Name: parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı hibe MCB-1715317 tarafından desteklenmiştir.

1. Akış hücresi yapma
<ol><li>Kapakların yıkanması<ol>
<li>Boyama kavanozları ve etanol (EtOH) ile sonicate yerleştirin, sonra 1 M KOH (her biri için 30 dakika için). EtOH'da KOH yağışını önlemek için yıkarlar arasında ddH2O ile iyice durulayın.</li>
		<li>Toplam dört yıkama (iki EtOH ve iki KOH) sayısı için hem EtOH hem de KOH yıkama adımlarını 1x tekrarlayın. Temizlenmiş kapakları boyama kavanozlarında ddH2O'da saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizleme bir jile...

<ol>
	<li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+restriction+and+anti-restriction.">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+restriction+endonucleases:+structure+and+mechanism.">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+genetic+recombination:+hops,+flips,+and+flops.">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase.">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li><li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Specificity+of+CRISPR/Cas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy.">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease.">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li><li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease.">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li><li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2.">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li><li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins.">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li><li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage.">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409 (2016).</li><li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat.">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li><li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates.">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li><li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules.">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li><li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis.">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).</li><li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments.">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).</li></ol>

Protokol, deney sırasında iplikçik ayrımının gözlenmiş olması koşuluyla, herhangi bir SSDC sisteminin kinetiklerini ölçmek için kullanılabilir. Dekolte tespiti, bağlı boncuk kopması gözlemleyerek etkilenir ve bu nedenle iplikçik ayırma anında işaretler. Tüm önceki adımlar dekolte tespitinden önce meydana gelir; böylece, sadece toplam transit süresi kaydedilir.
Akış hücre örtüsü temiz cama antikor proteininin spesifik olmayan adsorpsiyonu ile işlevselhale geti...

Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok genomik işlemin önemli bir adımıdır. Örneğin, bakteriyel kısıtlama-modifikasyon (RM)1 ve CRISPR2 sistemleri belirli dizilerde yabancı DNA'yı tanıyarak ve yarıklayarak hücreleri faj ve plazmidlerin saldırısına karşı korur. Tip II RM'de, restriksiyon endokleazları (REs) protein-nükleik asit etkileşimleri ile kısa 4-8 baz çifti (bp) dizilerinitanırlar 3. Cas9 gibi CRISPR ilişkili ensonükleazlar, ensonükleazlara bağlı crRNA'lar ile hedef alanın hibridizasyonu yoluyla sitelere bağlanır4. Siteye özgü çift iplikçikli molaların (DSB'ler) oluşturulması da birçok DNA rekombinasyon olayının ilk adımıdır5. Örneğin, V(D)J rekombinasyon tarafından oluşturulan antijen bağlama bölgelerinin çeşitliliği belirli hedef sitelerin tanınmasını ve bölünmesini gerektirir6. Bazı transpozonlar belirli DNA dizileri hedef bilinmektedir, yanı sıra7. Beklendiği gibi, cas9 gibi bu süreçlerde yer alan birçok siteye özgü nükleazlar, gen düzenleme teknolojileri8önemli bir bileşenidir. Buna ek olarak, yeni siteye özgü endokleazlar (örneğin, çinko parmak nükleazları9 ve TALENS10)da genomları döşeyecek şekilde tasarlanmıştır.
Birçok yöntem nükleik asitlerin siteye özgü dekolte kinetik ölçmek için kullanılmıştır. Bu jel analizi dahil, floresan11,12, ve sıralama tabanlı yöntemler13. Mikroboncukların tethering ile büyük bir ilerleme sağlandı, hangi DNA'nın tek moleküllerinde DSB'ler iplikçik ayrımı ndan sonra bir boncuk hareketi ile tespit edilmesine olanak sağlar. Bu yöntemlerde, boncuk sonrası dekoltenin iplikçik ayrıştırılması ve hareketini sağlamak için farklı kuvvet türleri kullanılır. Bir durumda, optik tuzaklar EcoRV14tarafından DNA bölünmesi ölçmek için kullanılmıştır. Bu deneylerde, hedef arama araştırmanın amacıdır ve siteye özgü bağlamanın oranı sınırlayan adım olması için koşullar optimize edilebistir. Optik tuzakların bir dezavantajı da aynı anda sadece tek bir DNA'nın gözlemlenebildiğidir. Buna ek olarak, iplikçik ayrımı için test etmek için periyodik büyük çekme kuvveti uygulanmalıdır.
Başka bir teknik sürekli bir şekilde boncuk çekmek için akış ve zayıf manyetik kuvvetlerin bir arada kullanır15. Bu şekilde NdeI ile difüzyon sınırlı dekolte ölçülür. Kullanılan yöntem aynı anda birkaç yüz DA'nın eşzamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlayarak, tek bir deneyde istatistiksel anlamlıya ulaşılmasını sağlar. Manyetik cımbız üzerine deneyler de kullanılmıştır. Bu tür bir çalışmada, bir retroviral integrase ekleme oligonükleotid bir DSB dahil edilerek çalışıldı16. Başarılı entegrasyon, DSB'nin bağlı DNA'ya dahil edilmesi ve ekli boncuk kaybıile sonuçlandı. ATP'ye bağlı tip III restriksiyon endokleaz EcoPI benzer bir çalışmada, tek bir deneyde onlarca DNA gözlenmiştir17. Manyetik cımbız, reaksiyon sırasında gerilimin yanı sıra DNA döngünün de kontrol edilebildiği ve izlenebileceği avantajını elinde tutar.
Burada sunulan SSDC kinetik ölçmek için son derece paralel tek molekülyöntemi, hangi BÜYÜK ÖLÇEKLI TEthering büyük ölçekli tethering son gelişmeler yararlanır. Bu yöntem, DNA replikasyonu18,DNA19kontur uzunluğu ve REs15ile dekolte ölçmek için kullanılan önceki yöntemlerin bir iyileşme ve uzantısıdır. Bu teknikte, tanıma dizisinin tek bir kopyasını içeren lineer DNA'lar bir uçta biotin, diğer ucunda digoksijenin ile hazırlanır. Biotin streptavidin bağlar, kovalent bir paramanyetik mikrop bağlı. DNA-boncuk kompleksleri anti-digoksigenin FAB parçaları ile işlevselleştirilmiş bir mikroakışkan kanal içine enjekte edilir. DNA daha sonra digoksigenin adsorbe FAB parçalarına bağlanması yoluyla yüzey eki noktalarına bağlanır. Kalıcı bir mıknatısla uygulanan zayıf manyetik kuvvetler, boncuk ların özellikle yüzeye yapışmamasını önlüyor. Numuneler dekolte reaksiyonu etkinleştirmek için akış kanalına hızla (<30 s) enjekte edilebilir. Veri toplama sırasında akış kapatılır. Her DNA'nın ayrılmasıyla, dekoltenin tam zamanı, reklamın hedefin odak planının yukarı ve dışına doğru hareket ettiği çerçevenin kaydedilmesi yle belirlenebilir ve böylece video kaydından kaybolur. Kalan boncukların kare kare sayısı reaksiyon ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir.
Aşağıda sunulan tam protokol yanı sıra NdeI kullanılarak toplanan örnek veriler. Tekniğin nasıl uygulanabildiğini örnek olarak, bir dizi protein konsantrasyonu için bölünme oranları, önemli bir metal kofaktör olan iki farklı magnezyum konsantrasyonu ile ölçülür. Protokolün bu uygulaması NdeI'yi kullansa da, yöntem DNA substrat tasarımını değiştirerek herhangi bir yere özgü nükleaz ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 minute Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-digoxigenin FAB fragments</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11214667001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and software</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>GRYPHAX SUBRA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>Vernier Inc.</td>
			<td>LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td>SA-S-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife printer</td>
			<td>Silhouette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 DNA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N4040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne streptavidin beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluronic F-127</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>P305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-20</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing PE-60</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Mastermix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.5&#34; OD 0.25&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rare earth magnet 0.75&#34; OD 0.5&#34; ID</td>
			<td>National Imports</td>
			<td>NSN0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Genie Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein from bovine Milk</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel high throughput single molecule kinetic assay for site-specific dna cleavage

