikroskopi11. Kvantifiering av fluorescerande avbildning innebär flera steg, inklusive holme prov beredning, holme transplantation, bild förvärv, bild filtrering för att ta bort holme buller eller bakgrund, segmentering, kvantifiering och dataanalys. Det mest utmanande steget är vanligtvis partitionering eller segmentering av en bild i flera delar eller regioner. Detta kan innebära att separera signal från bakgrundsljud, eller klustring regioner av voxels baserat på likheter i färg eller form för att upptäcka och märka voxels av en 3D-volym som representerar holme vaskula, till exempel. När den har segmenterats är statistik som objektvolymstorlekar vanligtvis okomplicerad att extrahera. Förutsatt är en metod för kvantifiering och extrahering av bildframställning data, såsom segmentering och datavisualisering. Särskild uppmärksamhet ägnas åt avlägsnandet av autofluorescens i mänskliga holmar och åtskillnad mellan holme vasculature och holme kapsel bildar mottagarceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

Imaging betaceller är ett viktigt steg mot förståelse av holme transplantation. Även om olika bildåtergivning plattformar för inspelning av beta cellbiologi har utvecklats och utnyttjas in vivo, de är begränsade när det gäller att tillåta encellsupplösning och kontinuerlig longitudinella inspelningar. På grund av öhinnans transparens är ögats främre kammare (ACE) i möss väl lämpad att studera human- och muspanscreatic holme cellbiologi. Här är en beskrivning av hur detta tillvägagångssätt kan användas för att utföra kontinuerliga longitudinella inspelningar av ympning och revascularization av enskilda mänskliga holme ympkvistar. Mänskliga holme ympkvistar sätts in i ACE, med hjälp av NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-möss som mottagare. Detta möjliggör för undersökningen av expansionen av mottagaren kontra givare celler och bidraget från mottagarceller i att främja inkapsling och vaskularisering av transplantatet. Vidare beskrivs en stegvis metod för bildanalys och kvantifiering av holmevolymen eller segmenterad vasculature- och holmekapsel som bildar mottagarceller.

Icke-märkta mänskliga holmar var transplanteras in i ACE av 8 veckor gamla kvinnliga NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomat. Rag2−/−) mottagarmöss. För att förhindra att mänsklig vävnad avstötning, immundeficient Rag2 knockout möss valdes som mottagare. Hos dessa transgena möss uttryckte alla celler och vävnader ett membraninriktat tomatfluorescensprotein (mT) som möjliggör tydlig identifiering av mottagaren och giv...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Målet med detta protokoll är att kontinuerligt övervaka dynamiken i den mänskliga bukspottskörteln holme engraftment processen och den bidragande värd kontra givaren celler. Detta åstadkoms genom att mänskliga holmar transplanteras in i ögats främre kammare (ACE) hos en NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-musmottagare följt av upprepad 2-fotonavbildning.

Längsgående In Vivo Imaging och kvantifiering av mänskliga pankreas islet ympning och bidragande värdceller i främre ögat kammaren

