Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência do MCB-1715317.

1. Fazer a célula de fluxo
<ol><li>Lavando as tampas<ol>
<li>Coloque manchas em frascos de coloração e sonicate com etanol (EtOH), depois com 1 M KOH (por 30 min cada). Para evitar a precipitação KOH em EtOH, enxágue bem com ddH2O entre as lavagens.</li>
		<li>Repita tanto o EtOH quanto as etapas de lavagem KOH 1x para um número total de quatro lavagens (duas EtOH e duas KOH). Armazene tampas limpas em ddH2O em frascos de coloração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte os tubos de carga e saída ...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

O protocolo pode ser usado para medir a cinética de qualquer sistema SSDC, desde que a separação da vertente seja observada durante o experimento. A detecção do decote é afetada pela observação do desprendimento da conta amarrada e, portanto, marca o instante da separação do fio. Todas as etapas anteriores ocorrem antes da detecção do decote; assim, apenas o tempo total de trânsito é registrado.
O deslizamento de cobertura da célula de fluxo é funcionalizado através de adsorç...

O decote de DNA específico do local (SSDC) é um passo fundamental em muitas transações genômicas. Por exemplo, os sistemas de modificação de restrição bacteriana (RM)1 e CRISPR2 protegem as células contra ataques por phages e plasmídeos, reconhecendo e cortando DNA estranho em sequências específicas. No tipo II RM, as endonucleases de restrição (REs) reconhecem sequências curtas de 4 a 8 pares de bases (bp) através de interações proteicas-nucleicas3. Endonucleases associados ao CRISPR, como o Cas9, ligam-se a locais via hibridização do local alvo com crRNAs vinculados aos endonucleases4. A criação de quebras duplas encalhadas específicas do local (DSBs) também são o primeiro passo em muitos eventos de recombinação de DNA5. Por exemplo, a diversidade de regiões de ligação de antígenos criadas pela recombinação V(D)J requer o reconhecimento e o decote de locais de destino específicos6. Alguns transposons são conhecidos por atingir sequências específicas de DNA, bem como7. Não surpreende que muitos núcleos específicos do site envolvidos nesses processos, como o Cas9, sejam um componente-chave das tecnologias de edição de genes8. Além disso, novos endonucleases específicos do local (ou seja, núcleos de dedo de zinco9 e TALENS10) também foram projetados para editar genomas.
Muitos métodos têm sido empregados para medir a cinética do decote específico do local dos ácidos nucleicos. Estes incluem análise de gel, fluorescência11,,12e métodos baseados em sequenciamento13. Um grande avanço foi alcançado com o amarramento de microesferas, que permite que DSBs em moléculas únicas de DNA sejam detectados pelo movimento de uma conta após a separação da vertente. Nestes métodos, diferentes tipos de forças são empregadas para garantir a separação da vertente e o movimento do pós-decote da conta. Em um caso, armadilhas ópticas têm sido usadas para medir o decote do DNA pelo EcoRV14. Nesses experimentos, a busca de alvos é o objetivo da investigação, com condições otimizadas para que a vinculação específica do local seja a etapa limitante da taxa. Uma desvantagem das armadilhas ópticas é que apenas um único DNA pode ser observado de cada vez. Além disso, uma força de puxar grande periódica deve ser aplicada para testar a separação da vertente.
Outra técnica usa uma combinação de fluxo e forças magnéticas fracas para puxar a conta de forma contínua15. Desta forma, a difusão limitada do decote por NdeI é medida. O método utilizado permite a medição simultânea de várias centenas de DNAs ao mesmo tempo, permitindo que a significância estatística seja alcançada em um único experimento. Experimentos baseados em pinças magnéticas também foram usados. Em um desses estudos, foi estudada uma integração retroviral por meio da inclusão de um DSB na inserção oligonucleotídeo16. A integração bem sucedida resultou na incorporação do DSB no DNA amarrado e na perda da conta anexada. Em estudo semelhante da restrição do tipo III dependente do ATP EcoPI, dezenas de DNAs foram observados em um único experimento17. Pinças magnéticas têm a vantagem de que a tensão, bem como o looping de DNA, podem ser controlados e monitorados durante a reação.
Apresentado aqui é um método de molécula única altamente paralelo para medir cinética SSDC, que se aproveita de melhorias recentes no tethering em larga escala de DNAs. Este método é uma melhoria e extensão dos métodos anteriores usados para medir a replicação de DNA18, comprimento do contorno do DNA19e decote por REs15. Nesta técnica, DNAs lineares contendo uma única cópia da sequência de reconhecimento são preparados com biotina em uma extremidade e digoxigenina na outra. A biotina liga streptavidin, que é covalentemente ligado a uma microesfera paramagnética. Os complexos de contas de DNA são injetados em um canal microfluido que foi funcionalizado com fragmentos da FAB anti-digoxigenina. O DNA então se liga aos pontos de fixação da superfície através da ligação da digoxigenina aos fragmentos da FAB adsorvidas. Forças magnéticas fracas aplicadas com um ímã permanente impedem que a conta grude não especificamente na superfície. As amostras podem ser injetadas rapidamente (<30 s) no canal de fluxo para ativar a reação do decote. O fluxo é desligado durante a coleta de dados. À medida que cada DNA é cortado, o tempo exato do decote pode ser determinado registrando o quadro em que a conta se move para cima e para fora do plano focal do objetivo, desaparecendo assim do registro de vídeo. Uma contagem quadro a quadro de contas remanescentes pode ser usada para quantificar o progresso da reação.
Apresentado abaixo está o protocolo completo, bem como exemplos de dados coletados usando o NdeI. Como exemplo de como a técnica pode ser aplicada, as taxas de decote para uma série de concentrações proteicas são medidas em duas concentrações diferentes de magnésio, um coator metálico essencial. Embora esta aplicação do protocolo use NdeI, o método pode ser adaptado para uso com qualquer nuclease específica do local, variando o design do substrato de DNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

