Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
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这项工作得到了国家科学基金会资助MCB-1715317。

1. 制作流动细胞
<ol><li>清洗盖玻片<ol>
<li>将盖玻片放在染色罐中，用乙醇 （EtOH） 进行声波处理，然后用 1 M KOH（每个 30 分钟）。为避免在 EtOH 中出现 KOH 沉淀，在洗涤之间用 ddH2O 彻底冲洗。</li>
		<li>重复 EtOH 和 KOH 洗涤步骤 1x，总共洗涤四次（两次 EtOH 和两次 KOH）。将清洁的盖玻片存放在 ddH2O 中染色罐中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>使用干净的剃须刀切割装载和退出管（8 厘米长），?...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

该协议可用于测量任何SSDC系统的动力学，前提是在实验中观察到链分离。通过观察系绳珠的分离而影响裂解的检测，因此标志着链分离的瞬间。所有上述步骤都发生在检测到裂痕之前;因此，只记录总的运输时间。
流细胞盖玻片通过抗体蛋白对清洁玻璃的非特异性吸附功能化。清洁不足的玻璃可能会影响抗体的结合。在系绳中，珠子密度应足够低，以便珠子不相互作用。附件...

现场特异性DNA裂解（SSDC）是许多基因组交易中的关键步骤。例如，细菌限制修饰 （RM）1 和 CRISPR2 系统通过识别和切割特定序列中的异质核子，保护细胞免受噬菌体和质粒的攻击。在II型RM中，限制性内核糖核酸（ES）通过蛋白-核酸相互作用识别短4~8基对（bp）序列。CRISPR 相关的内端体（如 Cas9）通过将 crRNA 绑定到内端体4的目标站点杂交绑定到站点。建立站点特定的双搁浅断裂（DSB）也是许多DNA重组事件5的第一步。例如，V（D）J 重组创建的抗原结合区域的多样性要求识别和裂解特定目标位点 6。一些转子已知以特定的DNA序列为目标，以及7。毫不奇怪，这些过程中涉及的许多特定站点的核酸酶，如Cas9，是基因编辑技术8的关键组成部分。此外，还设计了新的现场特异性内分酶（即锌指核酶9 和塔伦NS10）来编辑基因组。
许多方法已被用于测量核酸的位点特异性裂解的动力学。其中包括凝胶分析、荧光11、12,12和基于测序的方法13。微珠的系绳取得了重大进展，它允许DNA单分子中的DSB在链分离后通过珠子的运动来检测。在这些方法中，使用不同类型的力来确保珠子的链分离和后裂隙的运动。在一个案例中，EcoRV 14已经用光学陷阱来测量DNA的裂解。在这些实验中，目标搜索是调查的目标，优化了条件，使特定于站点的绑定是速率限制步骤。光学陷阱的一个缺点是一次只能观察到一个DNA。此外，必须应用周期性大拉力来测试绞线分离。
另一种技术使用流动和弱磁力的组合，以连续的方式拉上珠子15。这样，通过 NdeI 测量扩散有限裂解。采用的方法允许同时测量几百个DNA，从而在单个实验中达到统计显著性。还使用了基于磁性钳子的实验。在一项此类研究中，通过在插入寡核苷酸16中加入DSB进行了研究逆转录病毒性整质。成功的集成导致DSB在系绳DNA中加入，并丢失所附珠子。在一项类似的研究ATP依赖III型限制内核糖酶EcoPI，在一个单一的实验17中观察到了数十个DNA。磁钳具有在反应过程中可以控制和监测张力以及DNA循环的优势。
这里介绍的是一种用于测量SSDC动力学的极平行单分子方法，它利用了最近DRNA大规模系绳的改进。这种方法是以往用于测量DNA复制18、DNA19的轮廓长度和由REs15进行裂解的方法的改进和扩展。在这项技术中，包含识别序列单一副本的线性DNA在一端用生物素和二恶合宁在另一端进行准备。生物素结合链球菌素，它与顺磁微珠共价附着。DNA珠复合物被注入一个微流体通道，该通道已经用抗二恶英FAB片段功能化。然后，DNA 将二恶由多宁与吸附的 FAB 片段结合，将附着到表面附着点。使用永磁体施加的弱磁力防止珠子非专门粘在表面。样品可快速注入流通道（<30 s），以激活裂解反应。在数据收集过程中，流已关闭。当每个DNA被切割时，可以通过记录珠子向上和移出目标焦点图的框架来确定裂解的确切时间，从而从视频记录中消失。剩余珠子的帧计数可用于量化反应进度。
下面介绍的是完整的协议以及使用 NdeI 收集的数据示例数据。作为如何应用该技术的一个例子，一系列蛋白质浓度的裂解率以镁的两种不同浓度（一种重要的金属辅助因子）进行测量。虽然该协议的这种应用使用NdeI，但该方法可以通过改变DNA基板设计，适用于任何场内特异性核酸酶。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

站点特异性DNA裂解（SSDC）是许多细胞过程中的关键步骤，对基因编辑至关重要。这项工作描述了一个动力学测定，能够同时测量许多单DNA分子中的SSDC。珠系基板DNA，每个包含目标序列的单个副本，在微流体流通道中准备。外部磁铁对顺磁珠施以弱力。使用宽场低放大镜目对暗场成像下的微珠进行可视化，可监控多达 1，000 个单个 DNA 的完整性。注射限制内核糖，NdeI，启动裂解反应。视频显微镜用于通过观察相关珠子在目标焦平面上移的帧来记录每个 DNA 裂解的确切时刻。帧按帧的珠数可量化反应，指数拟合确定反应速率。此方法允许在单个实验中收集单个分子 SSDC 反应的定量和具有统计显著性的数据。

利用这项技术，测量了两种不同浓度镁（2 mM 和 4 mM）的一系列蛋白质浓度（0.25~4.00 U/mL）的 NdeI SSDC 速率。每个条件至少复制两次，每个实验有几百到 1，000 个系绳 DNA。 图 2 描述了实验设计。 图 3 显示了数据收集和分析详细信息的示例。 图4 说明了该速率如何取决于两种镁浓度的蛋白质浓度。可以观察到，在足够低的蛋白质浓?...

