Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грантом Национального научного фонда MCB-1715317.

1. Создание ячейки потока
<ol><li>Мытье крышки<ol>
<li>Место coverslips в окрашивание банки и sonicate с этанолом (EtOH), а затем с 1 M KOH (по 30 мин каждый). Чтобы избежать осадков KOH в EtOH, тщательно промойте ddH2O между мойки.</li>
		<li>Повторите как EtOH и KOH стиральные шаги 1x для общего числа четырех моет (два EtOH ?...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Протокол может быть использован для измерения кинетики любой системы SSDC, при условии, что разделение нити наблюдается в ходе эксперимента. Обнаружение расщепления зависит от наблюдения за отслоение привязали шарика и, следовательно, знаменует собой момент разделения нити. Все предыду...

Расщепление ДНК(SSDC) является ключевым шагом во многих геномных транзакциях. Например, системы бактериального ограничения модификации (RM)1 и CRISPR2 защищают клетки от атак фагов и плазмидов, распознавая и расщепляя иную ДНК в определенных последовательностях. В типе II RM, ограничения эндонуклеи (REs) распознают короткие 4-8 базовых пар (bp) последовательности через белково-нуклеиновой кислотывзаимодействий 3. СВЯЗАННЫе с CRISPR эндонуклеи, такие как Cas9, связываются с сайтами через гибридизацию целевого сайта с crRNAs, связанными с эндонуклеями4. Создание сайта конкретных двойных мель перерывов (DSBs) также являются первым шагом во многих событиях рекомбинацииДНК 5. Например, разнообразие антигенных связывающих областей, созданных рекомбинацией V(D)J, требует распознавания и расщепления конкретных целевыхобъектов 6. Некоторые транспозоны, как известно, нацелены на конкретные последовательности ДНК, атакже 7. Неудивительно, что многие ядра, связанные с конкретными участками, участвующие в этих процессах, такие как Cas9, являются ключевым компонентом технологий редактирования генов8. Кроме того, для редактирования геномов были также разработаны новые эндонуклеазы для конкретныхсайтов (т.е. ядра цинковых пальцев 9 и TALENS10).
Многие методы были использованы для измерения кинетики сайта конкретных расщепления нуклеиновых кислот. К ним относятся гель анализ, флуоресценция11,12, и секвенирования на основеметодов 13. Значительный прогресс был достигнут с привязыванием микробусов, что позволяет DSBs в отдельных молекул ДНК, которые будут обнаружены движением шарика после разделения нити. В этих методах, различные типы сил используются для обеспечения разделения нити и движения шарика после расщепления. В одном случае, оптические ловушки были использованы для измерения расщепления ДНК EcoRV14. В этих экспериментах целевой поиск является целью исследования, при этом условия оптимизированы таким образом, чтобы привязкой к конкретному сайту был шаг ограничения скорости. Одним из недостатков оптических ловушек является то, что только одна ДНК может наблюдаться одновременно. Кроме того, периодические большие силы потянув должны быть применены для проверки на разделение нити.
Другой метод использует сочетание потока и слабых магнитных сил, чтобы тянуть на шарик в непрерывной манере15. Таким образом, диффузия ограниченного расщепления NdeI измеряется. Используемый метод позволяет одновременно измерять сразу несколько сотен ДНК, что позволяет достичь статистической значимости в ходе одного эксперимента. Эксперименты на основе магнитных пинцетов также были использованы. В одном из таких исследований, ретровирусной интегразы был изучен в том числе DSB в вставке олигонуклеотид16. Успешная интеграция привела к включению DSB в привязанную ДНК и потере прикрепленного шарика. В аналогичном исследовании АТФ-зависимого типа III ограничения эндонуклеазы EcoPI, десятки ДНК наблюдались в одном эксперименте17. Магнитные пинцеты имеют то преимущество, что напряжение, а также цикл ДНК, можно контролировать и контролировать во время реакции.
Здесь представлен весьма параллельный метод одной молекулы для измерения кинетики SSDC, который использует недавние улучшения в крупномасштабных привязываниях ДНК. Этот метод является улучшение и расширение предыдущих методов, используемых дляизмерения репликации ДНК 18, длинаконтура ДНК 19, и расщепление REs15. В этом методе линейные ДНК, содержащие одну копию последовательности распознавания, готовятся с биотином на одном конце и дигоксигенином на другом. Биотин связывает стрептавидин, который ковалентно крепится к парамагнитной микробусу. ДНК-бисерные комплексы вводятся в микрофлюидный канал, который был функционализирован с анти-digoxigenin FAB фрагментов. Затем ДНК привязывается к точкам крепления поверхности через привязку дигоксигенина к адсорбированным фрагментам FAB. Слабые магнитные силы, применяемые с помощью постоянного магнита, не держат шарик от прилипания некондиентного к поверхности. Образцы могут быть введены быстро (Lt;30 s) в канал потока, чтобы активировать реакцию расщепления. Поток отключается во время сбора данных. Поскольку каждая ДНК расщепляется, точное время расщепления может быть определено путем записи кадра, в котором шарик движется вверх и из координационного плана цели, тем самым исчезая из видеозаписи. Для количественной оценки прогресса реакции можно использовать рамку за кадром, подсчитывая оставшиеся бусы.
Ниже приведен полный протокол, а также пример данных, собранных с помощью NdeI. В качестве примера того, как метод может быть применен, расщепление ставки для целого ряда концентраций белка измеряются в двух различных концентрациях магния, существенного кофактора металла. Хотя это применение протокола использует NdeI, метод может быть адаптирован для использования с любым сайтом конкретных нуклеазы путем изменения конструкции субстрата ДНК.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Расщепление ДНК (SSDC) является ключевым шагом во многих клеточных процессах, и это имеет решающее значение для редактирования генов. Эта работа описывает кинетический анализ, способный измерять SSDC во многих отдельных молекулах ДНК одновременно. Привязные бисером субстратные ДНК, каждый из которых содержит одну копию целевой последовательности, готовятся в канале микрофлюидного потока. Внешний магнит применяет слабую силу к парамагнитным бусинкам. Целостность до 1000 отдельных ДНК можно контролировать с помощью визуализации микробусов под темным полем изображения с помощью широкого поля, с низким увеличением цели. Инъекция эндонуклеазы ограничения, NdeI, инициирует реакцию расщепления. Видео микроскопия используется для записи точного момента каждого расщепления ДНК, наблюдая кадр, в котором связанный шарик движется вверх и из фокусной плоскости цели. Подсчет бисера кадр за кадром количественно определяет реакцию, и экспоненциальная подгонка определяет скорость реакции. Этот метод позволяет сбор количественных и статистически значимых данных о реакции одной молекулы SSDC в одном эксперименте.

