Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע MCB-1715317.

1. הפיכת תא הזרימה
<ol><li>שטיפת כיסויים<ol>
<li>מקום מכסה צנצנות כתמים sonicate עם אתנול (EtOH), אז עם 1 M KOH (עבור 30 דקות כל אחד). כדי למנוע KOH משקעים ETOH, לשטוף ביסודיות עם ddH2O בין שטיפה.</li>
		<li>חזור על EtOH ועל שלבי השטיפה KOH 1x עבור מספר כולל של ארבע שטיפה (שני EtOH ושני KOH). לאחסן כיסויים נקיים בdH2O בצנצנ...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את הקינטיים של כל מערכת SSDC, בתנאי שהפרדת הגדיל נצפתה במהלך הניסוי. זיהוי המחשוף מושפע מהתבוננות בניתוק החרוז הרצועה ולכן מסמן את מידת הפרדת הגדילים. כל השלבים הקודמים מתרחשים לפני זיהוי המחשוף; לכן, רק זמן המעבר הכולל נרשם.
כיסוי תא הזרימה הוא פ?...

מחשוף DNA ספציפי לאתר (SSDC) הוא צעד מפתח בעסקאות גנומיות רבות. לדוגמה, שינוי הגבלה חיידקית (RM)1 ומערכות CRISPR2 להגן על תאים מפני התקפה על ידי phages ופלסמידים על ידי זיהוי ומחשוף של DNA זר ברפים ספציפיים. בסוג II RM, אנדונוקלאס הגבלת (REs) לזהות רצפים קצרים 4-8 בסיס זוג בסיס (bp) באמצעות אינטראקציות חומצה גרעיןחלבון 3. אנדונוקלאסים המשויכים CRISPR, כגון Cas9, לאגד לאתרים באמצעות הכלאה של אתר היעד עם crRNAs מאוגדים endonucleases4. יצירת הפסקות תקועות כפולות ספציפיות לאתר (DSBs) הן גם הצעד הראשון באירועי שילוב DNA רבים5. לדוגמה, המגוון של אזורי איגוד אנטיגן שנוצרו על-ידי V(D)J שילוב דורש זיהוי ומחשוף של אתרי יעד ספציפיים6. כמה transposons ידועים למקד רצפי DNA ספציפיים, כמוגם 7. באופן לא מפתיע, גרעין ספציפי לאתר רבים המעורבים בתהליכים אלה, כגון Cas9, הם מרכיב מרכזי בטכנולוגיות עריכתגנים 8. בנוסף, אנדונוקליאות חדשניות ספציפיות לאתר (כלומר, גרעין אצבעאבץ 9 ו-TALENS10)הונדסו גם הן לעריכת גנומים.
שיטות רבות נוהל כדי למדוד את הקינטיים של מחשוף ספציפי לאתר של חומצות גרעין. אלה כוללים ניתוח ג'ל,פלואורסצנס 11,12, ושיטות מבוססות רצף13. התקדמות משמעותית הושגה עם רצועה של microbeads, המאפשר DSBs במולקולות יחיד של ה-DNA להתגלות על ידי התנועה של חרוז לאחר הפרדת גדיל. בשיטות אלה, סוגים שונים של כוחות מועסקים כדי להבטיח את הפרדת הגדיל ואת התנועה של החרוז לאחר המחשוף. במקרה אחד, מלכודות אופטיות שימשו כדי למדוד מחשוף של ה-DNA על ידי EcoRV14. בניסויים אלה, חיפוש היעד הוא מטרת החקירה, עם תנאים ממוטבים כך שאיגוד ספציפי לאתר הוא השלב המגביל את הקצב. חסרון אחד של מלכודות אופטיות הוא שרק DNA אחד ניתן לצפות בכל פעם. בנוסף, יש להחיל כוח משיכה גדול תקופתי כדי לבדוק את הפרדת הגדיל.
