Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation MCB-1715317.

1. Fare la cella di flusso
<ol><li>Lavaggio delle coperture<ol>
<li>Mettere i coverlips in vasetti di colorazione e sonicare con etanolo (EtOH), quindi con 1 M KOH (per 30 min ciascuno). Per evitare precipitazioni KOH in EtOH, risciacquare accuratamente con ddH2O tra lavaggi.</li>
		<li>Ripetere entrambi i passaggi di lavaggio EtOH e KOH 1x per un numero totale di quattro lavaggi (due EtOH e due KOH). Conservare i coperture pulite in ddH2O in vasetti di colorazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. 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M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Il protocollo può essere utilizzato per misurare la cinetica di qualsiasi sistema SSDC, a condizione che la separazione del filo sia osservata durante l'esperimento. La rilevazione della scissione è influenzata osservando il distacco del tallone legato e quindi segna l'istante di separazione del filo. Tutti i passaggi precedenti si verificano prima del rilevamento della scissione; pertanto, viene registrato solo il tempo di transito totale.
Il cosorpecco cellulare di flusso è funzionalizzat...

La scissione del DNA specifica del sito (SSDC) è un passo chiave in molte transazioni genomiche. Ad esempio, i sistemi di restrizione batterica (RM)1 e CRISPR2 proteggono le cellule dagli attacchi di fagi e plasmi, riconoscendo e fendendo il DNA estraneo in sequenze specifiche. Nel tipo II RM, le endonucleasi di restrizione (RSI) riconoscono brevi sequenze di coppie di base (bp) 4-8 tramite interazioni proteina-nucleicodell'acido 3. Le endonucleasi associate a CRISPR, come Cas9, si legano ai siti tramite ibridazione del sito di destinazione con crRNA associati alle endonucleasi4. La creazione di DSB (Double Stranded Breaks) specifiche del sito sono anche il primo passo in molti eventi di ricombinazione del DNA5. Ad esempio, la diversità delle regioni di associazione dell'antigene create dalla ricombinazione V(D)J richiede il riconoscimento e la scissione di siti di destinazione specifici6. Alcuni trasposoni sono noti per indirizzare sequenze di DNA specifiche, cosìcome 7. Non sorprende che molte nucleasi specifiche del sito coinvolte in questi processi, come Cas9, siano una componente chiave delle tecnologie di editing genico8. Inoltre, sono state progettate nuove endonucleasi specifiche del sito (ad esempio, nucleasi di dita di zinco9 e TALENS10) per modificare i genomi.
Molti metodi sono stati impiegati per misurare la cinetica della scissione site-specific degli acidi nucleici. Questi includono l'analisi del gel, la fluorescenza11,12e i metodi basati sul sequenziamento13. Un importante progresso è stato raggiunto con il tethering delle microsfere, che consente ai DSB in singole molecole di DNA di essere rilevati dal movimento di una perla dopo la separazione del filamento. In questi metodi, diversi tipi di forze sono impiegati per garantire la separazione del filo e il movimento del tallone post-scissione. In un caso, sono state utilizzate trappole ottiche per misurare la scissione del DNA da parte di EcoRV14. In questi esperimenti, la ricerca target è l'obiettivo dell'indagine, con condizioni ottimizzate in modo che l'associazione specifica del sito sia il passaggio di limitazione della frequenza. Uno svantaggio delle trappole ottiche è che si può osservare un solo DNA alla volta. Inoltre, è necessario applicare una forza di trazione di grandi dimensioni periodica per testare la separazione del filo.
Un'altra tecnica utilizza una combinazione di flusso e deboli forze magnetiche per tirare sul tallone in modo continuo15. In questo modo, viene misurata la scissione limitata di NdeI. Il metodo impiegato consente la misurazione simultanea di diverse centinaia di DNA contemporaneamente, consentendo di raggiungere la significatività statistica in un singolo esperimento. Sono stati utilizzati anche esperimenti basati su pinzette magnetiche. In uno di questi studi, un integratore retrovirale è stato studiato includendo un DSB nell'oligonucleotidedi inserimento 16. Il successo dell'integrazione ha portato all'incorporazione di DSB nel DNA legato e alla perdita del tallone allegato. In uno studio simile sulla restrizione endonuclea EcoPI, dipendente dall'ATP, sono state osservate decine di DNA in un singolo esperimento17. Le pinzette magnetiche detengono il vantaggio che la tensione, così come il looping del DNA, possono essere controllate e monitorate durante la reazione.
Qui è presentato un metodo a singola molecola altamente parallelo per misurare la cinetica SSDC, che sfrutta i recenti miglioramenti nel tethering su larga scala dei DNA. Questo metodo è un miglioramento e l'estensione dei metodi precedenti utilizzati per misurare la replicazione del DNA18, lunghezza del contorno del DNA19e scissione da Es15. In questa tecnica, i DNA lineari contenenti una singola copia della sequenza di riconoscimento vengono preparati con la biotina ad un'estremità e la digoxigenina all'altra. La biotina lega streptavidin, che è covalentemente ad una microsfera paramagnetica. I complessi di perline di DNA vengono iniettati in un canale microfluidico che è stato funzionalizzato con frammenti DI FAB anti-digoxigenina. Il DNA si lega quindi ai punti di attacco della superficie attraverso il legame della digoxigenina ai frammenti FAB adsorbti. Le deboli forze magnetiche applicate con un magnete permanente impedise al tallone di attaccarsi in modo non specifico alla superficie. I campioni possono essere iniettati rapidamente (<30 s) nel canale di flusso per attivare la reazione di scissione. Il flusso viene disattivato durante la raccolta dei dati. Come ogni DNA è fessurato, il tempo esatto di scissione può essere determinato registrando il fotogramma in cui il tallone si muove su e fuori dal piano focale dell'obiettivo, scomparendo così dalla registrazione video. Un conteggio fotogramma per fotogramma delle perline rimanenti può essere utilizzato per quantificare il progresso della reazione.
Di seguito è riportato il protocollo completo e i dati di esempio raccolti utilizzando NdeI. Come esempio di come la tecnica può essere applicata, i tassi di scissione per una gamma di concentrazioni proteiche sono misurati a due diverse concentrazioni di magnesio, un cofattore di metallo essenziale. Anche se questa applicazione del protocollo utilizza NdeI, il metodo può essere adattato per l'uso con qualsiasi nucleasi specifica del sito variando il design del substrato di DNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

