Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, Stratejik Araştırma Alanı Exodiab, Dnr 2009-1039, İsveç Stratejik Araştırma Vakfı Dnr IRC15-0067 tarafından LUDC-IRC, Lund, Diabetesförbundet ve Barnförbundet'teki Kraliyet Fizyografik Derneği tarafından desteklenmiştir.

İsveç'in Lund kentinde bulunan Bölgesel Etik Komitesi, Çalışmayı, İnsanlarla İlgili Araştırmaların Etik İncelemesini Içeren Yasa'ya göre onayladı. Hayvan deneyleri İsveç hayvan deneyleri etiğine uygun olarak yapıldı ve Malmö ve Lund etik komiteleri tarafından onaylandı. 6 ila 8 haftalık immünoeksik NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-domates. Rag2-/-) alıcı fareler insan adacıklarının naklinde alıcı ol...

<ol>
	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

Bir yöntem alıcı ve donör doku tutulumu gözlemleyerek insan pankreas adacık hücre greftleme süreci çalışma sunulmaktadır. İnsan adacıklarını immünofif fare gözünün ön odasına yerleştiren minimal invaziv bir ameliyattan sonra fare ameliyattan birkaç dakika sonra hızla iyileşir. İşlem tek göze yapılır. Genellikle, 5-7 gün postimplantasyon itibaren kornea yeterince intravital görüntüleme yapmak için iyileşmiş.
Bu protokolde insan adacık greftlerinin kalitesi...

Diabetes mellitus, kan şekerinin yükselmesi ile karakterize bir grup metabolik hastalığı pankreas adacık beta hücrelerinin kaybı veya disfonksiyonundan kaynaklanan yetersiz insülin üretiminin sonuçları olarak tanımlar, genellikle insülin direnci ile birlikte. Tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) beta hücrelerinin ilerleyici disfonksiyonunun hastalık gelişimine neden olduğu karmaşık hastalıklardır. T1D beta hücrelerine otoimmün bir saldırı ile çökelti, T2D metabolik faktörler tarafından tahrik olarak kabul edilir ken, düşük dereceli sistemik inflamasyon artan kanıtlarla da olsa1. Özellikle T1D hastalarına donör insan adacıklarının nakli fizyolojik glisemik kontrol sağlama potansiyeli sunar. Ancak, doku donörleri ve kötü adacık engraftment bir sıkıntısı bir ana tedavi seçeneği haline adacık nakli engelledi. Fonksiyonel adacık greftinin önemli bir kısmı hipoksik, inflamatuar, immünojenik konakortamı2,3nedeniyle hemen posttransplantasyon sonrası dönemde (24-48 saat) kaybolur. Adacık sağkalımının iyileştirilmesi için müdahale yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek için bu tür transplantasyonların sürekli izlenmesi gerekmektedir.
Transplantasyon sonrası nakledilen insan pankreas adacıklarının kaderini görüntülemek ve izlemek için in vivo teknikleri hala diyabet araştırma4,,5için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir . Bugüne kadar pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason (US) dahil olmak üzere noninvaziv görüntüleme teknikleri, deneysel koşullarda nakledilen adacıkların nicelve fonksiyonel değerlendirilmesi için potansiyel göstermektedir5. Ancak, küçük adacık boyutları göz önüne alındığında, bu yöntemlere göre nicel ölçümler yetersiz çözünürlük muzdarip. Gözlem için bir transplantasyon sitesi olarak gözün ön odası (ACE) uzun süreler boyunca etkili bir şekilde daha yüksek mekansal çözünürlük ve sık izleme sunan umut verici bir noninvaziv görüntüleme çözümüdür6. Bu yöntem başarıyla fare adacık biyolojisi (Yang ve ark.7gözden), otoimmün immün yanıtlar8,yanı sıra insan adacık aşılama9,10çalışma için istismar edilmiştir.
Burada ACE transplantasyon yöntemi, transplantasyondan sonra 10 aya kadar bireysel adacık greftleri üzerinde sürekli ve tekrarlanan kayıtlar la insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamiklerini araştırmak için 2-foton görüntüleme yaklaşımı ile birleştirilir. Daha fazla görüntüleme derinliği ve azaltılmış genel fotobeyaztma ve foto hasarı multifoton görüntüleme özellikleri konfokal mikroskopi11görüntüleme sınırlamaları aşmak . Floresan görüntülemenin nicelleştirilmesi, adacık numune hazırlama, adacık nakli, görüntü edinimi, adacık gürültüsünü veya arka planı kaldırmak için görüntü filtreleme, segmentasyon, sayısallaştırma ve veri analizi dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir. En zorlu adım genellikle bir görüntüyü birden çok parçaya veya bölgeye bölmek veya bölmektir. Bu, sinyali arka plan gürültüsünden ayırmayı veya örneğin adacık vaskülature'u temsil eden bir 3B birimin voksellerini algılamak ve etiketlemek için renk veya şekil benzerliklerine dayalı voxels bölgelerini ayırmayı içerebilir. Bölümlere çıkarıldıktan sonra, nesne hacmi boyutları gibi istatistiklerin ayıklanması genellikle kolaydır. Sağlanan segmentasyon ve veri görselleştirme gibi görüntüleme verilerinin sayısallaştırılması ve ayıklanması için bir yöntemdir. Özellikle dikkat insan adacıkları otofloresan ve adacık vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan arasındaki ayrım kaldırılması için ödenir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