Siteye özgü DNA bölünmesi (SSDC) birçok hücresel süreçte önemli bir adımdır ve gen düzenleme için çok önemlidir. Bu çalışma, aynı anda birçok tek DNA moleküllerinde SSDC ölçme yeteneğine sahip bir kinetik töz açıklar. Her biri hedef sıranın tek bir kopyasını içeren boncuk-bağlı substrat DNA'ları mikroakışkan akış kanalında hazırlanır. Harici mıknatıs paramanyetik boncuklar için zayıf bir kuvvet uygular. 1.000'e kadar ayrı DNA'nın bütünlüğü, geniş alan, düşük büyütme hedefi kullanılarak karanlık alan görüntüleme siperinde mikroboncukların görselleştirilmesiyle izlenebilir. Bir kısıtlama endonükleaz enjekte, NdeI, dekolte reaksiyonu başlatır. Video mikroskobu, ilişkili boncuk hedefin odak düzleminin yukarı ve dışına hareket ettiği çerçeveyi gözlemleyerek her DNA bölünmesinin tam anını kaydetmek için kullanılır. Kare kare boncuk sayma reaksiyonu ölçer ve üstel uyum tepki hızını belirler. Bu yöntem, tek bir deneyde tek moleküllü SSDC reaksiyonları hakkında nicel ve istatistiksel olarak anlamlı verilerin toplanmasına olanak sağlar.

Bu teknik kullanılarak, SSDC ndeI oranları iki farklı magnezyum konsantrasyonlarında (2 mM ve 4 mM) çeşitli protein konsantrasyonları (0.25-4.00 U/mL) olarak ölçüldü. Bu koşulların her biri deney başına birkaç yüz ila 1.000 bağlı NA'larla en az iki kez çoğaltıldı. Şekil 2 deneysel tasarımı tanımlar. Şekil 3 veri toplama ve analiz ayrıntıları örneklerini gösterir. Şekil 4, magnezyumun iki konsantrasy...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage at JoVE.com

