Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation grant MCB-1715317.

1. Lage strømningscellen
<ol><li>Vaske dekkslips<ol>
<li>Plasser dekkglass i fargeglass og soniker med etanol (EtOH), deretter med 1 M KOH (i 30 min hver). For å unngå KOH-nedbør i EtOH, skyll grundig med ddH2O mellom vaskene.</li>
		<li>Gjenta både EtOH og KOH vasketrinn 1x for totalt fire vasker (to EtOH og to KOH). Oppbevar deslipper i ddH2O i fargeglass.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skjær lasting og utgangsrør (8 cm lange) med en ren barberhøvel og sett inn i hull i et rent glasssklie. Bruk ...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Protokollen kan brukes til å måle kinetikken til et hvilket som helst SSDC-system, forutsatt at strandseparasjonen observeres under eksperimentet. Påvisning av spalting påvirkes ved å observere løsrivelse av den bundet perle og markerer derfor øyeblikket for strandseparasjon. Alle foregående trinn oppstår før påvisning av spaltningen; dermed registreres bare den totale transittiden.
Strømningscelledekslipen er funksjonalisert via ikke-spesifikk adsorpsjon av antistoffprotein til de...

Stedsspesifikk DNA-spalting (SSDC) er et viktig skritt i mange genomiske transaksjoner. Bakteriell begrensningsmodifisering (RM)1- og CRISPR2-systemer beskytter for eksempel celler mot angrep fra falider og plasmider ved å gjenkjenne og spalte utenlandsk DNA ved bestemte sekvenser. I type II RM gjenkjenner restriksjonsetdonukleer (NE) korte 4–8 basisparsekvenser (bp) via proteinkjernesyreinteraksjoner3. CRISPR-tilknyttede endonukleærer, som Cas9, binder seg til nettsteder via hybridisering av målområdet med crRNAs bundet til endonucleases4. Etableringen av stedsspesifikke dobbelt strandede pauser (DSBs) er også det første trinnet i mange DNA-rekombinasjonshendelser5. Mangfoldet av antigenbindingsområder som er opprettet av V(D)J-rekombinasjon, krever for eksempel anerkjennelse og spaltning av bestemte målområder6. Noen transposoner er kjent for å målrette spesifikke DNA-sekvenser, samt7. Ikke overraskende er mange stedsspesifikke kjerner involvert i disse prosessene, for eksempel Cas9, en viktig komponent i genredigeringsteknologier8. I tillegg er nye stedsspesifikke endonukleer (det vil si sinkfingerkjerner9 og TALENS10)også blitt konstruert for å redigere genomer.
Mange metoder har blitt brukt for å måle kinetikken til stedsspesifikk spaltning av nukleinsyrer. Disse inkluderer gelanalyse, fluorescens11,,12og sekvensering baserte metoder13. Et stort fremskritt ble oppnådd med tethering av mikroperler, noe som gjør at DSB i enkeltmolekyler av DNA kan oppdages ved bevegelse av en perle etter strandseparasjon. I disse metodene er ulike typer krefter ansatt for å sikre strandseparasjon og bevegelse av perlen etter spalting. I ett tilfelle har optiske feller blitt brukt til å måle spaltning av DNA av EcoRV14. I disse eksperimentene er målsøk målet for undersøkelsen, med betingelser optimalisert slik at nettstedsspesifikk binding er det begrensende trinnet. En ulempe med optiske feller er at bare et enkelt DNA kan observeres om gangen. I tillegg må en periodisk stor trekkraft brukes til å teste for strandseparasjonen.
