Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Stipendium MCB-1715317 unterstützt.

1. Herstellung der Durchflusszelle
<ol><li>Waschen der Abdeckungen<ol>
<li>Deckelinen in Färbegefäße geben und mit Ethanol (EtOH) beschallen, dann mit 1 M KOH (jeweils 30 min). Um KOH-Fällung in EtOH zu vermeiden, spülen Sie gründlich mit ddH2O zwischen den Wärjahren.</li>
		<li>Wiederholen Sie sowohl EtOH als auch die KOH-Waschschritte 1x für insgesamt vier Waschungen (zwei EtOH und zwei KOH). Gereinigte Deckelinen in ddH2O in Färbegefäßen aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Be- und Au...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. 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M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Das Protokoll kann verwendet werden, um die Kinetik jedes SSDC-Systems zu messen, vorausgesetzt, dass die Strangtrennung während des Experiments beobachtet wird. Der Nachweis der Spaltung wird durch die Beobachtung der Ablösung der gefesselten Perle beeinflusst und markiert somit den Moment der Strangtrennung. Alle vorhergehenden Schritte erfolgen vor der Detektion der Spaltung; somit wird nur die gesamte Transitzeit erfasst.
Der Flow Cell Coverslip wird durch unspezifische Adsorption von An...

Standortspezifische DNA-Spaltung (SSDC) ist ein wichtiger Schritt in vielen genomischen Transaktionen. Beispielsweise schützen bakterielle Restriktionsmodifikationssysteme (RM)1 und CRISPR2 Zellen vor Angriffen durch Phagen und Plasmide, indem sie fremde DNA in bestimmten Sequenzen erkennen und spalten. In Typ II RM erkennen Restriktionsendonukleasen (REs) kurze 4–8 Basenpaarsequenzen (bp) über Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen3. CRISPR-assoziierte Endonukleasen, wie Cas9, binden über die Hybridisierung des Zielstandorts an Standorte mit crRNAs, die an die Endonukleases4gebunden sind. Die Erstellung von ortsspezifischen Doppelsträngigenbrüchen (DSBs) ist auch der erste Schritt bei vielen DNA-Rekombinationsereignissen5. Beispielsweise erfordert die Vielfalt der Durch V(D)J-Rekombination geschaffenen Antigenbindungsbereiche die Erkennung und Spaltung bestimmter Zielstandorte6. Einige Transposons sind dafür bekannt, bestimmte DNA-Sequenzen anzusprechen, sowie7. Es überrascht nicht, dass viele standortspezifische Nukleasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wie Cas9, eine Schlüsselkomponente von Gen-Editing-Technologiensind 8. Darüber hinaus wurden auch neuartige ortsspezifische Endonukleasen (d. h. Zinkfingernukleasen9 und TALENS10) entwickelt, um Genome zu bearbeiten.
Viele Methoden wurden eingesetzt, um die Kinetik der standortspezifischen Spaltung von Nukleinsäuren zu messen. Dazu gehören Gelanalyse, Fluoreszenz11,12und Sequenzierung basierende Methoden13. Ein großer Fortschritt wurde mit dem Ankleben von Mikroperlen erreicht, wodurch DSBs in einzelnen DNA-Molekülen durch die Bewegung einer Perle nach der Strangtrennung nachgewiesen werden können. Bei diesen Methoden werden verschiedene Arten von Kräften eingesetzt, um die Strangtrennung und Bewegung der Perle nach der Spaltung zu gewährleisten. In einem Fall wurden optische Fallen verwendet, um die Spaltung der DNA durch EcoRV14zu messen. In diesen Experimenten ist die Zielsuche das Ziel der Untersuchung, wobei die Bedingungen so optimiert sind, dass die standortspezifische Bindung der Schritt zur Preisbegrenzung ist. Ein Nachteil optischer Fallen ist, dass jeweils nur eine einzige DNA beobachtet werden kann. Darüber hinaus muss eine periodisch große Zugkraft angewendet werden, um die Strangtrennung zu testen.