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Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

介绍了一种在单个分子水平上测量DNA的位点特异性裂解高度平行的方法。该协议演示了使用限制内核糖 NdeI 的技术。该方法可以很容易地修改，以研究任何过程，导致现场特异性DNA裂解。

平行高通量单分子动力学测定，用于现场特异性DNA裂解

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

该协议可应用于任何导致双滞留DNA断裂的过程，产生关于动力学的详细定量数据。虽然该方法具有单分子分辨率，但一次实验中可测量多达1000个DNA，从而提供良好的统计。该方法的主要应用是研究DNA结合和修饰所涉及的机制。例如，我们有兴趣研究DNA靶点搜索，它对所有DNA结合蛋白相关。首次尝试这种技术时，请记住，单分子系绳是细腻的，一旦形成，必须小心处理。功能化表面的适当比例至关重要。有一些技巧，使流动如此。除了在数据收集期间切换样品管，可视化演示还可以帮助新了解此过程的人。要清洗盖滑，请将它们放在染色罐中，用乙醇对它们进行声波处理30分钟。用去离子和蒸馏水彻底冲洗，然后将它们浸入一个氢氧化钾中，再声化30分钟。重复洗涤顺序，确保每次洗涤后用水冲洗盖滑。将清洁过的盖板将用水存放在染色罐中。使用干净的剃须刀切割八厘米长的装载和出口管，并将其插入干净的玻璃滑梯中的孔中。环氧管，让固化五分钟，以确保它。将带通道图案的双面胶带预切到玻璃滑梯上，用塑料钳子将其平滑，以实现良好的密封。剥下胶带的背，并涂抹一个干净的盖滑，用钳子将其平滑。然后，环氧树脂的盖滑的边缘密封流动细胞，让它固化。根据手稿指示执行 PCR，准备标记的 DNA 进行系绳。然后使用 PCR 清理套件净化 PCR 产品。准备 10 毫升缓冲液 A，并在真空干燥器中除气至少一小时。为了使流动细胞功能化，在PBS中注入25微升的抗二恶英和晶圆厂碎片，使用凝胶加载尖端放入PE60管中。在室温下孵育流动细胞30分钟。孵育后，用注射器通过通道拉0.5毫升缓冲液，注意不要将空气引入通道。然后，将流动细胞放在倒置的显微镜上。将出口管连接到注射器泵上，将进气管放入含有缓冲液 A 的微型离心管中。手动拉取至少 0.5 毫升缓冲液 A 以冲洗系统并给泵提供压力。然后让泵以每分钟 10 微升的速度运行至少 5 分钟，以平衡系统。将储存的珠子瓶，和移液器1.6微升的珠子放入50微升的缓冲器 A，然后再次涡旋它们。将珠子放在磁性分离器上，移液器出缓冲液。将它们重新悬浮在缓冲器 A 的 50 微升中，并旋转它们。上次洗涤后，将珠子重新悬浮在100微升缓冲液 A中，最终浓度为每毫升160微克。在缓冲液 A 中准备 480 微升 0.5 个标有 2.5 皮摩尔的 DNA 基质，将珠悬浮液的移液器 20 微升放入稀释的 DNA 中。将混合物放在旋转器上三分钟。三分钟后，立即以每分钟 10 微升的流量将样品加载到通道中 15 分钟，或直到观察到足够的珠子系绳。通过将进气管切换到缓冲器 A 的新鲜管来清洗所有自由珠的通道，然后以每分钟 50 微升的速度将珠子流入至少 10 分钟，或直到没有观察到松动的珠子。使用内联阀来切断流量和切换管道也很有帮助。在一次平滑运动中切换油管，并确保新旧样品管中的液位匹配，以避免回流。在收集数据之前，准备DNA裂解酶的正确浓度，并将进气管插入样品中。将磁铁低于流动单元。将泵设置为每分钟 150 微升注入 80 微升样品并开始数据收集。一分钟后进行数据收集，激活泵。此处显示的是反应之前和之后系绳珠的代表性图像。数据分析用于量化在整个裂解反应中保持系绳的珠子数量。该技术用于测量每毫升0.25至4个单位的蛋白质浓度和两种不同浓度的镁的Nde1的位点特异性DNA裂解率。每个条件至少复制两次，每个实验都有100到1000个系绳DNA。在足够低的蛋白质浓度下，该速率与蛋白质成正比，与镁无关。对于高蛋白浓度，该速率取决于镁，但独立于蛋白质浓度。尝试此协议时，请记住，管道和流通道中的气泡可以运行实验。在切换油管时，请确保不允许任何空气进入管路，并在使用前将所有缓冲液除气。系绳方法允许探索DNA中张力对反应的影响。这可以通过改变磁体强度或在数据收集过程中应用流量来实现。

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