Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation tilskud MCB-1715317.

1. Sådan får du flowcellen
<ol><li>Vask af dækslæberne<ol>
<li>Placer coverslips i farvning krukker og sonikere med ethanol (EtOH), derefter med 1 M KOH (i 30 min hver). For at undgå KOH-udfældning i EtOH skylles grundigt med ddH2O mellem vaskene.</li>
		<li>Gentag både EtOH og KOH vaske trin 1x for et samlet antal af fire vasker (to EtOH og to KOH). Opbevar rensede dækslip i ddH2O i farvningsglas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skær læsse- og udgangsrør (8 cm lange) med en ren barbermaskine og...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Protokollen kan bruges til at måle kinetik i ethvert SSDC-system, forudsat at strengadskillelsen observeres under forsøget. Påvisning af spaltning påvirkes ved at observere løsrivelse af den tøjret perle og markerer derfor det øjeblik, hvor strengadskillelsen. Alle tidligere trin opstår før påvisning af spaltningen; Således registreres kun den samlede transittid.
Flowcellen coverslip er funktionaliseret via ikke-specifik adsorption af antistofprotein til det rene glas. Utilstrækkel...

Site-specifikke DNA spaltning (SSDC) er et vigtigt skridt i mange genomiske transaktioner. For eksempel beskytter bakteriel begrænsningsændring (RM)1- og CRISPR2-systemer celler mod angreb fra fager og plasmider ved at genkende og kløve fremmed DNA ved specifikke sekvenser. I type II RM genkender restriktionsendonukleaser (REs) korte 4-8 basisparsekvenser (bp) via protein-nukleinsyreinteraktioner3. CRISPR-associerede endonucleaser, såsom Cas9, binder sig til websteder via hybridisering af målwebstedet med crRNAs bundet til endonucleas4. Oprettelsen af stedsspecifikke dobbeltstrengede pauser (DSB'er) er også det første skridt i mange DNA-rekombinationshændelser5. F.eks. kræver mangfoldigheden af antigenbindingsregioner, der er oprettet ved hjælp af rekombination af V(D)J), anerkendelse og spaltning af specifikke målområder6. Nogle transposons er kendt for at målrette specifikke DNA-sekvenser, samt7. Ikke overraskende, mange site-specifikke nukleaser involveret i disse processer, såsom Cas9, er en vigtig komponent i genredigering teknologier8. Desuden er nye stedspecifikke endonucleaser (dvs. zinkfinger nukleaser9 og TALENS10) også blevet udviklet til at redigere genomer.
Mange metoder er blevet anvendt til at måle kinetik af stedsspecifikke spaltning af nukleinsyrer. Disse omfatter gelanalyse, fluorescens11,12og sekvenseringsbaserede metoder13. En stor fremgang blev opnået med tøjring af mikroperler, som gør det muligt DSBs i enkelte molekyler af DNA, der skal påvises ved bevægelse af en perle efter streng adskillelse. I disse metoder anvendes forskellige typer kræfter for at sikre strengadskillelse og bevægelse af perlen efter spaltningen. I et tilfælde er optiske fælder blevet brugt til at måle kavalergang af DNA ved EcoRV14. I disse eksperimenter er målsøgning formålet med undersøgelsen med betingelser, der er optimeret, så stedsspecifik binding er det hastighedsbegrænsende trin. En ulempe ved optiske fælder er, at kun en enkelt DNA kan observeres på et tidspunkt. Derudover skal der anvendes en periodisk stor trækkraft til at teste for strengadskillelsen.