Eine andere Technik verwendet eine Kombination aus Strömung und schwachen magnetischen Kräften, um die Perle kontinuierlich zu ziehen15. Auf diese Weise wird die Diffusionsbegrenzte Spaltung durch NdeI gemessen. Die angewandte Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehreren hundert DNAs auf einmal, so dass die statistische Signifikanz in einem einzigen Experiment erreicht werden kann. Experimente auf Basis magnetischer Pinzetten wurden ebenfalls verwendet. In einer solchen Studie wurde ein retrovirales Integras untersucht, indem ein DSB in das Insertionsoligonukleotid16eingebunden wurde. Eine erfolgreiche Integration führte zur Einbindung von DSB in die gebundene DNA und zum Verlust der angehängten Perle. In einer ähnlichen Studie der ATP-abhängigen Typ-III-Beschränkung Endonuklease EcoPI wurden Dutzende von DNAs in einem einzigen Experiment beobachtet17. Magnetische Pinzette haben den Vorteil, dass Spannung, sowie DNA-Looping, während der Reaktion gesteuert und überwacht werden können.
Hier wird eine hochparallele Einzelmolekülmethode zur Messung der SSDC-Kinetik vorgestellt, die die jüngsten Verbesserungen bei der großflächigen Tethering von DNAs nutzt. Diese Methode ist eine Verbesserung und Erweiterung der bisherigen Methoden zur Messung der DNA-Replikation18, Konturlänge von DNA19und Spaltung durch REs15. Bei dieser Technik werden lineare DNAs, die eine einzige Kopie der Erkennungssequenz enthalten, mit Biotin an einem Ende und Digoxigenin am anderen Ende hergestellt. Das Biotin bindet Streptavidin, das kovalent an einer paramagnetischen Mikroperle befestigt ist. Die DNA-Perlenkomplexe werden in einen mikrofluidischen Kanal injiziert, der mit Anti-Digoxigenin-FAB-Fragmenten funktionalisiert wurde. Die DNA bindet sich dann über die Bindung des Digoxigenins an die adsorbierten FAB-Fragmente an die Oberflächenbefestigungspunkte. Schwache magnetische Kräfte, die mit einem Permanentmagneten aufgebracht werden, halten die Perle davon ab, nicht spezifisch an der Oberfläche zu kleben. Proben können schnell (<30 s) in den Durchflusskanal injiziert werden, um die Spaltreaktion zu aktivieren. Der Flow wird während der Datenerfassung deaktiviert. Da jede DNA spaltet wird, kann der genaue Zeitpunkt der Spaltung bestimmt werden, indem der Rahmen aufgezeichnet wird, in dem sich die Perle nach oben und aus dem Brennplan des Objektivs bewegt und somit aus dem Videoaufgenommen verschwindet. Eine Frame-by-Frame-Anzahl der verbleibenden Perlen kann verwendet werden, um den Reaktionsfortschritt zu quantifizieren.
Im Folgenden wird das komplette Protokoll sowie Beispieldaten dargestellt, die mit NdeI gesammelt werden. Als Beispiel dafür, wie die Technik angewendet werden kann, werden die Spaltraten für eine Reihe von Proteinkonzentrationen in zwei verschiedenen Konzentrationen von Magnesium, einem essentiellen Metallkofaktor, gemessen. Obwohl diese Anwendung des Protokolls NdeI verwendet, kann das Verfahren für die Verwendung mit jeder standortspezifischen Nuklease angepasst werden, indem das DNA-Substratdesign variiert wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Standortspezifische DNA-Spaltung (SSDC) ist ein wichtiger Schritt in vielen zellulären Prozessen, und es ist entscheidend für die Genbearbeitung. Diese Arbeit beschreibt einen kinetischen Assay, der sSDC in vielen einzelnen DNA-Molekülen gleichzeitig messen kann. Bead-tethered Substrat DNAs, die jeweils eine einzige Kopie der Zielsequenz enthalten, werden in einem mikrofluidischen Durchflusskanal hergestellt. Ein äußerer Magnet wendet eine schwache Kraft auf die paramagnetischen Perlen an. Die Integrität von bis zu 1.000 einzelnen DNAs kann überwacht werden, indem die Mikroperlen unter Dunkelfeld-Bildgebung mit einem Breitfeld-Objektiv mit geringer Vergrößerung visualisiert werden. Die Injektion einer Restriktionsendonuklease, NdeI, löst die Spaltungsreaktion aus. Die Videomikroskopie wird verwendet, um das genaue Moment jeder DNA-Spaltung aufzuzeichnen, indem der Rahmen beobachtet wird, in dem sich die zugehörige Perle auf und ab der Brennebene des Objektivs bewegt. Frame-by-Frame-Perlenzählung quantifiziert die Reaktion, und eine exponentielle Anpassung bestimmt die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Methode ermöglicht die Erfassung quantitativer und statistisch signifikanter Daten über Einzelne Molekül-SSDC-Reaktionen in einem einzigen Experiment.

