Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie MCB-1715317.

1. Het maken van de stroomcel
<ol><li>Het wassen van de coverslips<ol>
<li>Plaats coverslips in kleurpotten en sonicaat met ethanol (EtOH), dan met 1 M KOH (voor 30 min elk). Om KOH-neerslag in EtOH te voorkomen, spoel je grondig af met ddH2O tussen wasbeurten.</li>
		<li>Herhaal zowel EtOH als de KOH wasstappen 1x voor een totaal aantal van vier wasbeurten (twee EtOH en twee KOH). Bewaar gereinigde coverslips in ddH2O in kleurpotten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Snijd laad- en uitgangsbuizen (8 cm lang...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Het protocol kan worden gebruikt om de kinetiek van een SSDC-systeem te meten, op voorwaarde dat de strengscheiding tijdens het experiment wordt waargenomen. De detectie van decolleté wordt beïnvloed door het observeren van het loskoppelen van de vastgebonden kraal en markeert daarom het moment van strengscheiding. Alle voorgaande stappen vinden plaats vóór de detectie van het decolleté; zo wordt alleen de totale transittijd geregistreerd.
De flow cell coverslip wordt gefunctionaliseerd v...

Site-specifieke DNA decolleté (SSDC) is een belangrijke stap in veel genomische transacties. Bijvoorbeeld, bacteriële beperking-modificatie (RM)1 en CRISPR2 systemen cellen te beschermen tegen aanvallen door fagen en plasmiden door het herkennen en klijmen van vreemd DNA op specifieke sequenties. In type II RM herkennen restrictie-endonucleases (REs) korte 4-8 basispaarsequenties (bp) via eiwit-nucleïnezuurinteracties3. CRISPR-geassocieerde endonucleases, zoals Cas9, binden zich aan sites via hybridisatie van de doelsite met crRNAs gebonden aan de endonucleases4. De creatie van site-specifieke double stranded breaks (DSB's) zijn ook de eerste stap in veel DNA-recombinatiegebeurtenissen5. De diversiteit van antigeenbindingsgebieden die door de recombinatie V(D)J worden gecreëerd, vereist bijvoorbeeld de erkenning en decolleté van specifieke doellocaties6. Sommige transposons zijn bekend om specifieke DNA-sequenties richten,evenals 7. Niet verrassend, veel site-specifieke nucleases die betrokken zijn bij deze processen, zoals Cas9, zijn een belangrijk onderdeel van genbewerkingstechnologieën8. Daarnaast zijn ook nieuwe site-specifieke endonucleases (d.w.z. zinkvinger nucleases9 en TALENS10)ontworpen om genomen te bewerken.
Veel methoden zijn gebruikt om de kinetiek van site-specifieke decolleté van nucleïnezuren te meten. Deze omvatten gelanalyse, fluorescentie11,12, en sequencing gebaseerde methoden13. Een belangrijke vooruitgang werd bereikt met de tethering van microbeads, waardoor DSB's in enkele moleculen van DNA kunnen worden gedetecteerd door de beweging van een kraal na de scheiding van de streng. Bij deze methoden worden verschillende soorten krachten gebruikt om strengscheiding en beweging van het kraal na decolleté te garanderen. In één geval zijn optische vallen gebruikt om het decolleté van DNA te meten door EcoRV14. In deze experimenten, doel zoeken is het doel van het onderzoek, met voorwaarden geoptimaliseerd, zodat site-specifieke binding is de tarief beperkende stap. Een nadeel van optische vallen is dat slechts een enkel DNA kan worden waargenomen op een moment. Daarnaast moet een periodieke grote trekkracht worden toegepast om te testen op de strengscheiding.
