Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

이 작품은 국립 과학 재단 보조금 MCB-1715317에 의해 지원되었다.

1. 유동 셀 만들기
<ol><li>커버립 세척<ol>
<li>커버를 염색 항아리에 넣고 에탄올 (EtOH)으로 초음파 처리한 다음 1 M KOH (각 30 분)로 초음파 처리합니다. EtOH에서 KOH 강수량을 피하기 위해 세척 사이에 ddH2O로 철저히 헹구십시오.</li>
		<li>EtOH와 KOH 세척 단계는 총 4개의 세척(EtOH 2개, KOH 2개)에 대해 1x로 반복합니다. 염색 항아리에 ddH2O에 청소 커버립을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>깨끗?...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

프로토콜은 실험 중에 가닥 분리가 관찰되는 경우 모든 SSDC 시스템의 역학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 분열의 검출은 테더드 비드의 분리를 관찰하여 영향을 받아 가닥 분리의 순간을 표시한다. 모든 앞단계는 골짜기를 감지하기 전에 발생합니다. 따라서 총 전송 시간만 기록됩니다.
유동 세포 커버슬립은 항체 단백질을 깨끗한 유리에 비특이적으로 흡착하여 기능화?...

사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 게놈 트랜잭션의 핵심 단계이다. 예를 들어, 세균 제한 수정(RM)1 및 CRISPR2 시스템은 특정 서열에서 외국 DNA를 인식하고 c떠나서 파지 및 플라스미드에 의한 공격으로부터 세포를 보호합니다. II형 RM에서, 제한 엔도니션리스(REs)는 단백질-핵산 상호작용3을통해 짧은 4-8염기쌍(bp) 서열을 인식한다. Cas9과 같은 CRISPR 관련 엔도누리스는 crRNA가 엔도니클리스4에바인딩된 대상 사이트의 혼성화를 통해 사이트에 바인딩됩니다. 사이트별 이중 좌초 휴식(DSBs)의 생성은 또한 많은 DNA 재조합 이벤트5의첫 번째 단계이다. 예를 들어, V(D)J 재조합에 의해 생성된 항원 결합 영역의 다양성은 특정 표적 부위6의인식 및 분열을 필요로 한다. 일부 트랜스포슨은 7뿐만아니라특정 DNA 서열을 표적으로 하는 것으로 알려져 있다. 당연히 Cas9와 같은 이러한 공정에 관여하는 많은 사이트 별 뉴클레아제는 유전자 편집 기술의 핵심 구성 요소입니다8. 또한, 새로운 사이트별 엔도나클레스(즉, 아연 핑거 뉴클레아제9 및 TALENS10)도게놈을 편집하도록 설계되었다.
많은 방법은 핵산의 사이트 별 분열의 운동학을 측정하기 위하여 채택되었습니다. 여기에는 겔 분석,형광(11,,12)및 시퀀싱 기반방법(13)이포함됩니다. DNA의 단일 분자에서 DSBs가 가닥 분리 후 비드의 움직임에 의해 검출될 수 있도록 하는 마이크로비드의 테더링으로 중요한 발전이 이루어졌습니다. 이러한 방법에서, 다른 유형의 힘은 비드 포스트 분열의 가닥 분리 및 움직임을 보장하기 위해 사용된다. 한 경우, 광학 트랩은 EcoRV14에의해 DNA의 분열을 측정하는 데 사용되었습니다. 이러한 실험에서 대상 검색은 조사의 목적이며, 사이트별 바인딩이 속도 제한 단계되도록 조건이 최적화되어 있습니다. 광학 트랩의 한 가지 단점은 한 번에 단일 DNA만 관찰할 수 있다는 것입니다. 또한, 가닥 분리를 테스트하기 위해 주기적인 큰 당기는 힘을 적용해야 한다.
