Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم منحة MCB-1715317.

1. جعل خلية تدفق
<ol><li>غسل الأغطية<ol>
<li>مكان يغطي في تلطيخ الجرار و sonicate مع الإيثانول (EtOH)، ثم مع 1 M KOH (لمدة 30 دقيقة لكل من). لتجنب هطول الأمطار كوه في EtOH، شطف جيدا مع ddH2س بين يغسل.</li>
		<li>كرر كل من EtOH وOH غسل الخطوات 1x لمجموع عدد من أربعة يغسل (اثنين EtOH واثنين من KOH). تخزين أغطية نظيفة في ddH2</su...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

ويمكن استخدام البروتوكول لقياس حركية أي نظام SSDC، شريطة أن يتم ملاحظة فصل الخيوط أثناء التجربة. يتأثر الكشف عن الانقسام من خلال مراقبة انفصال الخرز المربوط ، وبالتالي يمثل لحظة انفصال حبلا. تحدث كافة الخطوات السابقة قبل الكشف عن الانقسام; وهكذا، يتم تسجيل وقت العبور الإجمالي فقط.
<p class="jov...

إن شق الحمض النووي الخاص بالموقع (SSDC) هو خطوة رئيسية في العديد من المعاملات الجينومية. على سبيل المثال، تحمي أنظمة التقييد البكتيرية -التعديل (RM)1 و CRISPR2 الخلايا من الهجوم بواسطة phages و plasmids من خلال التعرف على الحمض النووي الأجنبي وشقه في تسلسلات محددة. في النوع الثاني RM، تقييد endonucleases (REs) التعرف على قصيرة 4-8 قاعدة الزوج (bp) تسلسلات عبر البروتين النووي التفاعلات حمض3. ترتبطوريس المرتبطة بـ CRISPR، مثل Cas9، بالمواقع عبر تهجين الموقع المستهدف مع ربط crRNAs إلى endonucleases4. إنشاء موقع محدد فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DSBs) هي أيضا الخطوة الأولى في العديد من أحداث إعادة التهيئة DNA5. على سبيل المثال، يتطلب تنوع مناطق ربط المستضدات التي أنشأها إعادة التركيب V(D)J الاعتراف وشق مواقع مستهدفة محددة6. ومن المعروف أن بعض transposons لاستهداف تسلسلات الحمض النووي محددة, وكذلك7. ليس من المستغرب أن العديد من النوى الخاصة بالموقع التي تشارك في هذه العمليات ، مثل Cas9 ، هي مكون رئيسي لتقنيات تحرير الجينات8. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا تصميم رواية endonucleases موقع محدد (أي، زنك النيوكلاليس إصبع9 و تالنس10)كما تم تصميمها لتحرير الجينوم.
وقد استخدمت العديد من الأساليب لقياس حركة شق الموقع المحدد للأحماض النووية. وتشمل هذه التحليل هلام، fluorescence11،12، والتسلسل على أساس الأساليب13. وقد تحقق تقدم كبير مع ربط الميكروبات ، والذي يسمح DSBs في جزيئات واحدة من الحمض النووي ليتم الكشف عنها من قبل حركة حبة بعد فصل حبلا. في هذه الأساليب، يتم استخدام أنواع مختلفة من القوات لضمان فصل حبلا والحركة من الخرزة ما بعد الانقسام. في حالة واحدة، وقد استخدمت الفخاخ البصرية لقياس الانقسام من الحمض النووي من قبل EcoRV14. في هذه التجارب، البحث الهدف هو الهدف من التحقيق، مع الشروط الأمثل بحيث ربط موقع معين هو معدل الحد من الخطوة. عيب واحد من الفخاخ البصرية هو أنه يمكن ملاحظة الحمض النووي واحد فقط في وقت واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تطبيق قوة سحب كبيرة دورية لاختبار فصل حبلا.