Mit dieser Technik wurden die SSDC-Raten von NdeI für eine Reihe von Proteinkonzentrationen (0,25–4,00 U/ml) bei zwei verschiedenen Magnesiumkonzentrationen (2 mM und 4 mM) gemessen. Jede dieser Bedingungen wurde mindestens zweimal repliziert, mit ein paar hundert bis 1.000 gebundenen DNAs pro Experiment. Abbildung 2 beschreibt den experimentellen Entwurf. Abbildung 3 zeigt Beispiele für Datenerfassungs- und Analysedetails. Abbildung 4</...

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Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Dieses Protokoll kann auf jeden Prozess angewendet werden, der zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führt und detaillierte quantitative Daten zur Kinetik liefert. Obwohl diese Methode eine Einzelmolekülauflösung hat, misst sie bis zu 1000 DNAs in einem einzigen Experiment und liefert somit gute Statistiken. Die primäre Anwendung dieser Methode besteht darin, die Mechanismen der DNA-Bindung und -Modifikation zu untersuchen.Wir sind beispielsweise daran interessiert, die DNA-Zielsuche zu untersuchen, die für alle DNA-bindenden Proteine relevant ist. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, dass einzelne Molekül-Tether empfindlich sind, und einmal Form, muss mit Sorgfalt behandelt werden. Der richtige Anteil funktionalisierter Oberflächen ist unerlässlich.Es gibt ein paar Tricks, um den Fluss so zu machen. Neben dem Wechseln von Probenröhren während der Datenerfassung kann eine visuelle Demonstration jemandem helfen, der mit diesem Verfahren noch nicht so gut zu ende ist. Um die Deckelschlüpfer zu waschen, legen Sie sie in Färbegefäße und beschallen Sie sie 30 Minuten lang mit Ethanol.Spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem und destilliertem Wasser ab, tauchen Sie sie dann in ein Molkaliumhydroxid ein und beschallen Sie sie noch 30 Minuten. Wiederholen Sie die Waschsequenz, und stellen Sie sicher, dass die Abdeckungsrutschen nach jeder Wäsche mit Wasser abspülen. Bewahren Sie die gereinigten Deckelschlupfins in Färbegefäßen mit Wasser auf.Verwenden Sie ein sauberes Rasiermesser, um acht Zentimeter lange Lade- und Austrittsrohre zu schneiden und in Löcher in einem sauberen Glasschlitten einzufügen. Epoxy die Schläuche und lassen Sie für fünf Minuten zu heilen, um es zu sichern. Doppelseitiges Klebeband mit dem Kanalmuster auf die Glasschlitten vorgeschnitten auftragen und mit Kunststoffzangen glätten, um eine gute Dichtung zu erreichen.Ziehen Sie die Ablage vom Band, und tragen Sie einen sauberen Deckelschlupf auf, um ihn mit der Zange zu glätten. Dann, Epoxid die Kante der Abdeckung rutschen, um die Durchflusszelle zu versiegeln und lassen Sie es aushärten. Bereiten Sie die beschriftete DNA für das Tethering vor, indem Sie PCR gemäß Manuskriptanweisungen durchführen.Reinigen Sie dann das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigungskit. Bereiten Sie 10 Milliliter Puffer A vor und entgasen Sie ihn in einem Vakuum-Austrocknungsor für mindestens eine Stunde. Um die Durchflusszelle zu funktionalisieren, injizieren Sie 25 Mikroliter Anti-Digoxigenin und Fab-Fragmente in PBS, in den Durchflusskanal, mit einer Gel-Ladespitze, um in die PE60-Schläuche zu passen.Inkubieren Sie die Durchflusszelle bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Ziehen Sie nach der Inkubation 0,5 Milliliter Puffer A mit einer Spritze durch den Kanal, wobei Darauf geachtet wird, keine Luft in den Kanal zu bringen. Dann bergen Sie die Strömungszelle auf einem invertierten Mikroskop.Schließen Sie das Auslassrohr an eine Spritzenpumpe an und legen Sie das Einlassrohr in ein Mikrozentrifugenrohr mit Puffer