Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
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この研究は、国立科学財団がMCB-1715317を助成金によって支援されました。

1. フローセルの作成
<ol><li>カバーリップを洗う<ol>
<li>エタノール(EtOH)で瓶と超音波処理にカバースリップを置き、1 M KOH(それぞれ30分間)を使用します。EtOHのKOH沈殿を避けるために、洗浄の間にddH2Oで十分に洗いす。</li>
		<li>EtOH と KOH 洗浄ステップ 1x の両方を、合計 4 回の洗浄回数 (2 回の EtOH と 2 つの KOH) に対して繰り返します。汚れた瓶の中にddH2Oでクリーニングされたカ...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. 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このプロトコルは、実験中にストランド分離が観察される限り、任意のSSDCシステムの運動を測定するために使用することができる。切断の検出は、につながれたビーズの剥離を観察することによって影響を受け、したがって、ストランド分離の瞬間をマークします。すべての前のステップは、切断の検出前に発生します。したがって、合計通過時間のみが記録されます。
<p class="jove_content...

部位特異的DNA切断(SSDC)は、多くのゲノム取引における重要なステップである。例えば、細菌制限修飾(RM)11およびCRISPR2システムは、特定の配列で外来DNAを認識および切断することによって、ファージおよびプラスミドによる攻撃から細胞を保護する。II型RMでは、制限エンドヌクレアーゼ(R)は、タンパク質-核酸相互作用を介して短い4–8塩基対(bp)配列を認識する。CRISPR関連エンドヌクレアーゼは、Cas9などの、エンドヌクレアーゼ4に結合したcrRNAを有する標的部位のハイブリダイゼーションを介して部位に結合する。部位特異的二本鎖破断(DSB)の作成も、多くのDNA組換えイベント5の第一歩である。例えば、V(D)J組換えによって作成された抗原結合領域の多様性は、特異的標的部位6の認識および切断を必要とする。いくつかのトランスポソンは、特定のDNA配列を標的とすることが知られている、7.当然のことながら、Cas9のようなこれらのプロセスに関与する多くの部位特異的ヌクレアーゼは、遺伝子編集技術8の重要な構成要素である。また、新規部位特異的エンドヌクレアーゼ(すなわち、ジンクフィンガーヌクレアーゼ9およびTALENS10)もゲノムを編集するように設計されている。
核酸の部位特異的切断の運動を測定するために多くの方法が採用されている。これらには、ゲル分析、蛍光11、12、,12およびシーケンシングベースの方法13が含まれる。DNAの単一分子のDSBが鎖分離後のビーズの動きによって検出されることを可能にするマイクロビーズのテザリングで大きな進歩が達成されました。これらの方法では、異なるタイプの力が、ビード後切断のストランド分離および運動を確実にするために使用される。あるケースでは、光トラップがEcoRV14によるDNAの切断を測定するために使用されてきた。これらの実験では、ターゲット検索は調査の目的であり、サイト固有の結合がレート制限ステップになるように条件が最適化されています。光トラップの欠点の1つは、一度に1つのDNAしか観察できないということです。さらに、ストランド分離のテストには、周期的に大きな引き上げ力を適用する必要があります。
別の技術は、連続的な方法でビードを引っ張るために流れと弱い磁力の組み合わせを使用します15.このようにして、NdeIによる拡散制限された切断が測定される。この方法を用いると、同時に数百個のDNAを同時に測定することができ、1回の実験で統計的有意性を得ることができます。磁気ピンセットを用いた実験も行われている。そのような研究の1つにおいて、挿入オリゴヌクレオチド16にDSBを含めることによってレトロウイルスインテグラーゼを研究した。統合に成功すると、結合されたDNAにDSBが組み込まれ、付着したビーズが失われた。ATP依存性III型制限エンドヌクレアーゼEcoPIの同様の研究では、1回の実験17で数十のDNAが観察された。磁気ピンセットは、反応中に緊張を制御し、監視することができるという利点を有する。
ここでは、DAの大規模テザリングの最近の改善を利用したSSDCキネティクスを測定するための非常に平行な単一分子法を紹介します。この方法は、DNA複製18、DNA19の輪郭長、および、R15による切断を測定するために用いられる以前15の方法の改良および延長である。19この技術では、認識配列の単一のコピーを含む線状DNAは、一方の端にビオチン、他方でジゴキシゲニンで調製される。ビオチンは、常磁性マイクロビーズに共有結合するストレプトアビジンに結合する。DNAビーズ複合体は、抗ジゴキシゲニンFAB断片で機能化されたマイクロ流体チャネルに注入される。次いでDNAは、二ゴキシゲニンを吸着したFAB断片に結合して表面付着点にテザーを付ける。永久磁石で弱い磁力を加えた場合、ビードが表面に非特異的に貼り付けられるのを防ぎます。サンプルは、流路に迅速に注入することができる(<30 s)切断反応を活性化する。データ収集中にフローがオフになります。各DNAが切断されると、ビーズが目的の焦点計画を上下に移動するフレームを記録することによって切断の正確な時間を決定することができ、したがってビデオレコードから消える。残りのビーズのフレームごとのカウントは、反応の進行状況を定量化するために使用することができます。
以下に示す完全なプロトコルと、NdeIを使用して収集されたデータの例を示します。この手法を適用する方法の一例として、タンパク質濃度の範囲に対する切断速度は、必須の金属補因子であるマグネシウムの2つの異なる濃度で測定される。このプロトコルの適用はNdeIを使用するが、この方法はDNA基質設計を変えることによって任意の部位特異的ヌクレアーゼとの使用のために適合させることができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