En annen teknikk bruker en kombinasjon av strømning og svake magnetiske krefter til å trekke på perlen på en kontinuerligmåte 15. På denne måten måles diffusjonsbegrenset spaltning av NdeI. Metoden som brukes gjør det mulig å samtidig måle flere hundre DNAer samtidig, slik at statistisk signifikans kan nås i et enkelt eksperiment. Eksperimenter basert på magnetiske pinsett har også blitt brukt. I en slik studie ble en retroviral integrase studert ved å inkludere en DSB i innsetting oligonukleotid16. Vellykket integrasjon resulterte i inkorporering av DSB i bundet DNA og tap av den vedlagte perlen. I en lignende studie av den ATP-avhengige type III-begrensningen endonuklese EcoPI ble titalls DNAer observert i et enkelt eksperiment17. Magnetiske pinsett har fordelen av at spenning, samt DNA looping, kan kontrolleres og overvåkes under reaksjonen.
Presentert her er en svært parallell enkeltmolekylmetode for måling av SSDC-kinetikk, som utnytter nylige forbedringer i storskala tilknytning av DNAer. Denne metoden er en forbedring og utvidelse av tidligere metoder som brukes til å måleDNA-replikering 18,konturlengde på DNA19og spalting av REs15. I denne teknikken er lineære DNAer som inneholder en enkelt kopi av anerkjennelsessekvensen utarbeidet med biotin i den ene enden og digoksigenin i den andre. Biotin binder streptavidin, som er kovalent festet til en paramagnetisk mikroperle. DNA-perlekompleksene injiseres i en mikrofluidisk kanal som har blitt funksjonalisert med anti-digoksigenin FAB fragmenter. DNA-et festepunkter til overflatetilbehørspunktene via binding av digoksigeninen til de adssorberte FAB-fragmentene. Svake magnetiske krefter påført med en permanent magnet holder perlen fra å stikke ikke-spesielt til overflaten. Prøver kan injiseres raskt (<30 s) inn i strømningskanalen for å aktivere spaltingsreaksjonen. Flow er deaktivert under datainnsamling. Etter hvert som hvert DNA er spaltet, kan den nøyaktige tiden for spalting bestemmes ved å registrere rammen der perlen beveger seg opp og ut av fokusplanen for målet, og dermed forsvinner fra videoopptaket. En ramme-for-ramme antall gjenværende perler kan brukes til å kvantifisere reaksjonsfremdriften.
Nedenfor er den komplette protokollen samt eksempeldata samlet inn ved hjelp av NdeI. Som et eksempel på hvordan teknikken kan brukes, måles spaltingshastigheter for en rekke proteinkonsentrasjoner ved to forskjellige konsentrasjoner av magnesium, en essensiell metallkofaktor. Selv om denne anvendelsen av protokollen bruker NdeI, kan metoden tilpasses for bruk med en hvilken som helst stedsspesifikk kjerne ved å variere DNA-substratdesignen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Stedsspesifikk DNA-spalting (SSDC) er et viktig skritt i mange cellulære prosesser, og det er avgjørende for genredigering. Dette arbeidet beskriver en kinetisk analyse som kan måle SSDC i mange enkelt DNA-molekyler samtidig. Bead-tethered substrat DNAs, som hver inneholder en enkelt kopi av målsekvensen, er utarbeidet i en mikrofluidisk strømningskanal. En ekstern magnet bruker en svak kraft på paramagnetiske perler. Integriteten til opptil 1000 individuelle DNAer kan overvåkes ved å visualisere mikroperlene under darkfield-avbildning ved hjelp av et bredt felt, lavt forstørrelsesmål. Injeksjon av en begrensning endonukleær, NdeI, initierer spaltingreaksjonen. Videomikroskopi brukes til å registrere det nøyaktige øyeblikket for hver DNA-spalting ved å observere rammen der den tilknyttede perlen beveger seg opp og ut av fokusplanet til målet. Frame-by-frame perle telling kvantifiserer reaksjonen, og en eksponentiell passform bestemmer reaksjonshastigheten. Denne metoden tillater innsamling av kvantitative og statistisk signifikante data om enkeltmolekylSSDC-reaksjoner i ett enkelt eksperiment.