또 다른 기술은 흐름과 약한 자기력의 조합을 사용하여 연속적인 방식으로 구드를당긴다(15). 이러한 방식으로, NdeI에 의한 확산 제한 분열이 측정된다. 이 방법을 사용하면 한 번에 수백 개의 DN을 동시에 측정할 수 있으므로 단일 실험에서 통계적 유의를 얻을 수 있습니다. 자기 핀셋을 기반으로 한 실험도 사용되었습니다. 이러한 연구에서는, 레트로바이러스 인테그라스는 삽입 올리고뉴클레오티드(16)에 DSB를 포함시킴으로써 연구되었다.16 성공적인 통합은 묶인 DNA에 DSB를 통합하고 부착된 비드의 손실을 초래했습니다. ATP 의존형 III 제한 엔토누리스 에코피의 유사한 연구에서, 수십 개의 DNA가 단일실험(17)에서관찰되었다. 자기 핀셋은 긴장뿐만 아니라 DNA 루핑이 반응 중에 제어및 모니터링될 수 있다는 이점을 보유하고 있습니다.
여기에 제시된 DNA의 대규모 테더링의 최근 개선을 활용하는 SSDC 운동학을 측정하기 위한 매우 병렬적인 단일 분자 방법이 있습니다. 본 방법은 DNA복제(18)및 DNA 19의 윤곽 길이, 및REs(15)에의한 절단을 측정하는 데 사용되는 이전 방법의 개선 및 확장이다.19 이 기술에서, 인식 서열의 단일 사본을 포함하는 선형 DNA는 한쪽 끝에 비오틴으로 제조되고 다른 쪽은 디곡시게닌을 제조한다. 비오틴은 파라마그네틱 마이크로비드에 공동으로 부착된 스트렙타비딘을 결합합니다. DNA 비드 복합체는 항 디곡시겐 FAB 단편으로 기능화된 미세유체 채널로 주입됩니다. 그런 다음 DNA는 디곡시게닌의 결합을 통해 표면 부착 점에 결합하여 흡착된 FAB 단편에 결합합니다. 영구 자석으로 가해지는 약한 자기력은 비포장물이 표면에 특별히 달라붙지 않도록 합니다. 시료는 골짜기 반응을 활성화하기 위해 유동 채널에 빠르게 주입(&30 s)할 수 있다. 데이터 수집 중에 흐름이 꺼져 있습니다. 각 DNA가 갈라질 때, 비드가 목표의 초점 계획에서 위아래로 이동하는 프레임을 기록하여 정확한 분열 시간을 결정할 수 있으므로 비디오 레코드에서 사라집니다. 남은 구슬의 프레임별 개구부는 반응 진행 상황을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
다음은 NdeI를 사용하여 수집된 전체 프로토콜과 예제 데이터입니다. 이 기술을 어떻게 적용할 수 있는지의 예로, 단백질 농도의 범위에 대한 절단 비율은 필수 금속 보조인인 마그네슘의 두 가지 농도로 측정됩니다. 프로토콜의 이 응용은 NdeI를 사용하지만, DNA 기판 설계를 변화시킴으로써 임의의 부위 별 뉴클레아제와 함께 사용하기 위해 방법을 조정할 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 세포 과정의 핵심 단계이며 유전자 편집에 매우 중요합니다. 이 작품은 많은 단일 DNA 분자에서 SSDC를 동시에 측정할 수 있는 운동 분석을 설명합니다. 비드 테더드 기판 DNA는 각각 표적 서열의 단일 복사본을 포함하는 미세 유체 흐름 채널에서 제조된다. 외부 자석은 파라자성 구슬에 약한 힘을 적용합니다. 최대 1,000개의 개별 DN의 무결성은 넓은 분야의 낮은 배율 목표를 사용하여 암필드 이미징 에서 마이크로비드를 시각화하여 모니터링할 수 있습니다. 제한 엔도니엔탈리스의 주입, NdeI, 분열 반응을 시작합니다. 비디오 현미경 검사는 관련 비드가 목표의 초점 평면에서 위아래로 이동하는 프레임을 관찰하여 각 DNA 분열의 정확한 순간을 기록하는 데 사용됩니다. 프레임별 비드 카운팅은 반응을 정량화하고 지수핏으로 반응 속도를 결정합니다. 이 방법을 사용하면 단일 실험에서 단일 분자 SSDC 반응에 대한 정량적 및 통계적으로 유의한 데이터를 수집할 수 있습니다.