A. Ziehen Sie manuell mindestens 0,5 Milliliter Puffer A, um das System zu spülen und die Pumpe zu grundieren. Dann lassen Sie die Pumpe mit 10 Mikroliter pro Minute für mindestens fünf Minuten laufen, um das System zu ausdemadien. Wirbel die Stockflasche Perlen, und Pipette 1,6 Mikroliter der Perlen in 50 Mikroliter Puffer A, dann Wirbel sie wieder.Legen Sie die Perlen auf einen magnetischen Separator und Pipette aus dem Puffer. Sie in 50 Mikroliter Puffer A wieder aussetzen und wirbeln. Nach der letzten Wäsche die Perlen in 100 Mikroliter Puffer A für eine Endkonzentration von 160 Mikrogramm pro Milliliter wieder aufhängen.Bereiten Sie 480 Mikroliter 0,5 Picomolar beschriftetES DNA-Substrat in Puffer A und Pipette 20 Mikroliter Perlensuspension in die verdünnte DNA vor. Legen Sie die Mischung drei Minuten lang auf einen Rotator. Nach den drei Minuten die Probe sofort mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute für 15 Minuten in den Kanal laden, oder bis genügend Perlenanriss beobachtet wird.Waschen Sie den Kanal aller freien Perlen, indem Sie das Einlassrohr auf ein frisches Rohr von Puffer A umschalten und mit 50 Mikroliterpro Minute mindestens 10 Minuten einfließen lassen oder bis keine losen Perlen beobachtet werden. Und es ist hilfreich, ein Inline-Ventil zu verwenden, um den Durchfluss abzuschneiden und die Schläuche zu schalten. Schalten Sie Schläuche in einer sanften Bewegung und stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitsgehalte in neuen und alten Probenröhrchen passen, um Rückfluss zu vermeiden.Vor dem Sammeln von Daten, bereiten Sie die richtige Konzentration des DNA-Spaltungsenzyms vor, und legen Sie das Einlassrohr in die Probe ein. Senken Sie den Magneten über der Durchflusszelle. Stellen Sie die Pumpe so ein, dass 80 Mikroliter Probe auf 150 Mikroliter pro Minute injiziert werden, und beginnen Sie mit der Datenerfassung.Eine Minute nach der Datenerfassung, aktivieren Sie die Pumpe. Hier ist ein repräsentatives Bild der gefesselten Perlen vor und nach der Reaktion zu sehen. Die Datenanalyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der Perlen zu quantifizieren, die während der Spaltungsreaktion noch gebunden sind.Diese Technik wurde verwendet, um die standortspezifischen DNA-Spaltungsraten von Nde1 für Proteinkonzentrationen zwischen 0,25 und vier Einheiten pro Milliliter und zwei verschiedene Magnesiumkonzentrationen zu messen. Jede Bedingung wurde mindestens zweimal repliziert, mit ein paar 100 bis 1000 gebundene DNA ist pro Experiment. Bei ausreichend niedrigen Proteinkonzentrationen ist die Rate proportional zu Protein und unabhängig von Magnesium.Bei hohen Proteinkonzentrationen ist die Rate von Magnesium abhängig, aber unabhängig von der Proteinkonzentration. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass Luftblasen im Schlauch- und Durchflusskanal das Experiment ausführen können. Achten Sie darauf, keine Luft in die Leitungen zu lassen, während Sie den Schlauch wechseln, und entgasen Sie alle Puffer, bevor Sie sie verwenden.Die Tethering-Methode ermöglicht es, die Wirkung von Spannung in der DNA auf die Reaktion zu untersuchen. Dies kann erreicht werden, indem die Magnetstärke variiert oder der Durchfluss während der Datenerfassung angewendet wird.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Principles of ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Forschung

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Der schnellere, Hohe Auflösung, MTPA-GFP-basierte Mitochondriale Fusion Assay Acquiring Kinetische Daten mehrerer Zellen parallel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...