La scissione del DNA specifica del sito (SSDC) è un passo chiave in molti processi cellulari ed è fondamentale per l'editing genico. Questo lavoro descrive un saggio cinetico in grado di misurare SSDC in molte singole molecole di DNA contemporaneamente. I DNA del substrato con legato al tallone, ciascuno contenente una singola copia della sequenza di destinazione, vengono preparati in un canale di flusso microfluidico. Un magnete esterno applica una forza debole alle perline paramagnetiche. L'integrità di un massimo di 1.000 singoli DN può essere monitorata visualizzando le microsfere sotto l'imaging darkfield utilizzando un obiettivo di ingrandimento ampio e basso campo. L'iniezione di una restrizione endonucleasi, NdeI, avvia la reazione scissione. La microscopia video viene utilizzata per registrare il momento esatto di ogni scissione del DNA osservando il fotogramma in cui il tallone associato si muove verso l'alto e verso l'alto dal piano focale dell'obiettivo. Il conteggio del tallone fotogramma per fotogramma quantifica la reazione e una adattamento esponenziale determina il tasso di reazione. Questo metodo consente la raccolta di dati quantitativi e statisticamente significativi sulle reazioni SSDC a singola molecola in un singolo esperimento.

Utilizzando questa tecnica, i tassi SSDC di NdeI sono stati misurati per una gamma di concentrazioni proteiche (0,25–4,00 U/mL) a due diverse concentrazioni di magnesio (2 mM e 4 mM). Ognuna di queste condizioni è stata replicata almeno due volte, con poche centinaia di 1.000 DNA con tethering per esperimento. Figura 2 descrive la progettazione sperimentale. Nella figura 3 sono illustrati esempi di dettagli di raccolta e analisi dei dati. <strong class="xfig"...

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Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Viene descritto un metodo altamente parallelo per misurare la scissione specifica del sito del DNA a livello di singola molecola. Questo protocollo illustra la tecnica utilizzando la restrizione endonuclease NdeI. Il metodo può essere facilmente modificato per studiare qualsiasi processo che si traduce in scissione del DNA specifica del sito.

Analisi cinetica ad alta velocità ad alto rendimento parallela per cleavage del DNA specifico del sito