Beta hücrelerinin görüntülenmesi adacık transplantasyonuna yönelik önemli bir adımdır. Beta hücre biyolojisinin kaydı için farklı görüntüleme platformları geliştirilmiş ve in vivokullanılmıştır, tek hücre çözünürlüğü ve sürekli uzunlamasına kayıtlara izin verme açısından sınırlıdır. Korneanın saydamlığı nedeniyle, farelerde gözün ön odası (ACE) iyi insan ve fare pankreas adacık hücre biyolojisi çalışmak için uygundur. Burada bu yaklaşımın aşılama ve bireysel insan adacık greftlerinin revaskülarizasyon sürekli uzunlamasına kayıtları gerçekleştirmek için nasıl kullanılabileceğinibir açıklamasıdır. İnsan adacık greftleri ACE içine yerleştirilir, NOD kullanılarak. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-alıcı olarak fareler. Bu, alıcıya karşı donör hücrelerin genişlemesinin araştırılmasına ve alıcı hücrelerin greftin kapsüllenmesi ve vaskülarizasyonunu teşvik etmedeki katkısına olanak sağlar. Ayrıca, görüntü analizi ve adacık hacmi veya parçalı vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan nicelik için adım adım bir yaklaşım özetlenmiştir.

Etiketsiz insan adacıkları 8 haftalık dişi NOD ACE'ye nakledildi. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-domates. Rag2−/−) alıcı fareler. İnsan dokusunun reddini önlemek için, immün eksik Rag2 nakavt fareler alıcı olarak seçildi. Bu transgenik farelerde, tüm hücre ve dokular alıcı ve donör doku net bir kimlik sağlayan bir membran hedefli domates floresan protein (mT) ifade. Adacık greftlerinin yüksek çözünürlüklü...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.

Anterior Göz Odasında İnsan Pankreas Adacık Greftleme ve Katkıda Bulunan Konak Hücrelerinin Vivo Görüntüleme ve Nicelleştirmesinde Boylamsal