Een andere techniek maakt gebruik van een combinatie van stroom en zwakke magnetische krachten te trekken op de kraal op een continue manier15. Op deze manier wordt diffusie beperkt decolleté door NdeI gemeten. De gebruikte methode maakt het mogelijk om meerdere honderden NA's tegelijk te meten, waardoor statistische significantie in één experiment kan worden bereikt. Er zijn ook experimenten gebruikt op basis van magnetische pincetten. In een dergelijke studie werd een retrovirale integrase bestudeerd door een DSB op te nemen in de invoeging oligonucleotide16. Succesvolle integratie resulteerde in de integratie van DSB in het vastgebonden DNA en het verlies van de bijgevoegde kraal. In een soortgelijke studie naar de ATP-afhankelijke type III-beperking endonuclease EcoPI werden tientallen DNO's waargenomen in één experiment17. Magnetische pincet houden het voordeel dat spanning, evenals DNA-lus, kan worden gecontroleerd en gecontroleerd tijdens de reactie.
Hier gepresenteerd is een zeer parallelle single molecule methode voor het meten van SSDC kinetiek, die profiteert van recente verbeteringen in grootschalige tethering van DNAs. Deze methode is een verbetering en uitbreiding van eerdere methoden die worden gebruikt om DNA-replicatie18, contourlengte van DNA19en decolleté door REs15te meten . In deze techniek worden lineaire TINA's met één kopie van de herkenningssequentie bereid met biotine aan de ene kant en aan de andere kant. De biotine bindt streptavidin, die covalent is bevestigd aan een paramagnetische microbead. De DNA-kraalcomplexen worden geïnjecteerd in een microfluïdisch kanaal dat is gefunctionaliseerd met anti-digoxigenin FAB-fragmenten. Het DNA bindt vervolgens aan de oppervlaktebevestigingspunten via binding van de digoxigenine aan de adsorbeerde FAB-fragmenten. Zwakke magnetische krachten toegepast met een permanente magneet houden de kraal niet-specifiek aan het oppervlak. Monsters kunnen snel (<30 s) in het stroomkanaal worden geïnjecteerd om de decolletéreactie te activeren. Stroom wordt uitgeschakeld tijdens het verzamelen van gegevens. Aangezien elk DNA wordt gedes cleaved, kan de nauwkeurige tijd van decolleté door het kader registreren waarin de parel zich op en uit het brandpuntsplan van het doel beweegt, waardoor van de videoverslag verdwijnt. Een frame-voor-frame telling van de resterende kralen kan worden gebruikt om de reactievoortgang te kwantificeren.
Hieronder vindt u het volledige protocol en voorbeeldgegevens die met NdeI worden verzameld. Als voorbeeld van hoe de techniek kan worden toegepast, worden decolletésnelheden voor een reeks eiwitconcentraties gemeten in twee verschillende concentraties magnesium, een essentiële metaalcofactor. Hoewel deze toepassing van het protocol NdeI gebruikt, kan de methode worden aangepast voor gebruik met elke site-specifieke nuclease door het DNA-substraatontwerp te variëren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Site-specifieke DNA decolleté (SSDC) is een belangrijke stap in veel cellulaire processen, en het is cruciaal voor genbewerking. Dit werk beschrijft een kinetische test die SSDC in veel afzonderlijke DNA-moleculen tegelijk kan meten. Kraal-gebonden substraat JA's, elk met een enkele kopie van de doelsequentie, worden bereid in een microfluïdisch stroomkanaal. Een externe magneet past een zwakke kracht toe op de paramagnetische kralen. De integriteit van maximaal 1.000 individuele AV's kan worden gecontroleerd door de microbeads onder darkfield imaging te visualiseren met behulp van een breedveld, lage vergrotingsdoelstelling. Het injecteren van een beperking endonuclease, NdeI, initieert de decolletéreactie. Videomicroscopie wordt gebruikt om het exacte moment van elk DNA-decolleté vast te leggen door het frame te observeren waarin de bijbehorende kraal omhoog en uit het brandpuntsvlak van het doel beweegt. Frame-voor-frame kraal tellen kwantificeert de reactie, en een exponentiële pasvorm bepaalt de reactiesnelheid. Deze methode maakt het verzamelen van kwantitatieve en statistisch significante gegevens over single molecule SSDC reacties in een enkel experiment.