部位特異的DNA切断(SSDC)は、多くの細胞プロセスにおける重要なステップであり、遺伝子編集にとって極めて重要です。本研究は、多くの単DNA分子で同時にSSDCを測定することができる運動アッセイを記述する。ビーズ・テザード基板DNAは、それぞれ標的配列の単一コピーを含み、マイクロ流体流路に調製される。外部磁石は、常磁性ビーズに弱い力を与えます。広視野、低倍率の目的を使用して暗視野イメージング下のマイクロビーズを視覚化することによって、最大1,000個の個々のDNAの完全性を監視することができます。制限エンドヌクレアーゼの注入は、NdeI、切断反応を開始する。ビデオ顕微鏡は、関連するビーズが目的の焦点面を上下に移動するフレームを観察することによって、各DNA切断の正確な瞬間を記録するために使用される。フレームごとのビーズカウントは反応を定量化し、指数適合によって反応速度が決定されます。この方法は単一の実験で単一分子SSDC反応に関する定量的および統計的に有意なデータの収集を可能にする。

この技術を用いて、2つの異なる濃度のマグネシウム(2 mMおよび4 mM)で、さまざまなタンパク質濃度(0.25~4.00 U/mL)について、NdeIのSSDC速度を測定した。これらの条件のそれぞれは、実験ごとに数百から1,000のテザリングされたDNAで、少なくとも2回複製された。 図2 は実験計画を説明する。 図 3 は、データ収集と分析の詳細の例を示しています。 <strong c...

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Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

単一分子レベルでのDNAの部位特異的切断を測定するための高度に平行な方法が記載されている。このプロトコルは、制限エンドヌクレアーゼNdeIを用いた手法を示す。この方法は、部位特異的なDNA切断をもたらす任意のプロセスを研究するために容易に改変することができる。