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE är en optimal bildframställning sevärdheter. Det stöder att upprepa det i långsiktiga in vivo avbildning av holme celler för att studera deras funktion och livskraft i en ympning situation. Det kan också utvidgas till att studera andra aspekter under fysiologiska och patologiska förhållanden i realtid.Fördelen med ACE tekniken ligger i det faktum att samma enskilda mänskliga bukspottskörteln holmar kan följas noninvasively med sub-cellulära upplösning under en längre tid. Framgångsfrekvensen för ersättningsterapi för betaceller fortsätter att förbättras. Men utvärdera effektiviteten av holme ympning och överlevnad in vivo, är fortfarande utmanande.Denna metod kan hjälpa till att bedöma och optimera resultaten av holme transplantationer. Detta tillvägagångssätt är inte begränsat till bukspottskörteln holmar bara. Det är också väl lämpad att studera vävnader påverkas.Till exempel, i diabetiker komplikationer, som njure glomeruli eller lever bitar, bara för att nämna några. Till att börja placera musen på en varm värmedyna placera den i huvudet hållaren och sätta på näsan mask. Använd tummen och pekfingret för att lyfta huvudet något.Fäst den med de metalliska bitarna på sidorna. Se till att öronbitarna fixar huvudet direkt under öronen. Subkutant injicera buprenorfinlösning i musens baksida.Dra försiktigt tillbaka ögonlocken i ögat för att transplanteras med hjälp av trubbiga tärningar. Pop ögat ut och löst fixa den med ett par pincett täckt med en polyeten rör. Efter överföring av ögonlocken till en Petriskål med PBS, plocka upp cirka 20 till 30 holmar i ögat kannular.Med hjälp av en 25 gauge nål nivå uppåt, försiktigt in spetsen i hornhinnan och göra en enda lateral snitt. Lyft försiktigt hornhinnan med kanylen förladdad med holmar, och släpp långsamt ner skären i ögat. Dra långsamt tillbaka kanylen och applicera ögongel i ögat.Efter 10 minuter, ta bort tnypsen, hålla ögonlocket och sätta ögat tillbaka till sitt normala läge. För avbildning av implanterade humana holmar med två fotonmikroskopi, placera huvudhållarens plattform under mikroskopet och administrera ögongel på ögat som en nedsänkningsvätska mellan hornhinnan och linsen. Placera ögat under målsättningen och avbilda de implanterade mänskliga holmarna enligt beskrivningen i textmanuskriptet.För att ta bort autofluorescensen, gå till bildbehandlingsfliken, välj kanalaritmetik och skriv kanal ett minus kanal två. Detta skapar en ny kanal fyra. Byt namn på det vasculature.Upprepa denna process och skriv kanal tre minus kanal två för att skapa en ny kanal fem och byta namn på det tomat alla. Om du vill definiera holmen manuellt skapa en ny yta och välj redigera manuellt i guiden. Behåll pekaren i valt läge och i 3D-vy.Och klicka på volym för att visualisera avsnitt. I ritningsfliken välj kontur och klicka på Rita för att börja rita konturer runt holme kantlinjen, med början i segment position ett. Flytta sedan till en ny segmentposition och upprepa ritningskonturer.Avsluta med det sista segmentet på toppen av holmen och avsluta genom att klicka på fliken skapa yta. Nästa segment, holme vasculature och holme tomat fluorescens med hjälp av holme mask. Välj det tidigare definierade holmemaskobjektet, gå till redigeringsfliken och klicka på fliken mask alla, som öppnar ett nytt fönster.Välj vasculature kanal i kanalval dropdown menyn och aktivera alternativ duplicera kanal innan du använder mask. Konstant insida, utvändigt och uppsättningen voxels utvändigt ytbehandlar till 0.000 som skapar en ny kanaliserar sex. Byt namn på denna kanal holme vasculature.Upprepa föregående steg och välja tomat alla i kanalen val dropdown menyn, för att skapa den nya kanalen, byta namn på den, holme tomat. Skapa sedan en ny yta i scenmenyn och välj automatiskt skapande i guiden. Ställ in källkanalen till den tidigare skapade holmevaskulaturen och välj subtraktion med bakgrund.Använd filter som tillval. Välj till exempel volym och justera filtret i fönstret, som kan ta bort markerade serviceobjekt. Avsluta guiden och ge det nya ytobjektet namn, holme vasculature.I objektet för tjänsten islet vasculature gå till redigeringsfliken och klicka på fliken mask alla, som öppnar ett nytt fönster. Välj holme tomat kanal i kanalval dropdown menyn och ställ voxels utanför yta till 10.000 som skapar en ny kanal. Byt namn på denna kanal holme tomat vasculature.För att segmentera tomat kapsel lysrörssignal välja kanal aritmetik i bildbehandling fliken och skriv kanal sju minus kanal åtta skapa den nya kanalen. Byt namn på den tomatkapsel. Skapa en ny yta som tidigare beskrivits och välj källkanaler, holmetomatvasculature eller tomatkapsel i guiden.Utför sedan subtraktion i bakgrunden. Öppna filen med islets backscatter och skapa en ny yta. I guiden väljer du automatiskt skapande och definierar region av intresse.Om det behövs justerar du tröskeln i absolut intensitet. Ytobjektet kan klickas på eller av, för att krysskoll med motsvarande kanalintensitet. När klar stänga guiden.Slutligen utför kvantifiering, väljer ett skapat ytobjekt i scenmenyn och går till statistikfliken. Hämta detaljerade volymdata genom att välja den detaljerade fliken och välja specifika värden och volym på dropdown-menyn. För att hämta totalt volymvärde gå till den detaljerade fliken och välj medelvärden.Detta protokoll användes för att transplantera icke märkta mänskliga holmar i den inre kammaren i ögat av åtta veckor gamla kvinnliga röda fluorescerande mottagare möss. Interaktiv bildhanteringsprogram användes sedan för att extrahera kvantitativa data från bilderna. In vivo fluorescens imaging, den mänskliga holme ympkvistar äventyrades av betydande störningar från vävnad autofluorescens som inte observerades i möss holme ympkvistar.För att förbättra signalen till brusförhållandet subtraherades autofluorescenskanalen. Sedan så definierades holmegränsen som kallas holmemask och motsvarande kanaler manuellt. Slutligen användes segmentering av tomatsignalen i ögonlocken vasculature och ögonlockskapsel och slutlig ytrendering för att extrahera kvantitativa data.Här som en representativ longitudinell bildbehandling session av samma mänskliga holme moderplantor på två veckor, två månader, fem månader och åtta månader efter transplantation. MIP-bilder av ursprungligen inspelade rådata, bearbetade bilder efter holme autofluorescens borttagning och en segmenterad holme objekt visas. När du utför ögonlocksinjektionen, se till att förladda holmarna i en liten volym och använd flexibla tvillingljusarmar på ditt stereomikroskop, för att markera ögonkammarutrymmet för att framgångsrikt injicera holmarna i ACE.Efter in vivo imaging ögonen kan fastställas och ytterligare undersökas för antikropp färgning och konventionella histologi. Denna teknik är mycket användbar för funktionella studier av enskilda mänskliga holmar i realtid och under fysiologiska förhållanden, särskilt i samband med vaskularisering, livskraft och metaboliska studier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal Injektion av genterapivektorer och stamceller i musen ögat

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation in i den främre ögonkammaren för längsgående, icke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med encelliga Upplösning i realtid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolering, kultur, och avbildning av Human Fetal Pankreas cell kluster

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optisk avbildning av hjärntumörer och Artrit med fluorescerande SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Musmodell av typ 2-diabetes: Pancreatic Islet Isolering och Live-cell 2-Photon Imaging av intakt cellöar

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo Imaging och spårning av teknetium-99m märkt benmärg mesenkymala stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

longitudinell<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Cerebrovasculature Relevans till CNS-sjukdomar

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: Ett verktyg för att mäta bukspottskörteln Islet mikrovaskulära Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...