טכניקה נוספת משתמשת בשילוב של זרימה וכוחות מגנטיים חלשים כדי למשוך את החרוז באופן רציף15. בדרך זו, מחשוף מוגבל דיפוזיה על ידי NdeI נמדד. השיטה המועסקת מאפשרת מדידה בו זמנית של כמה מאות DNAs בבת אחת, המאפשר משמעות סטטיסטית להיות מושגת בניסוי אחד. ניסויים המבוססים על פינצטה מגנטית שימשו גם כן. במחקר אחד כזה, integrase רטרוויראלי נחקר על ידי הכללת DSB בהחדרת אוליגונוקלאוטיד16. שילוב מוצלח הביא להתאגדות של DSB ב-DNA קשור ואובדן של החרוז המצורף. במחקר דומה של EcoPI הגבלת אנדונוקליאז סוג III תלוי ATP, עשרות DNAs נצפו בניסוי יחיד17. פינצטה מגנטית להחזיק את היתרון כי מתח, כמו גם לולאות DNA, ניתן לשלוט ולפקח במהלך התגובה.
מוצג כאן היא שיטת מולקולה אחת מקבילה מאוד למדידת קינטיקה SSDC, אשר מנצל את השיפורים האחרונים ברצועה בקנה מידה גדול של DNAs. שיטה זו היא שיפור והרחבה של שיטות קודמות המשמשות למדד שכפול DNA18, אורך קווי מתאר של DNA19, ומחשוף על ידי REs15. בטכניקה זו, DNAs ליניארי המכיל עותק יחיד של רצף הזיהוי מוכנים עם ביוטין בקצה אחד digoxigenin בצד השני. הביוטין קושר סטרפטאבידין, המחובר באופן קוולנטי למיקרו-חרוז פארמגנטי. תסביכות חרוזי ה-DNA מוזרקים לערוץ מיקרו-נוזלים שתפקד עם שברי FAB אנטי-דיגוקסיג'ין. ה-DNA לאחר מכן קשור אל פני השטח נקודות מצורף באמצעות איגוד של digoxigenin לשבבי FAB adsorbed. כוחות מגנטיים חלשים המיושם עם מגנט קבוע לשמור על החרוז מדבק באופן לא ספציפי על פני השטח. ניתן להזריק דגימות במהירות (<30 s) לתוך ערוץ הזרימה כדי להפעיל את תגובת המחשוף. הזרימה מבוטלת במהלך איסוף נתונים. כאשר כל דנ"א מחשוף, ניתן לקבוע את זמן המחשוף המדויק על ידי הקלטת המסגרת שבה החרוז נע למעלה והחוצה מהתוכנית המוקדית של המטרה, ובכך להיעלם מרמת הקלטה. ניתן להשתמש בספירה של מסגרת אחר מסגרת של חרוזים שנותרו כדי לכמת את התקדמות התגובה.
מוצג להלן הפרוטוקול המלא, כמו גם נתונים לדוגמה שנאספו באמצעות NdeI. כדוגמה לאופן שבו ניתן ליישם את הטכניקה, שיעורי מחשוף עבור מגוון ריכוזי חלבון נמדדים בשני ריכוזים שונים של מגנזיום, cofactor מתכת חיוני. למרות יישום זה של הפרוטוקול משתמש NdeI, השיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם כל גרעין ספציפי לאתר על ידי שינוי עיצוב ה-DNA של הצוללת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

מחשוף DNA ספציפי לאתר (SSDC) הוא צעד מפתח בתהליכים סלולריים רבים, והוא חיוני לעריכת גנים. עבודה זו מתארת תסה קינטית המסוגלת למדוד SSDC במולקולות DNA יחיד רבות בו זמנית. DNAs של הצוללת עם חרוזים, שכל אחד מהם מכיל עותק יחיד של רצף היעד, מוכנים בערוץ זרימה מיקרו-נוזל. מגנט חיצוני מפעיל כוח חלש על החרוזים הפרמגנטיים. ניתן לפקח על שלמותם של עד 1,000 DNAs בודדים על-ידי הדמיית המיקרו-חרוזים תחת הדמיית Darkfield באמצעות מטרה רחבת-שדה, הגדלה נמוכה. הזרקת אנדונוקליז הגבלה, נדול, יוזמת את תגובת המחשוף. מיקרוסקופ וידאו משמש כדי להקליט את הרגע המדויק של כל מחשוף DNA על ידי התבוננות במסגרת שבה החרוז המשויך נע למעלה והחוצה של מישור המוקד של המטרה. ספירת חרוזים פריים אחר תמונה מכמתת את התגובה, והתאים מעריכי קובע את קצב התגובה. שיטה זו מאפשרת איסוף של נתונים כמותיים ומשמעותיים סטטיסטית על מולקולה אחת תגובות SSDC בניסוי יחיד.