تقنية أخرى يستخدم مزيج من تدفق وضعف القوى المغناطيسية لسحب على حبة بطريقة مستمرة15. وبهذه الطريقة، يتم قياس الانقسام الانتشار المحدود بواسطة NdeI. وتسمح الطريقة المستخدمة بالقياس المتزامن لعدة مئات من السنوات من النايـزات DNN في آن واحد، مما يتيح تحقيق الأهمية الإحصائية في تجربة واحدة. كما استخدمت التجارب القائمة على ملاقط مغناطيسية. في إحدى هذه الدراسات، تمت دراسة إنتيجراس فيروسي من خلال تضمين DSB في أوليجونوكليوتيد16. نتج عن الاندماج الناجح دمج DSB في الحمض النووي المربوط وفقدان الخرزة المرفقة. وفي دراسة مماثلة للنوع الثالث المعتمد على ATP للاندليس Endonuclease EcoPI، لوحظ عشرات من DN أنياب في تجربة واحدة17. ملاقط المغناطيسي عقد ميزة أن التوتر، فضلا عن حلقات الحمض النووي، يمكن السيطرة عليها ورصدها أثناء التفاعل.
تظهر هنا طريقة جزيء واحد متوازي للغاية لقياس حركية SSDC ، والتي تستفيد من التحسينات الحديثة في الربط على نطاق واسع من DN. هذا الأسلوب هو تحسين وتمديد الطرق السابقة المستخدمة لقياس النسخ المتماثل الحمض النووي18، طول كفاف من الحمض النووي19، والانقسام بواسطة REs15. في هذه التقنية، يتم إعداد DNAs الخطية التي تحتوي على نسخة واحدة من تسلسل التعرف مع البيوتين في نهاية واحدة وdidoxigenin في الطرف الآخر. يربط البيوتين streptavidin ، الذي يرتبط بشكل مُت بارادييدي شبه مُجَاَنِي. يتم حقن مجمعات حبة الحمض النووي في قناة microfluidic التي تم وظيفية مع شظايا مضادة للحفرية. ثم الحبال الحمض النووي إلى نقاط مرفق السطح عن طريق ربط digoxigenin لشظايا القوات المسلحة البوروندية الممزتزة. القوى المغناطيسية ضعيفة تطبيقها مع المغناطيس الدائم الحفاظ على حبة من التمسك غير على وجه التحديد إلى السطح. يمكن حقن العينات بسرعة (< 30 s) في قناة التدفق لتنشيط تفاعل الانقسام. يتم إيقاف تشغيل التدفق أثناء تجميع البيانات. كما هو مشقوق كل الحمض النووي، يمكن تحديد الوقت الدقيق للشق عن طريق تسجيل الإطار الذي يتحرك الخرز صعودا وخارج خطة التنسيق من الهدف، وبالتالي تختفي من سجل الفيديو. ويمكن استخدام عدد الإطارات حسب الإطارات من الخرز المتبقية لقياس التقدم في التفاعل.
ويرد أدناه البروتوكول الكامل وكذلك البيانات التي تم جمعها باستخدام NdeI. وكمثال على كيفية تطبيق هذه التقنية، يتم قياس معدلات الانقسام لمجموعة من تركيزات البروتين في تركيزين مختلفين من المغنيسيوم، وهو عامل مساعد معدني أساسي. على الرغم من أن هذا التطبيق للبروتوكول يستخدم NdeI، يمكن تكييف الأسلوب للاستخدام مع أي نواة خاصة بالموقع عن طريق تغيير تصميم الركيزة الحمض النووي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

إن شق الحمض النووي الخاص بالموقع (SSDC) هو خطوة رئيسية في العديد من العمليات الخلوية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتحرير الجينات. يصف هذا العمل اختبارًا حركيًا قادرًا على قياس SSDC في العديد من جزيئات الحمض النووي الفردية في وقت واحد. يتم إعداد DSNrate الركيزة المربوطة، وتحتوي كل منها على نسخة واحدة من التسلسل المستهدف، في قناة تدفق ميكروفلويديك. المغناطيس الخارجي ينطبق قوة ضعيفة على الخرز paramagnetic. يمكن مراقبة سلامة ما يصل إلى 1000 DNAs الفردية من خلال تصور الميكروبات تحت التصوير darkfield باستخدام حقل واسع ، هدف التكبير المنخفض. حقن endonuclease تقييد، NdeI، يبدأ رد فعل الانقسام. يستخدم المجهر الفيديو لتسجيل اللحظة الدقيقة لكل انشقاق الحمض النووي من خلال مراقبة الإطار الذي يتحرك فيه الخرزة المرتبطة لأعلى وخارج المستوى البؤري للهدف. يحدد عد حبة الإطار حسب الإطار مقدار التفاعل، ويحدد الاحتواء الأسي معدل التفاعل. هذه الطريقة تسمح بجمع البيانات الكمية والناحصة إحصائيا على جزيء واحد SSDC التفاعلات في تجربة واحدة.