Ved hjelp av denne teknikken ble SSDC-frekvensen av NdeI målt for en rekke proteinkonsentrasjoner (0,25–4,00 E/ml) ved to forskjellige konsentrasjoner av magnesium (2 mM og 4 mM). Hver av disse forholdene ble replikert minst to ganger, med noen få hundre til 1000 bundet DNAer per eksperiment. Figur 2 beskriver eksperimentell design. Figur 3 viser eksempler på datainnsamling og analysedetaljer. Figur 4 illustrerer hvordan hastig...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

En svært parallell metode for måling av stedsspesifikk spaltning av DNA på enkeltmolekylnivå er beskrevet. Denne protokollen viser teknikken ved hjelp av restriksjonen endonuclease NdeI. Metoden kan enkelt endres for å studere enhver prosess som resulterer i stedsspesifikk DNA-spalting.

Parallell høy gjennomstrømning enkelt molekyl kinetisk analyse for stedsspesifikk DNA cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Denne protokollen kan brukes på enhver prosess som resulterer i dobbelt strandet DNA-pauser, gir detaljerte kvantitative data om kinetikk. Selv om denne metoden har enkelt molekyloppløsning, måler den opptil 1000 DNAer i et enkelt eksperiment, og gir dermed god statistikk. Den primære anvendelsen av denne metoden er å studere mekanismene som er involvert i DNA-binding og modifikasjon.For eksempel er vi interessert i å studere DNA-målsøk, som er relevant for alle DNA-bindende proteiner. Når du prøver denne teknikken for første gang, husk at enkeltmolekyltetherer er delikate, og når de dannes, må håndteres med forsiktighet. Riktig andel av funksjonaliserte overflater er avgjørende.Det er noen triks for å gjøre flyten så. I tillegg til å bytte prøverør under datainnsamling, kan visuell demonstrasjon hjelpe noen som er nye i denne prosedyren. For å vaske dekselet slips, legg dem i farging krukker og sonicate dem med etanol i 30 minutter.Skyll dem grundig med deionisert og destillert vann, senk dem deretter ned i en molakaliumhydroksid og soniker dem i 30 minutter til. Gjenta vaskesekvensen, og pass på at du skyller dekselet med vann etter hver vask. Oppbevar det rengjorte dekselet i flekker med vann.Bruk en ren barberhøvel til å kutte åtte centimeter lange lasting og utgangsrør, og sett dem inn i hull i et rent glass lysbilde. Epoxy slangen og la kurere i fem minutter for å sikre den. Påfør dobbeltsidig tape pre-cut med kanalmønsteret til glassskliene, og glatt den ut med plast tang for å oppnå en god forsegling.Skrell baksiden av båndet, og påfør en ren dekselslipp, og glatt den ut med tangene. Deretter epoxy kanten av dekselet slip å forsegle strømningscellen og la den kurere. Forbered det merkede DNA for tilknytning ved å utføre PCR i henhold til manuskriptretninger.Rens deretter PCR-produktet med et PCR-oppryddingssett. Forbered 10 milliliter buffer A, og degas det i en vakuum desiccator i minst en time. For å funksjonalisere strømningscellen, injiser 25 mikroliter anti-digoksigenin og fab fragmenter i PBS, inn i strømningskanalen, ved hjelp av en gel lasting tips for å passe inn i PE60 slangen.Inkuber strømningscellen ved romtemperatur i 30 minutter. Etter inkubasjonen trekker du 0,5 milliliter buffer A gjennom kanalen med en sprøyte, og tar vare på å ikke introdusere luft inn i kanalen. Deretter fjeller strømningscellen på et omvendt mikroskop.Koble utløpsrøret til en sprøytepumpe, og sett innløpsrøret i et mikrosentrigerrør som inneholder buffer A.Trekk manuelt minst 0,5 milliliter buffer A for å skylle systemet og prime pumpen. La deretter pumpen gå med 10 mikroliter per minutt i minst fem minutter for å likevekte systemet. Vortex lagerflasken med perler, og pipette 1,6 mikroliter av perlene i 50 mikroliter buffer A, og virvle dem deretter igjen.Plasser perlene på en magnetisk separator og pipette ut bufferen. Re-suspendere dem i 50 mikroliter buffer A og virvel dem. Etter siste vask, re-suspendere perlene i 100 mikroliter buffer A for en endelig konsentrasjon på 160 mikrogram per milliliter.Forbered 480 mikroliter av 0,5 picomolar merket DNA-substrat i buffer A, og pipette 20 mikroliter perleoppheng i fortynnet DNA. Legg blandingen på en rotator i tre minutter. Etter de tre minuttene, last umiddelbart prøven inn i kanalen med en strømningshastighet på 10 mikroliter per minutt i 15 minutter, eller til tilstrekkelig perletethering observeres.Vask kanalen til alle frie perler ved å bytte innløpsrøret til et friskt rør av buffer A, og strøm den inn på 50 mikroliter per minutt i minst 10 minutter eller til ingen løse perler observeres. Og det er nyttig å bruke en inline ventil for å kutte strømmen og bytte slangen. Bytte rør i en jevn bevegelse og sørg for at væskenivåer i nye og gamle prøverør samsvarer for å unngå tilbakestrømning.Før du samler inn data, klargjør riktig konsentrasjon av DNA cleavage enzymet, og sett inn innløpsrøret i prøven. Senk magneten over strømningscellen. Sett pumpen til å injisere 80 mikroliter prøve ved 150 mikroliter per minutt og begynne datainnsamling.Ett minutt inn i datainnsamling, aktiver pumpen. Vist her er et representativt bilde av de bundet perlene før og etter reaksjonen. Dataanalyse ble utført for å kvantifisere antall perler som gjenstår bundet gjennom spaltningsreaksjonen.Denne teknikken ble brukt til å måle stedet spesifikke DNA cleavage priser av Nde1 for proteinkonsentrasjoner fra 0,25 til fire enheter per milliliter, og to forskjellige konsentrasjoner av magnesium. Hver tilstand ble replikert minst to ganger, med noen få 100 til 1000 bundet DNA er per eksperiment. Ved tilstrekkelig lave proteinkonsentrasjoner er frekvensen proporsjonal med protein og uavhengig av magnesium.For høye proteinkonsentrasjoner er frekvensen avhengig av magnesium, men uavhengig av proteinkonsentrasjon. Når du prøver denne protokollen, må du huske på at luftbobler i rør- og strømningskanalen kan kjøre eksperimentet. Pass på at du ikke lar luft komme inn i linjene mens du bytter slange, og degas alle buffere før bruk.Tilknytningsmetoden gjør det mulig for man å utforske effekten av spenning i DNA på reaksjonen. Dette kan oppnås ved å variere magnetstyrken eller bruke flyt under datainnsamling.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

En raskere, High Resolution, mtpa-GFP-baserte Mitokondrie Fusion Assay Innhente Kinetic Data om flere celler i parallell Bruke konfokalmikroskopi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening for små-molekyl modulatorer av Inderlige likeretter kaliumkanaler

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enkelt-molekyl Imaging of Gene Regulation<em&gt; In vivo</em&gt; Ved hjelp av Cotranslational Aktivering av Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generasjon av høy kvalitet Chromatin immunoprecipitation DNA Mal for High-throughput sekvensering (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Kombinere Single-molekyl Manipulasjon og bildebehandling for studier av protein-DNA interaksjoner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studerer DNA Looping av Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...