O decote de DNA específico do local (SSDC) é um passo fundamental em muitos processos celulares, e é crucial para a edição de genes. Este trabalho descreve um ensaio cinético capaz de medir SSDC em muitas moléculas de DNA únicas simultaneamente. DNAs substratos amarrados por contas, cada um contendo uma única cópia da sequência de destino, são preparados em um canal de fluxo microfluido. Um ímã externo aplica uma força fraca às contas paramagnéticas. A integridade de até 1.000 DNAs individuais pode ser monitorada visualizando as microesferas sob imagens de campo escuro usando um objetivo de ampliação de campo largo e baixa. A injeção de uma restrição endonuclease, NdeI, inicia a reação do decote. A microscopia de vídeo é usada para registrar o momento exato de cada decote de DNA observando o quadro em que a conta associada se move para cima e para fora do plano focal do objetivo. A contagem de contas quadro a quadro quantifica a reação, e um ajuste exponencial determina a taxa de reação. Este método permite a coleta de dados quantitativos e estatisticamente significativos sobre reações SSDC de molécula única em um único experimento.

Utilizando esta técnica, as taxas de SSDC de NdeI foram medidas para uma gama de concentrações proteicas (0,25-4,00 U/mL) em duas concentrações diferentes de magnésio (2 mM e 4 mM). Cada uma dessas condições foi replicada pelo menos duas vezes, com algumas centenas a 1.000 DNAs amarrados por experimento. A Figura 2 descreve o design experimental. A Figura 3 mostra exemplos de detalhes de coleta e análise de dados. A Figura 4</strong...