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Bu protokol, çift iplikçikli DNA kırılmaları ile sonuçlanan, kinetik hakkında ayrıntılı nicel veriler sağlayan herhangi bir işleme uygulanabilir. Bu yöntem tek molekül çözünürlüğüne sahip olmasına rağmen, tek bir deneyde 1000 DNA'ya kadar ölçer ve böylece iyi istatistikler sağlar. Bu yöntemin birincil uygulaması DNA bağlama ve modifikasyon ile ilgili mekanizmaları incelemektir.Örneğin, tüm DNA bağlayıcı proteinlerle ilgili DNA hedef aramasını incelemek le ilgileniyoruz. Bu tekniği ilk kez denerken, tek moleküllü teterlerin hassas olduğunu ve bir kez form un dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğini unutmayın. İşlevselleştirilmiş yüzeylerin doğru oranı esastır.Akışı yapmak için birkaç püf noktaları vardır. Veri toplama sırasında örnek tüpleri değiştirmenin yanı sıra, görsel gösteri bu yordamda yeni olan birine yardımcı olabilir. Kapak fişleri yıkamak için, boyama kavanoz yerleştirin ve 30 dakika etanol ile sonicate.Iyice deiyonize ve distile su ile durulayın, sonra bir azı lı potasyum hidroksit onları batırın ve 30 dakika daha sonicate. Yıkama sırasını tekrarlayın, her yıkamadan sonra kapak kaymasını suyla durulayın. Temizlenmiş kapak fişlerini boya kavanozlarında su yla birlikte saklayın.Sekiz santimetre uzunluğundaki yükleme ve çıkış tüplerini kesmek ve temiz bir cam kaydıraktaki deliklere yerleştirmek için temiz bir jilet kullanın. Epoksi tüp ve güvenli beş dakika boyunca tedavi sağlar. Cam slaytlar için kanal deseni ile çift taraflı bant önceden kesilmiş uygulayın ve iyi bir mühür elde etmek için plastik çifenler ile pürüzsüz.Teyp ten geri soyma ve temiz bir kapak kayma uygulayın, forceps ile yumuşatma. Daha sonra, epoksi kapak kenarı akış hücre mühür ve tedavi sağlar kayma. El yazması talimatlara göre PCR gerçekleştirerek tethering için etiketli DNA hazırlayın.Ardından PCR ürününü PCR temizleme kitiyle temizle 10 mililitre tampon A hazırlayın ve vakum lu kurutucuda en az bir saat gazlayın. Akış hücresini işlevselleştirmek için, PE60 borusu içine sığacak bir jel yükleme ucu kullanarak, PBS anti-digoksigenin ve fab parçaları 25 mikrolitre enjekte akış kanalına.Akış hücresini oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, 0,5 mililitre lik tampon A'yı şırınga ile kanaldan geçirin ve kanala hava sokmamaya özen çekin. Sonra, ters bir mikroskop üzerinde akış hücresi dağ.Çıkış tüpünü şırınga pompasına bağlayın ve giriş tüpünü tampon A içeren mikro bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra pompa sistemi dengelemek için en az beş dakika boyunca dakikada 10 mikrolitre çalışmasına izin verin. Girdap boncuk stok şişe, ve pipet 1.6 mikrolitre boncuk tampon A 50 mikrolitre içine, sonra tekrar girdap.Boncukları manyetik ayırıcıya ve pipete tamponun dışına yerleştirin. 50 mikrolitre tampon A'da tekrar askıya alın ve girdap haline getirin. Son yıkamadan sonra, mililitre başına 160 mikrogram lık son konsantrasyon için 100 mikrolitre tampon A'daki boncukları yeniden askıya alın.Tampon A'da 0,5 picomolar etiketli DNA substratı ve seyreltilmiş DNA'ya 20 mikrolitre boncuk süspansiyonu pipet içip 480 mikrolitre hazırlayın. Karışımı üç dakika rotator üzerine yerleştirin. Üç dakika sonra, numuneyi dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızıyla 15 dakika veya yeterli boncuk tethering işeyinceye kadar hemen kanala yükleyin.Giriş tüpünü yeni bir tampon A tüpüne çevirerek ve dakikada 50 mikrolitre de en az 10 dakika veya gevşek boncuk lar gözlemlenmeyene kadar akarak tüm ücretsiz boncukların kanalını yıkayın. Ve akışı kesmek ve boru geçiş için bir satır lı vana kullanmak yararlıdır. Boruları tek bir düzgün hareketle değiştirin ve geri akışı önlemek için yeni ve eski numune tüplerindeki sıvı seviyelerinin eşleştirdiğinden emin olun.Veri toplamadan önce, DNA bölünme enziminin doğru konsantrasyonuna hazırlayın ve giriş tüpünü numuneye takın. Mıknatısı akış hücresi nin üzerine indirin. Pompayı dakikada 150 mikrolitre numune enjekte etmeye ve veri toplamaya başlayacak şekilde ayarlayın.Veri toplamaya bir dakika, pompayı çalıştırın. Burada gösterilen tepki öncesi ve sonrası bağlı boncuk temsili bir görüntüdür. Dekolte reaksiyonu boyunca bağlı kalan boncuk sayısını ölçmek için veri analizi yapıldı.Bu teknik, mililitrebaşına 0,25 ila dört birim arasında değişen protein konsantrasyonları ve iki farklı magnezyum konsantrasyonu için Nde1'in bölgeye özgü DNA bölünme oranlarını ölçmek için kullanılmıştır. Her durum en az iki kez çoğaltıldı, deney başına birkaç 100 ila 1000 bağlı DNA ile. Yeterince düşük protein konsantrasyonlarında, oranı protein ile orantılı ve magnezyum bağımsızdır.Yüksek protein konsantrasyonları için, oranı magnezyum bağlıdır, ancak protein konsantrasyonu bağımsız. Bu protokolü denerken, tüp ve akış kanalındaki hava kabarcıklarının deneyi çalıştırabileceğini unutmayın. Boruyu değiştirirken hatlara hava girmesine izin vermemeye ve kullanmadan önce tüm arabellekleri gazdan arındırmaya devam edin.Tethering yöntemi bir reaksiyon üzerinde DNA gerginliği etkisini keşfetmek için izin verir. Bu, mıknatısın mukavemetinin değişmesi veya veri toplama sırasında akış uygulanması ile elde edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...