باستخدام هذه التقنية، تم قياس معدلات SSDC من NdeI لمجموعة من تركيزات البروتين (0.25-4.00 U/mL) في تركيزين مختلفين من المغنيسيوم (2 mM و 4 mM). وقد تكرر كل من هذه الشروط مرتين على الأقل، مع بضع مئات إلى 1000 DNAs مربوطة لكل تجربة. ويصف الشكل 2 التصميم التجريبي. ويبين الشكل 3 أمثلة ...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

ويرد وصف لطريقة متوازية للغاية لقياس الانقسام الموقع محددة من الحمض النووي في مستوى جزيء واحد. يوضح هذا البروتوكول الأسلوب باستخدام NdeI قيد endonuclease. يمكن بسهولة تعديل هذه الطريقة لدراسة أي عملية تؤدي إلى شق الحمض النووي في الموقع.

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي عملية تؤدي إلى فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، وتسفر عن بيانات كمية مفصلة عن الحركية. على الرغم من أن هذه الطريقة لديها قرار جزيء واحد، فإنه يقيس ما يصل إلى 1000 DNAs في تجربة واحدة، وبالتالي توفير إحصاءات جيدة. والتطبيق الأساسي لهذه الطريقة هو دراسة الآليات التي تنطوي عليها عملية ربط الحمض النووي وتعديله.على سبيل المثال، نحن مهتمون بدراسة البحث عن هدف الحمض النووي، وهو أمر ذو صلة بجميع بروتينات الحمض النووي الملزمة. عند محاولة هذه التقنية للمرة الأولى، تذكر أن الحبال جزيء واحد حساسة، وشكل مرة واحدة، يجب التعامل معها بعناية. نسبة مناسبة من الأسطح الوظيفية أمر ضروري.هناك بعض الحيل لجعل تدفق ذلك. بالإضافة إلى تبديل أنابيب العينات أثناء جمع البيانات، يمكن أن يساعد العرض التوضيحي المرئي شخصًا جديدًا في هذا الإجراء. لغسل زلات الغطاء، ووضعها في تلطيخ الجرار و sonicate لهم مع الإيثانول لمدة 30 دقيقة.شطف بدقة لهم مع المياه المقطّعة والمقطّعة، ثم تزج بها في هيدروكسيد البوتاسيوم الولي واحد و sonicate لهم لمدة 30 دقيقة أخرى. كرر تسلسل الغسيل، مع التأكد من شطف الغطاء بالماء بعد كل غسل. تخزين زلات الغطاء النظيف في الجرار تلطيخ بالماء.استخدام شفرة نظيفة لقطع ثمانية سنتيمتر طويلة تحميل والخروج أنابيب، وإدراجها في ثقوب في شريحة زجاجية نظيفة. الايبوكسي الأنابيب والسماح للعلاج لمدة خمس دقائق لتأمينه. تطبيق الشريط من جانبين قبل قص مع نمط القناة إلى الشرائح الزجاجية، وسلس بها مع ملقط من البلاستيك لتحقيق ختم جيد.قشر التراجع عن الشريط، وتطبيق زلة غطاء نظيفة، وتنعيم بها مع ملقط. ثم، الايبوكسي حافة زلة الغطاء لختم الخلية تدفق والسماح لها علاج. إعداد الحمض النووي المسمى للربط عن طريق إجراء PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات.ثم تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنظيف PCR. إعداد 10 ملليلتر من العازلة A، و degas في desiccator فراغ لمدة ساعة واحدة على الأقل. لوظيفية الخلية تدفق، حقن 25 ميكرولتردات من شظايا المضادة للحفر و fab في برنامج تلفزيوني، في قناة التدفق، وذلك باستخدام تلميح هلام تحميل لتناسب أنابيب PE60.احتضان خلية تدفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، سحب 0.5 ملليلتر من العازلة A من خلال قناة مع حقنة، مع الحرص على عدم إدخال الهواء في القناة. ثم، جبل الخلية تدفق على مجهر مقلوب.عقف أنبوب منفذ إلى مضخة حقنة، ووضع أنبوب مدخل في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير يحتوي على العازلة A.