באמצעות טכניקה זו, שיעורי SSDC של NdeI נמדדו עבור מגוון של ריכוזי חלבון (0.25-4.00 U/mL) בשני ריכוזים שונים של מגנזיום (2 mM ו 4 mM). כל אחד מהתנאים הללו שוכפל לפחות פעמיים, עם כמה מאות עד 1,000 DNAs קשורים לכל ניסוי. איור 2 מתאר את העיצוב הניסיוני. איור 3 מציג דוגמאות של פרטי איסוף...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תהליך שתוותו הפסקות DNA תקועות כפולות, מניב נתונים כמותיים מפורטים על קינטיקה. למרות שלשיטה זו יש רזולוציית מולקולה אחת, היא מודדת עד 1000 DNAs בניסוי אחד, ובכך מספקת סטטיסטיקה טובה. היישום העיקרי של שיטה זו הוא ללמוד את המנגנונים המעורבים מחייב DNA ושינוי.לדוגמה, אנו מעוניינים לחקור חיפוש יעד DNA, אשר רלוונטי לכל החלבונים מחייב DNA. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, זכור כי tethers מולקולה אחת הם עדינים, פעם צורה, יש לטפל בזהירות. חלקם הנכון של משטחים פונקציונליים הוא חיוני.יש כמה טריקים כדי להפוך את הזרימה כל כך. בנוסף להחלפת צינורות לדוגמה במהלך איסוף נתונים, הדגמה חזותית יכולה לעזור למישהו חדש בהליך זה. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, מניחים אותם בצנצנות מכתים ומניקים אותם באתנול במשך 30 דקות.ביסודיות לשטוף אותם עם מים deionized מזוקק, ולאחר מכן לטבול אותם אחד טוחנת אשלגן הידרוקסיד sonicate אותם במשך 30 דקות נוספות. חזור על רצף לשטוף, הקפד לשטוף את הכיסוי מחליק עם מים לאחר כל לשטוף. לאחסן את החלקות כיסוי ניקה בצנצנות מכתים עם מים.השתמש סכין גילוח נקי לחתוך שמונה סנטימטר ארוך טעינה ולצאת צינורות, ולהכניס אותם לתוך חורים במגלשת זכוכית נקייה. אפוקסי צינורות ולתת תרופה במשך חמש דקות כדי לאבטח אותו. החל קלטת דו צדדית מראש לחתוך עם דפוס הערוץ על שקופיות זכוכית, ולהחליק אותו עם מדפים פלסטיק כדי להשיג חותם טוב.מקלפים את הגיבוי מהקלטת, ולהחיל להחליק כיסוי נקי, מחליק אותו עם המדפים. לאחר מכן, אפוקסי קצה הכיסוי להחליק לאטום את תא הזרימה ולתת לו לרפא. הכן את הדנ"א המסווים לקשור על ידי ביצוע PCR בהתאם לכיווני כתב היד.לאחר מכן לטהר את מוצר PCR עם ערכת ניקוי PCR. הכינו 10 מיליליטר של חיץ א', ודגמים אותו בביוב ואקום למשך שעה אחת לפחות. כדי לתפקד את תא הזרימה, להזריק 25 microliters של חלקיקים אנטי digoxigenin ו fab ב PBS, לתוך ערוץ הזרימה, באמצעות קצה טעינת ג'ל כדי להתאים צינורות PE60.דגירה תא הזרימה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, למשוך 0.5 מיליליטר של חיץ A דרך הערוץ עם מזרק, דואג לא להציג אוויר לתוך הערוץ. לאחר מכן, הר תא הזרימה על מיקרוסקופ הפוך.