이 기술을 이용하여, NdeI의 SSDC 비율은 마그네슘(2mM 및 4mMMM)의 2개의 상이한 농도에서 단백질 농도(0.25-4.00 U/mL)의 범위에 대해 측정되었다. 이러한 각 조건은 실험당 수백에서 1,000개의 Tetheed DNA와 함께 적어도 두 번 복제되었습니다. 그림 2는 실험 설계를 설명합니다. 그림 3에서는 데이터 수집 및 분석 세부 정보의 예제를 보여 주습니다. ...

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Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

단일 분자 수준에서 DNA의 부위 별 분열을 측정하는 매우 병렬적인 방법이 기재된다. 이 프로토콜은 제한 엔도니올리스 NdeI를 사용하는 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 사이트별 DNA 분열의 결과를 초래하는 모든 과정을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다.

현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

이 프로토콜은 이중 좌초 된 DNA 중단을 초래하는 모든 프로세스에 적용 할 수 있으며 운동학에 대한 자세한 정량적 데이터를 산출합니다. 이 방법은 단일 분자 해상도를 가지고 있지만, 단일 실험에서 최대 1000 DNA를 측정하므로 좋은 통계를 제공합니다. 이 방법의 1차 적용은 DNA 결합 및 수정에 관여하는 메커니즘을 연구하는 것입니다.예를 들면, 우리는 모든 DNA 결합 단백질과 관련있는 DNA 표적 검색을 공부에 관심이 있습니다. 처음으로이 기술을 시도 할 때, 단일 분자 밧줄은 섬세하다는 것을 기억, 한 번 형태, 주의처리해야합니다. 기능화 표면의 적절한 비율은 필수적입니다.흐름을 그렇게 하기위한 몇 가지 트릭이 있습니다. 데이터 수집 중에 샘플 튜브를 전환할 뿐만 아니라 시각적 데모를 사용하면 이 절차를 새로 사용할 수 있습니다. 커버 슬립을 씻으려면 염색 항아리에 놓고 에탄올로 30 분 동안 초음파 처리하십시오.탈이온화및 증류수로 철저히 헹구고, 수산화칼륨 1개에 담그고 30분 동안 초음파 처리합니다. 세척 시퀀스를 반복하여 세척 할 때마다 덮개 전표를 물로 헹구십시오. 청소된 커버 슬립을 물로 염색하는 항아리에 보관합니다.깨끗한 면도기를 사용하여 8센티미터 길이의 로딩 및 출구 튜브를 자르고 깨끗한 유리 슬라이드의 구멍에 삽입합니다. 튜브에 에폭시하고 그것을 확보하기 위해 5 분 동안 치료할 수 있습니다. 양면 테이프를 유리 슬라이드에 채널 패턴으로 미리 잘라내고 플라스틱 집게로 매끄럽게 하여 좋은 밀봉을 만듭니다.테이프에서 백업을 벗기고 깨끗한 커버 슬립을 적용하여 집게로 부드럽게 합니다. 이어서, 커버의 가장자리를 에폭시로 미끄러져 유동 세포를 밀봉하고 치료하게 한다. 원고 방향에 따라 PCR을 수행하여 테더링을 위해 표지된 DNA를 준비합니다.그런 다음 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정화합니다. 버퍼 A10 밀리리터를 준비하고 진공 건조기에서 1시간 이상 분해합니다. 유동 셀을 기능화하기 위해, PBS에 안티 디곡시겐과 팹 조각의 25 마이크로 리터를 유량 채널에 주입하여 PE60 튜브에 맞게 젤 로딩 팁을 사용한다.30 분 동안 실온에서 유동 셀을 배양합니다. 인큐베이션 후, 주사기로 채널을 통해 버퍼 A의 0.5 밀리리터를 당겨 채널에 공기를 도입하지 않도록주의하십시오. 