يدويا سحب ما لا يقل عن 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت أ لطرد النظام ورئيس المضخة. ثم اسمحوا مضخة تشغيل في 10 ميكروليتر في الدقيقة الواحدة لمدة خمس دقائق على الأقل لتكدير النظام. دوامة زجاجة الأسهم من الخرز، والماصات 1.6 ميكرولترات من الخرز في 50 ميكرولترات من العازلة A، ثم دوامة لهم مرة أخرى.ضع الخرز على فاصل مغناطيسي وماصة خارج المخزن المؤقت. إعادة تعليق لهم في 50 ميكروليتر من العازلة A ودوامة لهم. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة A لتركيز النهائي من 160 ميكروغرام لكل ملليلتر.إعداد 480 ميكرولترات من 0.5 picomolar المسمى الركيزة الحمض النووي في العازلة A، والماصات 20 ميكرولترات من تعليق حبة في الحمض النووي المخفف. ضع الخليط على دوار لمدة ثلاث دقائق. بعد الدقائق الثلاث، قم بتحميل العينة على الفور في القناة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة لمدة 15 دقيقة، أو حتى يتم ملاحظة ربط الخرز الكافي.غسل قناة جميع الخرز الحرة عن طريق تحويل أنبوب مدخل إلى أنبوب جديد من العازلة A، وتدفقها في 50 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة لمدة 10 دقيقة على الأقل أو حتى يتم ملاحظة أي حبات فضفاضة. ومن المفيد استخدام صمام مضمن لقطع التدفق وتبديل الأنابيب. التبديل أنابيب في حركة واحدة على نحو سلس وتأكد مستويات السائل في أنابيب عينة جديدة والقديمة المباراة لتجنب تدفق الظهر.قبل جمع البيانات، وإعداد التركيز الصحيح من انزيم الانقسام DNA، وإدراج أنبوب مدخل في العينة. خفض المغناطيس على الخلية تدفق. تعيين مضخة لحقن 80 ميكرولترات من العينة في 150 ميكرولتر في الدقيقة الواحدة والبدء في جمع البيانات.دقيقة واحدة في جمع البيانات، وتفعيل المضخة. يظهر هنا هو صورة تمثيلية من حبات المربوطة قبل وبعد رد الفعل. تم إجراء تحليل البيانات لتحديد عدد الخرز المتبقية المربوطة في جميع أنحاء تفاعل الانقسام.وقد استخدمت هذه التقنية لقياس الموقع محددة معدلات الانقسام الحمض النووي من Nde1 لتركيزات البروتين تتراوح بين 0.25 إلى أربع وحدات لكل ملليلتر، وتركيزين مختلفين من المغنيسيوم. تم تكرار كل حالة مرتين على الأقل ، مع عدد قليل من الحمض النووي المربوطة 100 إلى 1000 لكل تجربة. في تركيزات البروتين منخفضة بما فيه الكفاية، ومعدل يتناسب مع البروتين ومستقلة عن المغنيسيوم.بالنسبة لتركيزات البروتين العالية ، يعتمد المعدل على المغنيسيوم ، ولكن مستقل عن تركيز البروتين. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن فقاعات الهواء في قناة الأنابيب والتدفق يمكن أن تعمل على التجربة. تأكد من عدم السماح لأي هواء في الخطوط أثناء تبديل الأنابيب ، و degas جميع المخازن المؤقتة قبل استخدام.طريقة الربط يسمح للمرء لاستكشاف تأثير التوتر في الحمض النووي على رد الفعل. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تغيير قوة المغناطيس أو تطبيق تدفق أثناء جمع البيانات.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

مبادئ في مواقع محددة التكنولوجيا (SSR) Recombinase

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

أسرع وارتفاع القرار، وطن متري سنويا، GFP القائم على الفحص فيوجن الميتوكوندريا الحصول على بيانات حركية من خلايا متعددة في طريق موازية متحد البؤر المجهري

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...