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi processo che si traduce in rotture di DNA a doppio filamento, fornisce dati quantitativi dettagliati sulla cinetica. Sebbene questo metodo abbia una risoluzione a singola molecola, misura fino a 1000 DNA in un singolo esperimento, fornendo così buone statistiche. L'applicazione primaria di questo metodo è studiare i meccanismi coinvolti nel legame e nella modifica del DNA.Ad esempio, siamo interessati a studiare la ricerca del bersaglio del DNA, che è rilevante per tutte le proteine leganti il DNA. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta, ricorda che i tether a singola molecola sono delicati e, una volta che si formano, devono essere maneggiati con cura. La giusta proporzione di superfici funzionalizzate è essenziale.Ci sono alcuni trucchi per rendere il flusso così. Oltre a cambiare i tubi campione durante la raccolta dei dati, la dimostrazione visiva può aiutare qualcuno che non ha bisogno di questa procedura. Per lavare i coperchi, metterli in barattoli di colorazione e sonicarli con etanolo per 30 minuti.Sciacquarli accuratamente con acqua deionizzata e distillata, quindi immergerli in un idrossido di potassio molare e sonicarli per altri 30 minuti. Ripetere la sequenza di lavaggio, assicurandosi di risciacquare il coperchio scivola con acqua dopo ogni lavaggio. Conservare le foglietti di copertura puliti in barattoli di colorazione con acqua.Utilizzare un rasoio pulito per tagliare tubi di carico e uscita lunghi otto centimetri e inserirli in fori in uno scivolo di vetro pulito. Epossidico il tubo e lasciare curare per cinque minuti per fissarlo. Applicare il nastro a doppia lato pretagliato con il motivo del canale sui vetrini e lisciarlo con forcep di plastica per ottenere una buona tenuta.Staccare il supporto dal nastro e applicare uno scivolo di copertura pulito, levigarlo con le forcep. Quindi, epossidico il bordo del coperchio scivolare per sigillare la cellula di flusso e lasciarla curare. Preparare il DNA etichettato per il tethering eseguendo la PCR secondo le indicazioni manoscritte.Quindi purificare il prodotto PCR con un kit di pulizia PCR. Preparare 10 millilitri di tampone A e degasarlo in un essiccatore sottovuoto per almeno un'ora. Per funzionalizzare la cella di flusso, iniettare 25 microlitri di frammenti anti-digoxigenina e fab in PBS, nel canale di flusso, utilizzando una punta di caricamento del gel per adattarsi ai tubi PE60.Incubare la cella di flusso a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, tirare 0,5 millilitri di tampone A attraverso il canale con una siringa, facendo attenzione a non introdurre aria nel canale. Quindi, montagna la cella di flusso su un microscopio invertito.Collegare il tubo di uscita a una pompa per siringhe e mettere il tubo di ingresso in un tubo di micro centrifuga contenente tampone A.Estrarre manualmente almeno 0,5 millilitri di tampone A per lavare il sistema e innescare la pompa. Quindi lasciare funzionare la pompa a 10 microlitri al minuto per almeno cinque minuti per equilibrare il sistema. Vortice la bottiglia stock di perline, e pipetta 1.6 microlitri delle perline in 50 microlitri di tampone A, quindi vortice di nuovo.Posizionare le perline su un separatore magnetico e pipettare il tampone. Sospenderli in 50 microlitri del tampone A e vortice. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo le perline in 100 microlitri del tampone A per una concentrazione finale di 160 microgrammi per millilitro.Preparare 480 microlitri di substrato di DNA etichettato con etichetta 0,5 picomolare nel tampone A e pipettare 20 microlitri di sospensione del tallone nel DNA diluito. Posizionare la miscela su un rotatore per tre minuti. Dopo i tre minuti, caricare immediatamente il campione nel canale con una portata di 10 microlitri al minuto per 15 minuti o fino a quando non si osserva un sufficiente tethering del tallone.Lavare il canale di tutte le perline libere passando il tubo di ingresso a un tubo fresco di tampone A e fluendolo a 50 microlitri al minuto per almeno 10 minuti o fino a quando non si osservano perline allentate. Ed è utile utilizzare una valvola in linea per tagliare il flusso e cambiare i tubi. Commutazione dei tubi in un unico movimento fluido e assicurarsi che i livelli di liquido in tubi campione nuovi e vecchi corrispondano per evitare il riflusso.Prima di raccogliere i dati, preparare la corretta concentrazione dell'enzima di scissione del DNA e inserire il tubo di ingresso nel campione. Abbassare il magnete sopra la cella di flusso. Impostare la pompa per iniettare 80 microlitri di campione a 150 microlitri al minuto e iniziare la raccolta dei dati.Un minuto dopo la raccolta dei dati, attiva la pompa. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa delle perline tethered prima e dopo la reazione. L'analisi dei dati è stata eseguita per quantificare il numero di perline che rimangono tethered durante la reazione di scissione.Questa tecnica è stata utilizzata per misurare i tassi di scissione del DNA specifici del sito di Nde1 per concentrazioni proteiche che vanno da 0,25 a quattro unità per millilitro e due diverse concentrazioni di magnesio. Ogni condizione è stata replicata almeno due volte, con alcuni 100-1000 DNA tethered per esperimento. A concentrazioni proteiche sufficientemente basse, il tasso è proporzionale alle proteine e indipendente dal magnesio.Per alte concentrazioni proteiche, il tasso dipende dal magnesio, ma indipendente dalla concentrazione proteica. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che le bolle d'aria nel tubo e nel canale di flusso possono eseguire l'esperimento. Assicurarsi di non consentire l'ingresso di aria nelle linee durante la commutazione dei tubi e degasare tutti i buffer prima dell'uso.Il metodo di tethering consente di esplorare l'effetto della tensione nel DNA sulla reazione. Questo può essere ottenuto variando la forza del magnete o applicando il flusso durante la raccolta dei dati.

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Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...