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Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Este protocolo pode ser aplicado a qualquer processo que resulte em quebras duplas de DNA encalhados, produz dados quantitativos detalhados sobre cinética. Embora este método tenha resolução de molécula única, ele mede até 1000 DNAs em um único experimento, fornecendo assim boas estatísticas. A aplicação primária deste método é estudar os mecanismos envolvidos na vinculação e modificação do DNA.Por exemplo, estamos interessados em estudar a busca de alvos de DNA, que é relevante para todas as proteínas de ligação de DNA. Ao tentar essa técnica pela primeira vez, lembre-se que as amarras de molécula única são delicadas, e uma vez forma, devem ser tratadas com cuidado. A proporção adequada de superfícies funcionalizadas é essencial.Há alguns truques para fazer o fluxo assim. Além de trocar tubos de amostra durante a coleta de dados, a demonstração visual pode ajudar alguém que é novo nesse procedimento. Para lavar os deslizamentos de cobertura, coloque-os em potes de coloração e sonice-os com etanol por 30 minutos.Enxágüe-os completamente com água desionizada e destilada, depois mergulhe-os em um hidróxido de potássio molar e sonicá-los por mais 30 minutos. Repita a sequência de lavagem, certificando-se de enxaguar os deslizamentos de cobertura com água após cada lavagem. Guarde as tampas limpas em frascos de coloração com água.Use uma navalha limpa para cortar tubos de carregamento e saída de oito centímetros de comprimento e inseri-los em orifícios em uma lâmina de vidro limpa. Epóxi a tubulação e deixe a cura por cinco minutos para fixá-lo. Aplique fita dupla face pré-cortada com o padrão do canal nas lâminas de vidro e suavize-a com fórceps plásticos para obter uma boa vedação.Retire a parte de baixo da fita e aplique um deslize de cobertura limpo, alisando-o com os fórceps. Em seguida, epóxi a borda da tampa escorregar para selar a célula de fluxo e deixá-la curar. Prepare o DNA rotulado para amarrar realizando PCR de acordo com as instruções do manuscrito.Em seguida, purifique o produto PCR com um kit de limpeza PCR. Prepare 10 mililitros de tampão A, e desgas-lo em um desiccador de vácuo por pelo menos uma hora. Para funcionalizar a célula de fluxo, injete 25 microliters de anti-digoxigenina e fragmentos fab em PBS, no canal de fluxo, usando uma ponta de carregamento de gel para caber na tubulação PE60.Incubar a célula de fluxo à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, puxe 0,5 mililitros de tampão A pelo canal com uma seringa, tomando o cuidado de não introduzir ar no canal. Então, mountain a célula de fluxo em um microscópio invertido.Ligue o tubo de saída a uma bomba de seringa e coloque o tubo de entrada em um tubo de micro centrífuga contendo tampão A.Puxe manualmente pelo menos 0,5 mililitros de tampão A para lavar o sistema e preparar a bomba. Em seguida, deixe a bomba funcionar a 10 microliters por minuto por pelo menos cinco minutos para equilibrar o sistema. Vórtice a garrafa de estoque de contas, e pipeta 1,6 microliters das contas em 50 microliters de tampão A, em seguida, vórtice-los novamente.Coloque as contas em um separador magnético e pipeta para fora do buffer. Suspendê-los em 50 microliters de tampão A e vórtice deles. Após a última lavagem, suspenda as contas em 100 microliters de tampão A para uma concentração final de 160 microgramas por mililitro.Prepare 480 microliters de 0,5 picomolar rotulado substrato de DNA no buffer A, e pipeta 20 microliters de suspensão de contas no DNA diluído. Coloque a mistura em um rotador por três minutos. Após os três minutos, carregue imediatamente a amostra no canal a uma vazão de 10 microliters por minuto durante 15 minutos, ou até que seja observada a amarração suficiente da conta.Lave o canal de todas as contas livres alternando o tubo de entrada para um tubo fresco de tampão A, e fluindo-o a 50 microliters por minuto por pelo menos 10 minutos ou até que não sejam observadas contas soltas. E é útil usar uma válvula inline para cortar o fluxo e trocar a tubulação. Comutação da tubulação em um movimento suave e certifique-se de que os níveis líquidos em tubos de amostra novos e antigos combinem para evitar o backflow.Antes de coletar dados, prepare a concentração correta da enzima de decote de DNA e insira o tubo de entrada na amostra. Abaixe o ímã sobre a célula de fluxo. Coloque a bomba para injetar 80 microliters de amostra a 150 microliters por minuto e inicie a coleta de dados.Um minuto na coleta de dados, ative a bomba. Mostrada aqui é uma imagem representativa das contas amarradas antes e depois da reação. A análise dos dados foi realizada para quantificar o número de contas que permanecem amarradas durante toda a reação do decote.Esta técnica foi utilizada para medir as taxas específicas de decote de DNA do local de Nde1 para concentrações proteicas que variam de 0,25 a quatro unidades por mililitro, e duas concentrações diferentes de magnésio. Cada condição foi replicada pelo menos duas vezes, com alguns 100 a 1000 tethered DNA é por experimento. Em concentrações proteicas suficientemente baixas, a taxa é proporcional à proteína e independente do magnésio.Para altas concentrações proteicas, a taxa depende do magnésio, mas independente da concentração proteica. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que bolhas de ar no canal de tubulação e fluxo podem executar o experimento. Certifique-se de não permitir qualquer ar nas linhas durante a troca de tubos e desgas todos os buffers antes de usar.O método de amarração permite explorar o efeito da tensão no DNA na reação. Isso pode ser alcançado variando a força do ímã ou aplicando fluxo durante a coleta de dados.

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Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...