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE en uygun görüntüleme manzaralarıdır. Bir aşılama durumunda işlevlerini ve canlılığını incelemek için adacık hücrelerinin in vivo görüntülemesinde uzun süreli olarak tekrarlamayı destekler. Aynı zamanda gerçek zamanlı olarak fizyolojik ve patolojik koşullar altında diğer yönlerini incelemek için uzatılabilir.ACE tekniğinin avantajı aynı bireysel insan pankreas adacıkları uzun bir süre için alt hücresel çözünürlük ile noninvaziv takip edilebilir aslında yatıyor. Beta hücre replasman tedavisinin başarı oranları artmaya devam etmektedir. Ancak, adacık greftleme ve in vivo hayatta kalma verimliliğini değerlendirmek, hala zor olmaya devam etmektedir.Bu yöntem adacık transplantasyonlarının sonuçlarının değerlendirilmesine ve optimize edilebilebilir. Bu yaklaşım sadece pankreas adacıkları ile sınırlı değildir. Ayrıca etkilenen dokuları incelemek için de uygundur.Örneğin, diyabetik komplikasyonlar, böbrek glomeruli veya karaciğer parçaları gibi, sadece birkaç isim. Başlamak için fareyi sıcak bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve burun maskesini takın. Başparmağı ve işaret parmağını kullanarak başı hafifçe kaldırın.Yanlarında metalik parçalar ile sabitle. Kulak parçalarının başın doğrudan kulakların altından düzeltdiğinden emin olmak. Subkutan farenin arkasına buprenorfin çözeltisi enjekte edin.Künt forceps kullanılarak nakledilecek gözün göz kapaklarını hafifçe geri çekin. Göz dışarı pop ve gevşek bir polietilen tüp ile kaplı cımbız bir çift ile düzeltmek. Göz kapaklarını PBS içeren bir Petri kabına aktardıktan sonra, göz kannularında yaklaşık 20-30 adacık toplayın.Yukarı doğru 25 gauge iğne seviyesi kullanarak, dikkatle kornea içine ucu takın ve tek bir yanal kesi yapmak. Adacıklarla önceden yüklenmiş kanülle korneayı dikkatlice kaldırın ve adacıkları yavaşça göze bırakın. Yavaş yavaş kanül geri çekmek ve göze göz jeli uygulayın.10 dakika sonra, göz kapağını tutarak ve gözü normal konumuna geri koyarak, forcep'leri çıkarın. İki foton mikroskoplu implante edilmiş insan adacıklarının görüntülenmesi için, baş tutucu platformu mikroskop altına yerleştirin ve kornea ile lens arasında bir daldırma sıvısı olarak göz jelini göze uygulayın. Gözü hedefin altına yerleştirin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi implante edilmiş insan adacıklarını görüntüleyin.Otomatik floresan'ı kaldırmak için görüntü işleme sekmesine gidin, kanal aritmetiklerini seçin ve kanal 1 eksi kanal iki yazın. Bu yeni bir kanal dört oluşturur. Adını vaskülatür olarak yeniden adlandır.Bu işlemi tekrarlayın ve yeni bir kanal beş oluşturmak ve tüm domates yeniden adlandırmak için kanal üç eksi kanal iki yazın. Adacık'ı tanımlamak için el ile yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda el ile edin'i seçin. İşaretçiyi seçme modunda ve 3B görünümde tutun.Bölümleri görselleştirmek için ses seviyesini tıklatın. Çizim sekmesinde kontur seçin ve dilim konumu bir başlayarak, adacık kenarlığı etrafında konturları çizmeye başlamak için çiz'i tıklatın. Ardından yeni bir dilim konumuna geçin ve çizim hatlarını tekrarlayın.Adacık üstündeki son dilimle bitirin ve yüzey oluştur sekmesini tıklatarak sona erdirin. Sonraki segment, adacık vaskülatür ve adacık domates floresan kullanarak adacık maskesi. Önceden tanımlanmış adacık maskesi nesnesini seçin, düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açan tüm maske sekmesini tıklatın.Kanal seçimi açılır menüsündeki vaskülature kanalını seçin ve maskeyi uygulamadan önce seçenekleri yinelenen kanalı etkinleştirin. Sabit içinde, dışında ve yeni bir kanal altı oluşturur 0.000 dış voxels ayarlayın. Bu kanal adacık vasculature yeniden adlandırın.Önceki adımları tekrarlayın ve yeni kanal oluşturmak için, yeni kanal oluşturmak için, yeniden adlandırmak, adacık domates, kanal seçimi açılır menüsünde tüm domates seçin. Ardından sahne menüsünde yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda otomatik oluşturmayı seçin. Kaynak kanalı önceden oluşturulmuş adacık vaskülatürüne ayarlayın ve arka plan çıkarma nızı seçin.