部位特異的DNA切断のための並列高スループット単一分子運動アッセイ

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

このプロトコルは、二本鎖DNA切断をもたらす任意のプロセスに適用することができ、キネティクスに関する詳細な定量データを生成します。この方法は単一分子分解能を有するが、1回の実験で最大1000個のDNAを測定し、良好な統計を提供する。この方法の主な応用は、DNA結合および修飾に関与するメカニズムを研究することにある。例えば、DNA結合タンパク質に関連するDNA標的探索の研究に興味があります。この技術を初めて試みる際には、単一分子テザーは繊細であり、一度形成されると、注意して処理しなければならないことを覚えておいてください。機能面の適切な割合が不可欠です。流れを作るためのいくつかのトリックがあります。データ収集中にサンプルチューブを切り替えるだけでなく、この手順に新しい人を助けることができます。カバースリップを洗う場合は、瓶を染色し、エタノールで30分間超音波処理します。脱イオンして蒸留した水で徹底的に洗い流し、水酸化モルカリウム1個に浸し、さらに30分間超音波処理します。洗浄シーケンスを繰り返し、各洗浄後にカバースリップを水で洗い流します。洗浄したカバースリップを水で汚す瓶に保管してください。きれいなカミソリを使用して、長さ8センチメートルのロードと出口チューブをカットし、きれいなガラススライドの穴に挿入します。エポキシチューブを使用し、それを確保するために5分間硬化させます。ガラススライドにチャネルパターンで両面テーププレカットを適用し、良好なシールを達成するためにプラスチック製の鉗子でそれを滑らかにします。テープから裏地を剥がし、きれいなカバースリップを適用し、鉗子で滑らかにします。次いで、カバースリップのエッジをエポキシしてフローセルを密封し、硬化させる。原稿の指示に従ってPCRを行うことにより、テザリング用に標識DNAを調製します。次に、PCR のクリーンアップ キットで PCR 製品を精製します。バッファーAの10ミリリットルを調製し、少なくとも1時間真空デシケーターで脱ガスします。フローセルを機能化するには、25マイクロリットルの抗ジゴキシゲニンおよびファブフラグメントをPBSに注入し、フローチャネルに、PE60チューブに収まるゲルローディングチップを使用します。室温で30分間、フローセルをインキュベートします。インキュベーション後、0.5ミリリットルのバッファーAを注射器でチャネルを通して引き、チャネルに空気を導入しないように注意する。次いで、逆顕微鏡上のフローセルを山に山。出口管をシリンジポンプに引っ掛け、注入管をバッファAを含むマイクロ遠心分離管に入れ込みます。次に、ポンプを1分間に10マイクロリットルで少なくとも5分間稼働させ、システムを平衡化します。ビーズのストックボトルをボルテックスし、ビーズのピペット1.6マイクロリットルを50マイクロリットルのバッファAに入れ、再び渦を出します。ビーズを磁気セパレータに置き、ピペットをバッファーから外します。バッファーAの50マイクロリットルでそれらを再中断し、それらを渦。最後の洗浄後、1ミリリットル当たり160マイクログラムの最終濃度のために、100マイクロリットルのバッファーAでビーズを再中断します。480マイクロリットルの0.5ピコモラー標識DNA基質を緩衝液Aに調製し、ピペット20マイクロリットルのビーズ懸濁液を希釈DNAに調製する。混合物を回転器に3分間置きます。3分後、1分間に10マイクロリットルの流量ですぐに試料をチャネルにロードし、または十分なビーズテザリングが観察されるまで観察される。入口チューブをバッファーAの新鮮なチューブに切り替え、少なくとも10分間または緩いビーズが観察されないまで毎分50マイクロリットルで流すことによって、すべてのフリービーズのチャネルを洗浄します。また、インラインバルブを使用して流れを遮断し、チューブを切り替えると便利です。1つの滑らかな動きでチューブを切り替え、逆流を避けるために、新旧のサンプルチューブの液体レベルが一致することを確認します。データを収集する前に、DNA切断酵素の正しい濃度を準備し、サンプルに入口チューブを挿入します。フローセルの上に磁石を下げます。1分間に150マイクロリットルで80マイクロリットルのサンプルを注入するようにポンプをセットし、データ収集を開始します。データ収集に1分、ポンプをアクティブにします。ここに示されているのは、反応の前後のテザービーズの代表的な画像です。データ分析を行い、切断反応全体を通してつながれたビーズの数を定量化した。この技術は、1ミリリットル当たり0.25〜4単位、および2つの異なるマグネシウム濃度のタンパク質濃度に対するNde1の部位特異的DNA切断率を測定するために使用された。各条件は少なくとも2回複製され、数100〜1000のテザーDNAは実験ごとに行われた。十分に低いタンパク質濃度では、速度はタンパク質に比例し、マグネシウムから独立しています。高タンパク質濃度の場合、速度はマグネシウムに依存しますが、タンパク質濃度に依存しません。このプロトコルを試す場合、チューブおよびフロー チャネルの気泡で実験を実行できることに注意してください。チューブを切り替える間はラインに空気を入れないようにし、使用する前にすべてのバッファを脱気してください。テザリング法は、反応に対するDNAの緊張の影響を探索することを可能にする。これは、磁石の強度を変化させるか、データ収集中に流れを適用することによって達成することができます。

Research

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