Используя этот метод, SSDC ставки NdeI были измерены для диапазона концентраций белка (0,25-4,00 U/mL) в двух различных концентрациях магния (2 мМ и 4 мм). Каждое из этих условий было воспроизведено по крайней мере дважды, с несколькими сотнями до 1000 привязанных ДНК за эксперимент. Рисуно?...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Описан весьма параллельный метод измерения специфического участка расщепления ДНК на уровне одной молекулы. Этот протокол демонстрирует технику с использованием ограничения endonuclease NdeI. Метод может быть легко изменен для изучения любого процесса, что приводит к сайту конкретных расщепления ДНК.

Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Этот протокол может быть применен к любому процессу, что приводит к двойным мель ДНК перерывов, дает подробные количественные данные по кинетике. Хотя этот метод имеет разрешение одной молекулы, он измеряет до 1000 ДНК в одном эксперименте, обеспечивая тем самым хорошую статистику. Основным применением этого метода является изучение механизмов, участвующих в связывании и модификации ДНК.Например, мы заинтересованы в изучении целевого поиска ДНК, который имеет отношение ко всем связывающим белкам ДНК. При попытке этой техники в первый раз, помните, что одна молекула тросы деликатный, и как только форма, должны быть обработаны с осторожностью. Правильная доля функциональных поверхностей имеет важное значение.Есть несколько трюков для принятия потока так. Помимо переключения пробных трубок во время сбора данных, визуальная демонстрация может помочь тому, кто является новым для этой процедуры. Чтобы вымыть крышку скользит, поместите их в окрашивание банки и sonicate их с этанолом в течение 30 минут.Тщательно промойте их деионизированной и дистиллированной водой, затем погрузите их в один молярный гидроксид калия и sonicate их еще 30 минут. Повторите последовательность стирки, убедившись, что для полоскания крышки скользит с водой после каждой стирки. Храните очищенную крышку скользит в окрашивание банки с водой.Используйте чистую бритву, чтобы сократить восемь сантиметров в длину погрузки и выхода труб, и вставить их в отверстия в чистом стеклянном слайде. Epoxy трубки и пусть вылечить в течение пяти минут, чтобы обеспечить его. Нанесите двустороннюю ленту предварительно вырезать с узором канала на стеклянные слайды, и сгладить его с пластиковыми типсами для достижения хорошего уплотнения.Очистите отступить от ленты, и применить чистую крышку скольжения, сглаживая его с типсами. Затем, эпоксидной кромки крышки скольжения, чтобы запечатать поток ячейки и дайте ему вылечить. Подготовь помеченную ДНК для привязывания, выполняя ПЦР в соответствии с рукописными указаниями.Затем очистите продукт PCR с помощью комплекта очистки ПЦР. Приготовьте 10 миллилитров буфера А и дегазации его в вакуумном децикаторе, по крайней мере, на один час. Для функционализации потока ячейки, вводить 25 микролитров анти-digoxigenin и потрясающие фрагменты в PBS, в канал потока, используя гель загрузки отзыв, чтобы вписаться в PE60 трубки.Инкубировать ячейку потока при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации вытяните 0,5 миллилитров буфера А через канал со шприцем, заботясь о том, чтобы не вводить воздух в канал. Затем гора поток ячейки на перевернутый микроскоп.Подключите розетку к шприц-насосу и поместите входную трубку в трубку микро центрифуги, содержащую буфер A.Manually, потяните по крайней мере 0,5 миллилитров буфера А, чтобы промыть систему и загрунтовать насос. Затем дайте насосу работать на 10 микролитров в минуту, по крайней мере пять минут, чтобы уравночные системы. Vortex запас бутылку бисера, и пипетки 1,6 микролитров бисера в 50 микролитров буфера, а затем вихрь их снова.