Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Science Foundation bidrag MCB-1715317.

1. Att göra flödescellen
<ol><li>Tvätta täckskydden<ol>
<li>Placera täcken i färgning burkar och sonikera med etanol (EtOH), sedan med 1 M KOH (för 30 min vardera). För att undvika KOH-nederbörd i EtOH, skölj noga med ddH2O mellan tvättar.</li>
		<li>Upprepa både EtOH och KOH tvättstegen 1x för totalt antal fyra tvättar (två EtOH och två KOH). Förvara rengjorda täcken i ddH2O i färgningsburkar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skär lastnings- och utgångsrör (8 cm långa) med hjälp av...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Protokollet kan användas för att mäta kinetiken i alla SSDC-system, förutsatt att strandseparationen observeras under experimentet. Detektion av klyvning påverkas av att observera lossning av den tjudp och markerar därför ögonblick av strandseparation. Alla föregående steg inträffar före detektionen av klyvningen; sålunda registreras endast den totala transittiden.
Flödescellens coverslip är funktionaliserad via icke-specifik adsorption av antikroppsprotein till det rena glaset....

Platsspecifik DNA-klyvning (SSDC) är ett viktigt steg i många genomiska transaktioner. Till exempel skyddar systemen bakteriell begränsningsändring (RM)1 och CRISPR2 cellerna från angrepp av fagen och plasmider genom att känna igen och klyver främmande DNA vid specifika sekvenser. I typ II RM känner restriction endonucleases (REs) igen korta 4–8 basparsekvenser (bp) via protein-nukleinsyrainteraktioner3. CRISPR-associerade endonukleaser, såsom Cas9, binder till webbplatser via hybridisering av målplatsen med crRNAs bundna till endonukleaserna4. Skapandet av platsspecifika dubbelsträngade raster (DSB) är också det första steget i många DNA-rekombinationshändelser5. Till exempel kräver den mångfald av antigenbindningsregioner som skapats genom V(D)J-rekombination att specifika målplatser 6 erkänns ochklyvningen. Vissa transposoner är kända för att rikta specifika DNA-sekvenser, samt7. Inte överraskande, många platsspecifika nukleaser som deltar i dessa processer, såsom Cas9, är en viktig komponent i genredigeringsteknik8. Dessutom har även nya platsspecifika endonucleaser (dvs. zinkfingernukleaserna9 och TALENS10) konstruerats för att redigera genom.
Många metoder har använts för att mäta kinetiken hos platsspecifika klyvning av nukleinsyror. Dessa inkluderar gelanalys, fluorescens11,12, och sekvensering baserade metoder13. Ett stort framsteg uppnåddes med tjudra av microbeads, som gör att DSBs i enstaka molekyler av DNA som skall upptäckas genom rörelse av en pärla efter strand separation. I dessa metoder används olika typer av krafter för att säkerställa strandseparation och rörelse av pärlan efter klyvning. I ett fall har optiska fällor använts för att mäta klyvning av DNA genom EcoRV14. I dessa experiment är målsökning målet för undersökningen, med villkor optimerade så att platsspecifika bindande är den takt begränsa steg. En nackdel med optiska fällor är att endast ett enda DNA kan observeras i taget. Dessutom måste en periodisk stor dragkraft appliceras för att testa för strandseparationen.
En annan teknik använder en kombination av flöde och svaga magnetiska krafter för att dra på pärlan på ett kontinuerligt sätt15. På detta sätt mäts diffusion begränsad klyvning av NdeI. Den metod som används möjliggör samtidig mätning av flera hundra DNAs på en gång, vilket möjliggör statistisk signifikans som skall uppnås i ett enda experiment. Experiment baserade på magnetisk pincett har också använts. I en sådan studie studerades en retroviral integrase genom att en DSB togs med i infogningen oligonukleotid16. Framgångsrik integration resulterade i införlivandet av DSB i tjudriga DNA och förlust av den bifogade pärlan. I en liknande studie av atp-beroende typ III begränsning endonuclease EcoPI, tiotals DNAs observerades i ett enda experiment17. Magnetiska pincetter håller fördelen att spänningen, liksom DNA-looping, kan kontrolleras och övervakas under reaktionen.
Presenteras här är en mycket parallell enda molekyl metod för att mäta SSDC kinetik, som drar nytta av de senaste förbättringarna i storskalig tjudra av DNAs. Denna metod är en förbättring och förlängning av tidigare metoder som används för att mäta DNA-replikation18, konturlängd av DNA19, och klyvning av REs15. I denna teknik, linjära DNAs som innehåller en enda kopia av igenkänningssekvensen är beredda med biotin i ena änden och digoxigenin i den andra. Biotinen binder streptavidin, som är kovalent fäst vid en paramagnetisk mikropärla. DNA-bead-komplexen injiceras i en mikrofluidisk kanal som har funktionaliserats med anti-digoxigenin FAB-fragment. DNA-tjuder därefter till ytbehandlatillsatsen pekar via bandet av digoxigeninen till de adsorberade FAB-fragmenten. Svaga magnetiska krafter appliceras med en permanent magnet hålla pärlan från att fastna icke-specifikt till ytan. Prover kan injiceras snabbt (<30 s) i flödeskanalen för att aktivera klyvningsreaktionen. Flödet stängs av under datainsamlingen. Eftersom varje DNA klyvs, kan den exakta tidpunkten för klyvning bestämmas genom att registrera den ram där pärlan rör sig upp och ut ur målets fokalplan och därmed försvinna från videoinspelningen. En bildruta-för-bildruta antal återstående pärlor kan användas för att kvantifiera reaktionsförloppet.
Presenteras nedan är det fullständiga protokollet samt exempel data som samlats in med hjälp av NdeI. Som ett exempel på hur tekniken kan tillämpas mäts klyvningshastigheter för en rad proteinkoncentrationer vid två olika koncentrationer av magnesium, en essentiell metallkofaktor. Även om denna tillämpning av protokollet använder NdeI, kan metoden anpassas för användning med alla platsspecifika nukleas genom att variera DNA-substratets utformning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Site-specifika DNA-klyvning (SSDC) är ett viktigt steg i många cellulära processer, och det är avgörande för genredigering. Detta arbete beskriver en kinetisk analys som kan mäta SSDC i många enstaka DNA-molekyler samtidigt. Bead-bundna substrat DNAs, var och en innehåller en enda kopia av målsekvensen, är beredda i en mikrofluidisk flödeskanal. En yttre magnet applicerar en svag styrka till de paramagnetic pärlorna. Integriteten hos upp till 1000 enskilda DNAs kan övervakas genom att visualisera microbeads under darkfield imaging med hjälp av ett brett fält, låg förstoring mål. Injicering av en begränsning endonuclease, NdeI, initierar klyvningsreaktionen. Videomikroskopi används för att registrera det exakta ögonblicket för varje DNA-klyvning genom att observera den ram där den tillhörande pärlan rör sig upp och ut ur målets fokalplan. Bildruta-för-bildruta pärla räkna kvantifierar reaktionen, och en exponentiell passform bestämmer reaktionshastigheten. Denna metod möjliggör insamling av kvantitativa och statistiskt signifikanta data på enmolekyl SSDC reaktioner i ett enda experiment.