En anden teknik bruger en kombination af flow og svage magnetiske kræfter til at trække på perle på en kontinuerlig måde15. På denne måde måles diffusion begrænset spaltning med NDEI. Den anvendte metode gør det muligt at foretage samtidig måling af flere hundrede DNA'er på én gang, hvilket giver mulighed for statistisk signifikans i et enkelt eksperiment. Der er også anvendt forsøg baseret på magnetiske pincet. I en sådan undersøgelse blev en retroviral integrase undersøgt ved at inkludere en DSB i indsættelsen oligonukleotid16. En vellykket integration resulterede i, at DSB blev indlemmret i det tøjlede DNA og tabet af den tilhørende perle. I en lignende undersøgelse af den ATP-afhængige type III-begrænsning endonuclease EcoPI blev der observeret snesevis af DNA'er i et enkelt eksperiment17. Magnetiske pincet har den fordel, at spændinger, samt DNA looping, kan kontrolleres og overvåges under reaktionen.
Præsenteret her er en meget parallel enkelt molekyle metode til måling af SSDC kinetik, som udnytter de seneste forbedringer i storstilet tøjring af DNAs. Denne metode er en forbedring og udvidelse af tidligere metoder , der anvendes til at måle DNA replikation18, konturlængden af DNA19og spaltning af REs15. I denne teknik fremstilles lineære DNA'er, der indeholder en enkelt kopi af genkendelsessekvensen, med biotin i den ene ende og digoxigenin i den anden. Den biotin binder streptavidin, som er kovalent knyttet til en paramagnetisk mikroperle. DNA-perlekomplekserne sprøjtes ind i en mikrofluidic kanal, der er blevet funktionaliseret med anti-digoxigenin FAB fragmenter. DNA'et binder derefter til overfladen vedhæftet fil punkter via binding af digoxigenin til adsorbed FAB fragmenter. Svage magnetiske kræfter påføres med en permanent magnet holde perle fra stikning ikke-specifikt til overfladen. Prøver kan hurtigt (<30 s) sprøjtes ind i flowkanalen for at aktivere spaltningsreaktionen. Flow er slået fra under dataindsamlingen. Da hvert DNA er kløvet, kan det nøjagtige tidspunkt for spaltning bestemmes ved at registrere den ramme, hvor iruden bevæger sig op og ud af målplanen for målet, og dermed forsvinder fra videooptagelsen. En frame-by-frame antal resterende perler kan bruges til at kvantificere reaktionfremdriften.
Præsenteret nedenfor er den komplette protokol samt eksempel data indsamlet ved hjælp af NDEI. Som et eksempel på, hvordan teknikken kan anvendes, måles spaltningshastigheden for en række proteinkoncentrationer ved to forskellige koncentrationer af magnesium, en essentiel metal cofaktor. Selv om denne anvendelse af protokollen bruger NDEI, kan metoden tilpasses til brug med enhver stedsspecifik nuklease ved at variere DNA-substratdesignet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Site-specifikke DNA spaltning (SSDC) er et vigtigt skridt i mange cellulære processer, og det er afgørende for genredigering. Dette arbejde beskriver en kinetisk analyse i stand til at måle SSDC i mange enkelt DNA-molekyler samtidigt. Perle-tøjret substrat DNAs, der hver indeholder en enkelt kopi af målsekvensen, fremstilles i en mikrofluidisk flowkanal. En ekstern magnet anvender en svag kraft til de paramagnetiske perler. Integriteten af op til 1.000 individuelle DNA'er kan overvåges ved at visualisere mikroperler under darkfield billeddannelse ved hjælp af et bredt felt, lav forstørrelse mål. Injektion af en begrænsning endonuclease, NDEI, initiere spaltning reaktion. Videomikroskopi bruges til at registrere det nøjagtige tidspunkt for hver DNA-spaltning ved at observere den ramme, hvor den tilknyttede perle bevæger sig op og ud af målets brændplan. Frame-by-frame perletælling kvantificerer reaktionen, og en eksponentiel pasform bestemmer reaktionshastigheden. Denne metode gør det muligt at indsamle kvantitative og statistisk signifikante data om enkeltmolekyleS SSDC-reaktioner i et enkelt eksperiment.