Поместите бисер на магнитный сепаратор и пипетки из буфера. Повторно приостанавливайте их в 50 микролитров буфера А и вихрем их. После последней стирки повторно приостанавливаем бисер в 100 микролитров буфера А для окончательной концентрации 160 микрограмм на миллилитр.Подготовка 480 микролитров 0,5 пикомолярного субстрата ДНК в буфере А и пипетки 20 микролитров суспензии шарика в разбавленную ДНК. Поместите смесь на ротатор в течение трех минут. После трех минут, немедленно загрузить образец в канал со скоростью потока 10 микролитров в минуту в течение 15 минут, или до тех пор, пока достаточно бисера привязывания наблюдается.Вымойте канал всех свободных бусин, переключив входную трубку на свежую трубку буфера А, и пропуская его в 50 микролитров в минуту, по крайней мере 10 минут или до тех пор, пока свободные бусы не наблюдаются. И это полезно использовать стационарный клапан, чтобы отрезать поток и переключение труб. Переключение труб в одном гладком движении и убедитесь, что уровни жидкости в новых и старых пробных трубок совпадают, чтобы избежать обратного потока.Перед сбором данных подготовьте правильную концентрацию фермента расщепления ДНК и вставьте в образец входную трубку. Опустите магнит над ячейкой потока. Установите насос для впрыски 80 микролитров образца на 150 микролитров в минуту и начать сбор данных.Через минуту после сбора данных активируйте насос. Здесь показано репрезентативное изображение привязанных бусин до и после реакции. Анализ данных был проведен для количественной оценки количества шариков, оставшихся привязанными на протяжении всей реакции расщепления.Этот метод был использован для измерения сайта конкретных ДНК расщепления ставки Nde1 для концентрации белка в диапазоне от 0,25 до четырех единиц на миллилитр, и две различные концентрации магния. Каждое условие было воспроизведено по крайней мере дважды, с несколькими 100 до 1000 привязали ДНК за эксперимент. При достаточно низких концентрациях белка скорость пропорциональна белку и не зависит от магния.При высоких концентрациях белка скорость зависит от магния, но не зависит от концентрации белка. При попытке этого протокола, имейте в виду, что пузырьки воздуха в трубе и поток канала может запустить эксперимент. Убедитесь в том, чтобы не допустить воздуха в линии при переключении труб, и дега все буферы перед использованием.Метод привязывания позволяет исследовать влияние напряжения в ДНК на реакцию. Это может быть достигнуто путем изменения силы магнита или применения потока во время сбора данных.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Принципы сайт-специфического рекомбиназы (SSR) Технология

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Визуализация одиночных молекул ДНК репликации с помощью флуоресцентной микроскопии

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Быстрее, высокое разрешение, млн. тонн в год-GFP на основе митохондриальной Анализ Fusion Приобретение кинетические данные нескольких ячеек в параллельный с помощью конфокальной микроскопии

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Одиночных молекул изображений регуляции генов<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Использование Cotranslational активацию путем расщепления (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Изучение ДНК Looping на одиночных молекул FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...