חבר את צינור השקע למשאבת מזרק, והכנס את צינור הכניסה לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל חיץ A.Manually למשוך לפחות 0.5 מיליליטר של חיץ A כדי לשטוף את המערכת ואת ראש המשאבה. לאחר מכן תן למשאבה לפעול ב-10 מיקרוליטרים לדקה למשך חמש דקות לפחות כדי לצייד את המערכת. Vortex בקבוק מלאי של חרוזים, ו pipette 1.6 microliters של חרוזים לתוך 50 microliters של חיץ A, ואז מערבולת אותם שוב.מניחים את חרוזים על מפריד מגנטי פיפטה החוצה את המאגר. להשעות אותם מחדש ב 50 microliters של חיץ A ומערבולת אותם. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את חרוזים ב 100 microliters של חיץ A עבור ריכוז סופי של 160 מיקרוגרם למיליליטר.הכינו 480 מיקרוליטרים של מצע דנ"א מסומן 0.5 פיקומולר במאגר A, ופיפט 20 מיקרוליטרים של השעיית חרוזים לדנ"א המדולל. מניחים את התערובת על מסובב במשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, מיד לטעון את המדגם לתוך התעלה בקצב זרימה של 10 microliters לדקה במשך 15 דקות, או עד חבלה חרוז מספיק נצפתה.לשטוף את הערוץ של כל חרוזים חינם על ידי החלפת צינור inlet לצינור טרי של חיץ A, וזורם אותו ב 50 microliters לדקה לפחות 10 דקות או עד שום חרוזים רופפים נצפו. וזה מועיל להשתמש בשסתום מוטבע כדי לנתק את הזרימה ולהחליף את הצינורות. החלפת צינורות בתנועה חלקה אחת ולוודא רמות נוזלים צינורות מדגם חדשים וישנים להתאים כדי למנוע זרימה אחורית.לפני איסוף הנתונים, להכין את הריכוז הנכון של אנזים מחשוף DNA, ולהכניס את צינור הכניסה לתוך המדגם. מנמיך את המגנט מעל תא הזרימה. הגדר את המשאבה להזריק 80 microliters של מדגם ב 150 microliters לדקה ולהתחיל איסוף נתונים.דקה אחת לתוך איסוף נתונים, להפעיל את המשאבה. מוצגת כאן תמונה מייצגת של חרוזים קשורות לפני ואחרי התגובה. ניתוח נתונים בוצע כדי לכמת את מספר חרוזים שנותרו קשורות לאורך כל תגובת המחשוף.טכניקה זו שימשה למדידת שיעורי מחשוף הדנ"א הספציפיים לאתר של Nde1 עבור ריכוזי חלבונים הנעים בין 0.25 לארבע יחידות למיליליטר, ושני ריכוזים שונים של מגנזיום. כל מצב שוכפל לפחות פעמיים, עם כמה 100 עד 1000 DNA קשור הוא לכל ניסוי. בריכוזי חלבון נמוכים מספיק, השיעור פרופורציונלי לחלבון ולא תלוי במגנזיום.עבור ריכוזי חלבון גבוהים, השיעור תלוי במגנזיום, אך אינו תלוי בריכוז החלבון. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי בועות אוויר בערוץ צינורות וזרימה יכול להפעיל את הניסוי. הקפד לא לאפשר כל אוויר לתוך הקווים בעת החלפת צינורות, ו degas כל המאגרים לפני השימוש.שיטת החבל מאפשרת לחקור את השפעת המתח בדנ"א על התגובה. זה יכול להיות מושגת על ידי שינוי חוזק המגנט או החלת זרימה במהלך איסוף נתונים.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...