İsteğe bağlı olarak filtreler kullanın. Örneğin, ses düzeyini seçin ve seçili hizmet nesnelerini kaldırabilen penceredeki filtreyi ayarlayın. Sihirbazı bitirin ve yeni yüzey nesnesi, adacık vaskülature adını.Adacık vaskülature hizmet nesnesi düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açar maske tüm sekmesini tıklatın. Kanal seçimi açılır menüsündeki adacık domates kanalını seçin ve yeni bir kanal oluşturan 10.000'e kadar dıştaki voxel'leri ayarlayın. Bu kanal adacık domates vasculature yeniden adlandırın.Domates kapsülü floresan sinyalini segmente etmek için görüntü işleme sekmesinde kanal aritmetiklerini seçin ve kanal yedi eksi kanal sekiz yeni kanalı oluşturarak yazın. Domates kapsülü olarak adlandır. Daha önce açıklandığı gibi yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbaz kaynak kanalları, adacık domates vaskülatür veya domates kapsül seçin.Sonra arka plan çıkarma gerçekleştirin. Adacık geri dağılım dosyasını açın ve yeni bir yüzey oluşturun. Sihirbazda, otomatik oluşturmayı seçin ve ilgi çekici bölge tanımlayın.Gerekirse, mutlak yoğunlukta eşiği ayarlayın. Yüzey nesnesi, ilgili kanal yoğunluğuyla çapraz kontrol yapmak için tıklanabilir veya kapatılabilir. Bittiğinde sihirbazı kapatın.Son olarak, nicelik lendirme gerçekleştirin, sahne menüsünde oluşturulmuş bir yüzey nesnesi seçin ve istatistik sekmesine gidin. Ayrıntılı birim verilerini almak için ayrıntılı sekmeyi seçin ve açılır menüden belirli değerleri ve birimi seçin. Toplam birim değerini almak için ayrıntılı sekmeye gidin ve ortalama değerleri seçin.Bu protokol, sekiz haftalık dişi kırmızı floresan alıcı farelerin göz iç odasına etiketli olmayan insan adacıkları nakli için kullanılmıştır. İnteraktif görüntüleme yazılımı daha sonra görüntülerden nicel verileri ayıklamak için kullanılmıştır. Vivo floresan görüntülemede, insan adacık greftleri, fare adacık greftlerinde gözlenmeyen doku otofloresanının önemli bir müdahalesi ile tehlikeye atıldı.Sinyalin gürültü oranını artırmak için, otofloresans kanalı çıkarıldı. Daha sonra adacık maskesi adı verilen adacık sınırı ve ilgili kanallar el ile tanımlandı. Son olarak, domates sinyalinin göz kapağı vaskülatürü ve göz kapağı kapsülüne segmentasyonu ve son yüzey işleme sayısal verileri ayıklamak için kullanılmıştır.Burada iki hafta, iki ay, beş ay ve sekiz ay sonrası transplantasyon da aynı insan adacık greft temsili uzunlamasına görüntüleme oturumu olarak. Başlangıçta kaydedilen ham verilerin MIP görüntüleri, adacık otofloresan kaldırma ve segmentli adacık nesneleri sonra işlenmiş görüntüler gösterilir. Göz kapağı enjeksiyonunu yaparken, adacıkları ACE'ye başarılı bir şekilde enjekte etmek için göz haznesini vurgulamak için adacıkları küçük hacimli olarak önceden yüklediğinizden ve stereo mikroskobunuzda esnek ikiz ışık kollarını kullandığınızdan emin olun.İn vivo görüntülemeden sonra gözler antikor boyama ve konvansiyonel histoloji açısından düzeltilebilir ve daha fazla araştırılabilir. Bu teknik, özellikle vaskülarizasyon, canlılık ve metabolik çalışmalar bağlamında, gerçek zamanlı ve fizyolojik koşullar altında bireysel insan adacıklarının fonksiyonel çalışmaları için çok yararlıdır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Boyuna, Non-invaziv için Eye Ön Kamara içine Nakli<em&gt; In vivo</emGerçek zamanlı Tek hücreli Çözünürlük&gt; Görüntüleme

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Atçılık tendinopatisinde Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli Teknesyum- 99m Vivo Görüntüleme ve Takip

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

uzunlamasına<em&gt; İn Vivo</em&gt; Cerebrovasculature Görüntüleme: MSS Hastalıkları uygunluk

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Lazer Doppler: pankreas adacık mikrovasküler Vasomotion Vivo içinde ölçüm için bir araç

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...