Med hjälp av denna teknik mättes SSDC-satserna för NDEI för en rad proteinkoncentrationer (0,25–4,00 U/mL) vid två olika koncentrationer av magnesium (2 mM och 4 mM). Var och en av dessa villkor replikerades minst två gånger, med några hundra till 1000 bundna DNAs per experiment. Figur 2 beskriver den experimentella designen. I figur 3 visas exempel på uppgifter insamling och analys detaljer. Figur 4 illustrerar hur hasti...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

En mycket parallell metod för att mäta den platsspecifika klyvningen av DNA på singelmolekylnivå beskrivs. Detta protokoll visar tekniken med hjälp av begränsningen endonuclease NdeI. Metoden kan enkelt modifieras för att studera vilken process som helst som resulterar i platsspecifik DNA-klyvning.

Parallell hög genomströmning Single Molecule Kinetic assay för Site-specifika DNA-klyvning

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Detta protokoll kan tillämpas på alla process som resulterar i dubbla strandade DNA-brott, ger detaljerade kvantitativa data om kinetik. Även om denna metod har enstaka molekylupplösning, mäter den upp till 1000 DNAs i ett enda experiment, vilket ger bra statistik. Den primära tillämpningen av denna metod är att studera de mekanismer som är involverade i DNA-bindning och modifiering.Vi är till exempel intresserade av att studera DNA-målsökning, vilket är relevant för alla DNA-bindningsproteiner. När du försöker denna teknik för första gången, kom ihåg att enmolekyl tjuder är känsliga, och en gång form, måste hanteras med försiktighet. Rätt andel av funktionaliserade ytor är väsentlig.Det finns några knep för att göra flödet så. Förutom att byta provrör under datainsamling, visuell demonstration kan hjälpa någon som är ny till denna procedur. För att tvätta locket glider, placera dem i färgning burkar och sonikera dem med etanol i 30 minuter.Skölj dem noggrant med avjoniserat och destillerat vatten, sedan sänka ner dem i en molarkaliumhydroxid och sonikera dem i 30 minuter. Upprepa tvättsekvensen, se till att skölja locket glider med vatten efter varje tvätt. Förvara det rengjorda täcket i färgningsburkar med vatten.Använd en ren rakhyvel för att skära åtta centimeter lång lastning och utgångsrör, och sätt in dem i hål i en ren glasrutschkana. Epoxi slangen och låt bota i fem minuter för att säkra den. Applicera dubbelsidig tejp förskuren med kanalmönstret på glasglasen, och släta ut det med plasttenstänger för att uppnå en bra tätning.Skala av backningen av tejpen, och applicera en ren täcksli, släta ut den med tången. Sedan, epoxi kanten av locket glida för att täta flödet cellen och låt den bota. Förbered det märkta DNA:t för tjudra genom att utföra PCR enligt manuskriptriktningar.Sedan rena PCR-produkten med en PCR cleanup kit. Förbered 10 milliliter buffert A, och avgasa den i en vakuumdesiccator i minst en timme. För att funktionalisera flödescellen injicerar du 25 mikroliter anti-digoxigenin och fabfragment i PBS, i flödeskanalen, med hjälp av en gelladdningsspets för att passa in i PE60-slangen.Inkubera flödescellen i rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubationen, dra 0,5 milliliter buffert A genom kanalen med en spruta, var noga med att inte införa luft i kanalen. Sedan, berg flödet cellen på en inverterad mikroskop.Haka upp utloppsröret till en sprutpump, och sätt inloppsröret i ett mikrocentrifugrör som innehåller buffert A.Dra manuellt minst 0,5 milliliter buffert A för att spola systemet och prime pumpen. Låt sedan pumpen gå i 10 mikroliter per minut i minst fem minuter för att balansera systemet. Vortexa lagerflaskan med pärlor, och pipetten 1,6 mikroliter av pärlorna i 50 mikroliter av buffert A, sedan virvel dem igen.Placera pärlorna på en magnetisk separator och pipettera ut bufferten. Åter avbryta dem