그런 다음, 반전 된 현미경에 흐름 세포를 산.콘센트 튜브를 주사기 펌프에 연결하고 입구 튜브를 버퍼 A.수동으로 버퍼 A의 0.5 밀리리터를 당겨 시스템을 플러시하고 펌프를 프라임하는 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 펌프를 분당 10 마이크로리터에서 5분 이상 실행하여 시스템을 상형화할 수 있도록 합니다. 구슬의 스톡 병을 소용돌이, 및 파이펫 1.6 버퍼 A의 마이크로 리터로 구슬의 마이크로 리터, 다음 다시 소용돌이.구슬을 자기 분리기 위에 놓고 버퍼를 피펫합니다. 버퍼 A의 50 마이크로 리터에서 다시 중단하고 그들을 소용돌이. 마지막 세척 후, 밀리리터 당 160 마이크로 그램의 최종 농도에 대한 버퍼 A의 100 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.완충A에서 0.5 피코몰라 표지 DNA 기판의 480 마이크로리터를 준비하고, 파이펫 20 마이크로리터의 비드 현탁액을 희석된 DNA로 준비한다. 혼합물을 회전에 3분간 놓습니다. 3분 후, 15분 동안 분당 10마이크로리터의 유속으로 또는 충분한 비드 테더링이 관찰될 때까지 즉시 채널에 샘플을 적재한다.입구 튜브를 완충 A의 신선한 튜브로 전환하여 모든 무료 구슬의 채널을 세척하고 분당 50 마이크로 리터에서 10 분 이상 또는 느슨한 구슬이 관찰되지 않을 때까지 흐릅니다. 또한 인라인 밸브를 사용하여 흐름을 차단하고 튜브를 전환하는 것이 좋습니다. 하나의 부드러운 동작으로 튜브를 전환하고 백플로우를 피하기 위해 새롭고 오래된 샘플 튜브의 액체 수준이 일치하는지 확인합니다.데이터를 수집하기 전에 DNA 분열 효소의 정확한 농도를 준비하고 입구 튜브를 샘플에 삽입합니다. 유동 셀 위에 자석을 낮춥춥시다. 펌프를 설정하여 분당 150 마이크로리터에 80마이크로리터의 샘플을 주입하고 데이터 수집을 시작합니다.데이터 수집에 1 분, 펌프를 활성화. 여기에 반응 전후에 테더드 구슬의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 데이터 분석은 분열 반응 전반에 걸쳐 테더드된 구슬의 수를 정량화하기 위해 수행되었다.이 기술은 밀리리터 당 0.25에서 4 단위에 이르는 단백질 농도에 대한 Nde1의 부위 특이적 DNA 절단 비율을 측정하고, 마그네슘의 2개의 상이한 농도를 측정하는 데 사용되었다. 각 조건은 실험 당 몇 100 에서 1000 테더 DNA와 함께 적어도 두 번 복제되었다. 충분히 낮은 단백질 농도에서, 속도단백질에 비례하 고 마그네슘과 무관하다.고단백 농도의 경우, 비율은 마그네슘에 의존하지만 단백질 농도와는 무관합니다. 이 프로토콜을 시도할 때 튜브 및 흐름 채널의 기포가 실험을 실행할 수 있음을 명심하십시오. 튜브를 전환하는 동안 라인에 공기를 허용하지 말고 사용하기 전에 모든 버퍼를 분해하십시오.테더링 방법을 사용하면 DNA에서 긴장의 효과가 반응에 미치는 영향을 탐구할 수 있습니다. 이는 데이터 수집 중에 자석 강도를 변화거나 흐름을 적용하여 달성할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

특정 사이트 Recombinase (SSR) 기술의 원리

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

연구

생물학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...