Ved hjælp af denne teknik blev SSDC-satserne for NDEI målt for en række proteinkoncentrationer (0,25-4,00 U/ml) ved to forskellige koncentrationer af magnesium (2 mM og 4 mM). Hver af disse betingelser blev gentaget mindst to gange, med et par hundrede til 1.000 tøjrede DNAs pr eksperiment. Figur 2 beskriver det eksperimentelle design. Figur 3 viser eksempler på oplysninger om dataindsamling og analyse. Figur 4 illustrerer, hvo...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

En meget parallel metode til måling af den stedspecifikke kavalergang af DNA på et enkelt molekyleniveau er beskrevet. Denne protokol demonstrerer teknikken ved hjælp af begrænsningen endonuclease NDEI. Metoden kan nemt ændres til at studere enhver proces, der resulterer i sted-specifikke DNA spaltning.

Parallel høj gennemløb enkelt molekyle kinetisk analyse for site-specifikke DNA spaltning

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Denne protokol kan anvendes på enhver proces, der resulterer i dobbeltstrengede DNA pauser, giver detaljerede kvantitative data om kinetik. Selv om denne metode har enkelt molekyle opløsning, det måler op til 1000 DNAs i et enkelt eksperiment, hvilket giver gode statistikker. Den primære anvendelse af denne metode er at undersøge de mekanismer, der er involveret i DNA-binding og modifikation.For eksempel er vi interesseret i at studere DNA-målsøgning, som er relevant for alle DNA-bindende proteiner. Når du forsøger denne teknik for første gang, skal du huske, at enkelt molekyle tøjler er sarte, og når form, skal håndteres med omhu. Korrekt andel af funktionaliserede overflader er afgørende.Der er et par tricks til at gøre strømmen så. Ud over at skifte prøverør under dataindsamlingen kan visuel demonstration hjælpe en person, der er ny på denne procedure. For at vaske dækslet glider, placere dem i farvning krukker og sonikere dem med ethanol i 30 minutter.Skyl dem grundigt med deioniseret og destilleret vand, og nedsænk dem derefter i en molar kaliumhydroxid og sonikere dem i 30 minutter mere. Gentag vaskesekvensen, og sørg for at skylle dækslet med vand efter hver vask. Opbevar det rensede dækselssedler i farvningsglas med vand.Brug en ren barbermaskine til at skære otte centimeter lange lastning og exit rør, og indsætte dem i huller i et rent glas dias. Epoxy slangen og lad helbrede i fem minutter for at sikre det. Påfør dobbeltsidet tape pre-cut med kanalen mønster til glasset dias, og glat det ud med plast kraftvæceser for at opnå en god forsegling.Skræl bagsiden af båndet, og anvende en ren dækning slip, udjævning det ud med snævler. Derefter epoxy kanten af dækslet slip at forsegle flow celle og lad det helbrede. Forbered det mærkede DNA til tøjring ved at udføre PCR i henhold til manuskriptanvisninger.Rens derefter PCR-produktet med et PCR-oprydningssæt. Forbered 10 milliliter buffer A, og afgas det i en vakuum ekssiccator i mindst en time. For at fungere flowcellen skal du indsprøjte 25 mikroliter anti-digoxigenin og fabfragmenter i PBS, ind i flowkanalen ved hjælp af en gellæssespids, der passer ind i PE60-slangen.Indkube flowcellen ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubationen trækkes 0,5 milliliter buffer A gennem kanalen med en sprøjte, idet der skal sikres, at der ikke indføres luft i kanalen. Derefter bjerg flowcellen på en omvendt mikroskop.Sæt udløbsrøret på en sprøjtepumpe, og sæt indsugningsrøret i et mikrocentrifugerør, der indeholder bufferen A.Træk manuelt mindst 0,5 milliliter buffer A for at skylle systemet og prime pumpen. Lad derefter pumpen køre ved 10 mikroliter i minuttet i mindst fem minutter for at bringe systemet i ligevægt. Vortex bestanden flaske perler, og pipette 1,6 mikroliter af perlerne i 50 mikroliter af buffer A, så vortex dem igen.Placer perlerne på en magnetisk separator og pipette ud bufferen. Re-suspendere dem i 50 mikroliter af buffer A og vortex dem. Efter den sidste vask suspenderes perlerne igen i 100 mikroliter buffer A for en endelig koncentration på 160 mikrogram pr. milliliter.Forbered 480 mikroliter af 0,5 picomolar mærket DNA substrat i buffer A, og pipette 20 mikroliter af perle suspension i fortyndet DNA. Anvend blandingen på en rotator i tre minutter. Efter de tre minutter indlæses prøven straks i kanalen med en strømningshastighed på 10 mikroliter pr. minut i 15 minutter, eller indtil der er observeret tilstrækkelig perlesting.Vask kanalen af alle frie perler ved at skifte indløbsrøret til et frisk rør af buffer A, og flyder det ind ved 50 mikroliter i minuttet i mindst 10 minutter, eller indtil ingen løse perler er observeret. Og det er nyttigt at bruge en inline ventil til at afskære flow og skifte slangen. Skift slange i en jævn bevægelse og sørg for flydende niveauer i nye og gamle prøverør match for at undgå tilbageløb.Før der indsamles data, forberedes den korrekte koncentration af DNA-spaltningsenzym, og indsugningsrøret indsættes i prøven. Sænk magneten over flowcellen. Indstil pumpen til at injicere 80 mikroliter af prøven på 150 mikroliter i minuttet og begynde dataindsamling.Et minut inde i dataindsamlingen skal du aktivere pumpen. Vist her er et repræsentativt billede af de tøjret perler før og efter reaktionen. Der blev udført dataanalyse for at kvantificere antallet af perler, der forbliver bundet i hele spaltningsreaktionen.Denne teknik blev anvendt til at måle de stedspecifikke DNA-spaltningshastigheder på NDE1 for proteinkoncentrationer fra 0,25 til fire enheder pr. milliliter og to forskellige koncentrationer af magnesium. Hver betingelse blev gentaget mindst to gange, med et par 100 til 1000 tøjret DNA er pr eksperiment. Ved tilstrækkeligt lave proteinkoncentrationer er hastigheden proportional med protein og uafhængig af magnesium.For høje proteinkoncentrationer er hastigheden afhængig af magnesium, men uafhængig af proteinkoncentrationen. Når du forsøger denne protokol, skal du huske, at luftbobler i slange- og flowkanalen kan køre eksperimentet. Sørg for ikke at lade luft ind i linjerne, mens du skifter slange, og degas alle buffere, før du bruger.Tøjringsmetoden gør det muligt at undersøge effekten af spændinger i DNA'et på reaktionen. Dette kan opnås ved at variere magnetstyrken eller anvende flow under dataindsamling.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

En hurtigere, høj opløsning, MTPA-GFP-baserede Mitokondriel Fusion Assay Erhvervelse Kinetiske data i flere celler i parallel anvendelse af konfokal mikroskopi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening for små-molekyle modulatorer af indadgående Ensretter kaliumkanaler

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Single-molekyle Imaging af genregulering<em&gt; In vivo</em&gt; Brug Cotranslational Aktivering ved spaltning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generering af høj kvalitet Chromatin Immunoprecipitation DNA Skabelon til High-throughput sekventering (Chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Ved at kombinere Single-molekyle manipulation og Imaging for Studiet af protein-DNA interaktioner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studere DNA Looping af Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...