i 50 mikroliter av buffert A och virvel dem. Efter den sista tvätten, åter upphäva pärlorna i 100 mikroliter buffert A för en slutlig koncentration av 160 mikrogram per milliliter.Förbered 480 mikroliter av 0,5 picomolar märkt DNA substrat i buffert A, och pipetten 20 mikroliter av pärla suspension i det utspädda DNA. Placera blandningen på en rotator i tre minuter. Efter de tre minuterna, ladda omedelbart provet i kanalen med en flödeshastighet på 10 mikroliter per minut i 15 minuter, eller tills tillräcklig pärla tjudra observeras.Tvätta kanalen av alla fria pärlor genom att byta inloppsröret till ett färskt rör av buffert A, och flöda in den i 50 mikroliter per minut i minst 10 minuter eller tills inga lösa pärlor observerats. Och det är bra att använda en inline ventil för att skära av flödet och byta slangar. Omkopplingsslangar i en jämn rörelse och se till att vätskenivåerna i nya och gamla provrör stämmer för att undvika återflöde.Innan data samlas in, preparera korrekt koncentration av DNA-klyvningsenzym, och för inloppsröret i provet. Sänk magneten över flödescellen. Ställ in pumpen för att injicera 80 mikroliter prov med 150 mikroliter per minut och påbörja datainsamlingen.En minut in i datainsamlingen, aktivera pumpen. Visas här är en representativ bild av de uppbundna pärlor före och efter reaktionen. Dataanalys utfördes för att kvantifiera antalet pärlor som återstod uppbundna under hela klyvningsreaktionen.Denna teknik användes för att mäta platsen specifika DNA klyvning priser Nde1 för protein koncentrationer från 0,25 till fyra enheter per milliliter, och två olika koncentrationer av magnesium. Varje villkor replikerades minst två gånger, med några 100 till 1000 bundna DNA är per experiment. Vid tillräckligt låga proteinkoncentrationer är hastigheten proportionell mot protein och oberoende av magnesium.För högproteinkoncentrationer är hastigheten beroende av magnesium, men oberoende av proteinkoncentration. När du försöker detta protokoll, tänk på att luftbubblor i slangar och flöde kanal kan köra experimentet. Se till att inte släppa in någon luft i ledningarna medan du byter slang, och avgasar alla buffertar innan du använder.Den tjudra metoden gör det möjligt för en att utforska effekten av spänning i DNA på reaktionen. Detta kan uppnås genom att variera magnetstyrkan eller applicera flöde under datainsamlingen.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Principer för platsspecifika Recombinase (SSR) Teknik

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualisera enda molekyl DNA-replikering med fluorescensmikroskopi

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Direkt observation av enzymer Replikera DNA med en enda molekyl DNA Stretching analys

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Med hög kapacitet försockringen analys för lignocellulosa

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

En snabbare, högupplöst, MTPA-GFP-baserade Mitokondriell Fusion analys förvärva Kinetiska Uppgifter om flera celler parallellt med användning av konfokalmikroskopi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

High-throughput screening för små molekyler Modulatorer för aktiv kanaler Likriktare Kalium

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enda molekyl avbildning av genreglering<em&gt; In vivo</em&gt; Använda Cotranslational Aktivering genom klyvning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Av hög kvalitet om Kromatin Immunoprecipitation DNA Mall för hög genomströmning sekvensering (chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Kombinera enda molekyl manipulation och Imaging för studier av protein-DNA-interaktioner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studera DNA Looping med enda molekyl FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...