Met behulp van deze techniek werden de SSDC-percentages van NdeI gemeten voor een reeks eiwitconcentraties (0,25–4,00 U/mL) bij twee verschillende concentraties magnesium (2 mM en 4 mM). Elk van deze voorwaarden werd minstens tweemaal gerepliceerd, met een paar honderd tot 1.000 vastgebonden DNAs per experiment. Figuur 2 beschrijft het experimentele ontwerp. Figuur 3 toont voorbeelden van gegevensverzameling en analysedetails. Figuur 4</st...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Een zeer parallelle methode voor het meten van het site-specifieke decolleté van DNA op het niveau van één molecuul wordt beschreven. Dit protocol toont de techniek met behulp van de beperking endonuclease NdeI. De methode kan eenvoudig worden aangepast om elk proces dat resulteert in site-specifieke DNA-decolleté te bestuderen.

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Dit protocol kan worden toegepast op elk proces dat resulteert in dubbelstrengs DNA-pauzes, levert gedetailleerde kwantitatieve gegevens over kinetiek. Hoewel deze methode één molecuulresolutie heeft, meet het tot 1000 DNAs in één experiment, waardoor goede statistieken worden verstrekt. De primaire toepassing van deze methode is het bestuderen van de mechanismen die betrokken zijn bij DNA-binding en modificatie.We zijn bijvoorbeeld geïnteresseerd in het bestuderen van DNA-doelonderzoek, wat relevant is voor alle DNA-bindende eiwitten. Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, bedenk dan dat enkele molecuul tethers zijn delicaat, en eenmaal vorm, moet worden behandeld met zorg. Een juist aandeel van gefunctionaliseerde oppervlakken is essentieel.Er zijn een paar trucs voor het maken van de stroom zo. Naast het verwisselen van voorbeeldbuizen tijdens het verzamelen van gegevens, kan visuele demonstratie iemand helpen die nieuw is in deze procedure. Om de cover slips te wassen, leg ze in kleurpotten en sonicate ze met ethanol gedurende 30 minuten.Spoel ze grondig af met gedeïmiseerd en gedestilleerd water, dompel ze vervolgens onder in een molaire kaliumhydroxide en sonisch ze voor 30 minuten. Herhaal de wasvolgorde, zorg ervoor dat de cover slips spoelen met water na elke wasbeurt. Bewaar de schoongemaakte dekselglijden in kleurpotten met water.Gebruik een schoon scheermes om acht centimeter lange laad- en uitgangsbuizen te snijden en ze in gaten te steken in een schone glazen schuif. Epoxy de slang en laat genezen voor vijf minuten om het te beveiligen. Breng dubbelzijdige tape voorgesneden met het kanaal patroon op de glazen platen, en glad het uit met plastic tangen om een goede afdichting te bereiken.Pel de rug van de tape, en breng een schone cover slip, glad het uit met de tangen. Dan, epoxy de rand van de cover slip om de stroomcel te verzegelen en laat het genezen. Bereid het gelabelde DNA voor tethering door het uitvoeren van PCR volgens manuscript aanwijzingen.Zuiver vervolgens het PCR-product met een PCR-opruimkit. Bereid 10 milliliter buffer A, en ontgassen in een vacuüm desiccator voor ten minste een uur. Om de stroomcel te functionaliseren, injecteer u 25 microliters anti-digoxigenine en fab fragmenten in PBS, in het stroomkanaal, met behulp van een gel laadtip om in de PE60-slang te passen.De stroomcel 30 minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Trek na de incubatie 0,5 milliliter buffer A door het kanaal met een spuit, waarbij u ervoor zorgt dat er geen lucht in het kanaal wordt introduceert. Berg vervolgens de stroomcel op een omgekeerde microscoop.Sluit de uitlaatbuis aan op een spuitpomp en zet de inlaatbuis in een microcentrifugebuis met buffer A.Handjes trek minstens 0,5 milliliter buffer A om het systeem door te spoelen en de pomp te primen. Laat de pomp vervolgens minstens vijf minuten op 10 microliter per minuut draaien om het systeem in evenwicht te brengen. Vortex de voorraad fles kralen, en pipet 1,6 microliter van de kralen in 50 microliter van buffer A, dan vortex ze weer.Plaats de kralen op een magnetische scheidingsafscheid en pipet uit de buffer. Schors ze opnieuw in 50 microliters van buffer A en draaikolk ze. Na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten de kralen in 100 microliter buffer A voor een laatste concentratie van 160 microgram per milliliter.Bereid 480 microliter van 0,5 picomolar gelabeld DNA substraat in buffer A, en pipette 20 microliters van kraal suspensie in het verdunde DNA. Plaats het mengsel drie minuten op een rotator. Laad na de drie minuten het monster onmiddellijk in het kanaal met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut gedurende 15 minuten, of totdat voldoende kralentethering is waargenomen.Was het kanaal van alle vrije kralen door de inlaatbuis om te schakelen naar een verse buis van buffer A en vloei het minstens 10 minuten in op 50 microliter per minuut of totdat er geen losse kralen zijn waargenomen. En het is handig om een inline klep te gebruiken om de stroom af te snijden en de slang te schakelen. Schakelen buizen in een vloeiende beweging en zorg ervoor dat vloeistof niveaus in nieuwe en oude monster buizen overeenkomen om terugstroom te voorkomen.Bereid voordat u gegevens verzamelt de juiste concentratie dna-decolletéenzym voor en steek de inlaatbuis in het monster. Laat de magneet over de stroomcel zakken. Stel de pomp in om 80 microliter monster te injecteren op 150 microliter per minuut en begin met het verzamelen van gegevens.Een minuut in het verzamelen van gegevens, activeer de pomp. Hier is een representatief beeld van de vastgebonden kralen voor en na de reactie. Gegevensanalyse werd uitgevoerd om het aantal kralen te kwantificeren dat nog vastgelijt is tijdens de decolletéreactie.Deze techniek werd gebruikt om de site specifieke DNA decolleté tarieven van Nde1 voor eiwitconcentraties variërend van 0,25 tot vier eenheden per milliliter, en twee verschillende concentraties van magnesium te meten. Elke voorwaarde werd minstens tweemaal gerepliceerd, met een paar 100 tot 1000 vastgebonden DNA is per experiment. Bij voldoende lage eiwitconcentraties is de snelheid evenredig met eiwitten en onafhankelijk van magnesium.Voor hoge eiwitconcentraties is de snelheid afhankelijk van magnesium, maar onafhankelijk van de eiwitconcentratie. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat luchtbellen in de slang en het stroomkanaal het experiment kunnen uitvoeren. Zorg ervoor dat u geen lucht in de lijnen toe te staan tijdens het schakelen van buizen, en ontgassen alle buffers voor gebruik.De tethering methode maakt het mogelijk om het effect van spanning in het DNA op de reactie te onderzoeken. Dit kan worden bereikt door de magneetsterkte te variëren of de stroom toe te passen tijdens het verzamelen van gegevens.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Principes van site-specifieke recombinase (SSR) Technologie

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening voor kleine-molecule Modulators van Actieve Rectifier kaliumkanalen

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Single-molecule Imaging van genregulatie<em&gt; In vivo</em&gt; Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Het bestuderen van DNA Looping door Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...