Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح من المعهد الوطني للصحة العقلية (R00MH103531 و R01MH116901 إلى J.A.) ، ومنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعهد الوطني للطب العام (T32GM007635 إلى S.R.) ، وزمالات ليدا هيل جيليام للدراسة المتقدمة (GT11021 إلى S.R.). نشكر الدكتور كيفن وولفري على المساعدة في المجهر، والدكتور ك أولريش باير لاستخدام مجهره النيففلورسنت، وتوماس سودهوف (جامعة ستانفورد) لLRRTM2 بلاسميد.

1. خلية ثقافة وtransfection
<ol><li>جعل وسائط الخلية HEK مع DMEM، 1x (تعديل دولبيككو من المتوسط النسر) تكملها مع 4.5 ز / ل الجلوكوز، L-الجلوتامين والصوديوم بيروفات و 10٪ FBS. مرشح معقمة.</li>
	<li>يحدد مسبقاً الأحرف اللينة والمستقبلات المناسبة لتشايس التجميع. ملاحظة: Neurexin3α SS4+/ - وأحد اليغانات المعروفة، LRRTM2، تم اس...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

تشريح البروتين البروتينية التفاعلات التي تحدث في عبر خلال التصاق الخلية يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة في العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تشكيل وظيفة وصيانة نقاط الاشتباك العصبي أثناء النضج وإعادة عرض. الآثار المترتبة على التفاعلات من خلية إلى خلية توسيع نطاقها ...

التفاعلات متشابك تسهيلها من قبل جزيئات التصاق متشابك هي الأساس لتطوير وتنظيم ومواصفات وصيانة وظيفة من نقاط الاشتباك العصبي وتوليد الشبكات العصبية. ويتزايد بسرعة تحديد جزيئات التصاق الخلايا المتحولة؛ وبالتالي، من المهم بشكل أساسي تحديد الشركاء الملزمين وفهم كيفية تفاعل جزيئات الالتصاق الجديدة هذه مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، حددت تسلسل الجينوم الطفرات في العديد من هذه الجزيئات التصاق التي ترتبط عادة إلى العديد من الاضطرابات العصبية النمائية، العصبية والنفسية،والإدمان 1. الطفرات في الجينات التي رمز لجزيئات التصاق الخلايا متشابك قد تغير بشكل ضار التفاعلات عبر وقد تسهم في التعديلات فيزيائية المرضية في تشكيل المشبك أو الصيانة.
توجد مقايسات متعددة لتقييم كمي تفاعلات البروتين والبروتين مثل قياس السعرات الحرارية isothermal، dichroism دائري، الرنين البلازمونالسطحي 2 وعلى الرغم من الكمية في الطبيعة، لديهم عدة قيود. أولاً، تتطلب بروتيناً مؤتلفاً، وتطالب أحياناً بخطوات تنقية طويلة ومملة. ثانيا، تتطلب هذه الكفاءات معدات متخصصة متطورة وخبرة فنية. ثالثاً، يمكن أن تبالغ في تقدير مدى الربط لأنها تسمح لكل من رابطة الدول المستقلة والتفاعلات العابرة بين البروتينات المربوطة بشكل طبيعي إلى غشاء في الجسم الحي. هنا نقترح اختبار بسيط وسريع نسبيا أن الاختبارات حصرا التفاعلات عبر.
للتحايل على العديد من المضاعفات المرتبطة بمقايس البروتين النقي، قمنا بتحسين تحليل تفاعل البروتين القائم على الخلايا الذي يلخص التفاعلات عبر في نظام الخلايا غير المغايرة. وقد سبق استخدام هذا الفحص في أشكال مختلفة لدراسة التفاعلات عبر الخلايا. في هذا النهج، يتم نقل جزيئات التصاق الخلية المرشحة إلى خلايا HEK293T. في الظروف الفسيولوجية، خلايا HEK293T لا تظهر التجميع الذاتي، مما يجعلها نماذج مثالية لهذا الفحص. ومع ذلك، عندما يتم الجمع بين مجموعات من الأفراد من خلايا HEK التعبير عن مستقبلات ويغاند، فإن ربط المستقبلات وقواد ليغاند تجميع خلايا HEK أن يحدث. ويتم هذا التجميع حصرياً عن طريق التفاعلات عبر، وعادة ما يكون قابلاً للملاحظة في عشرات الدقائق. لا يلزم اتخاذ خطوات لتنقية البروتين في هذه الطريقة، وتعتمد كفاءة الطريقة على النموذج الذي يتم فيه دمج مجموعات خلايا HEK التي تعبر عن جزيئات التصاقها، ثم يتم تصويرها بعد عشرات الدقائق فقط. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا، حيث لا الأجسام المضادة ولا معدات مكلفة مطلوبة. المعدات الوحيدة المطلوبة للحصول على البيانات هي مجهر فلوري قياسي. ميزة إضافية لهذا المقايسة القائمة على الخلية هي القدرة على فحص بسرعة تأثير الطفرات نقطة ذات الصلة المرض على التفاعلات عبر. ويمكن إجراء ذلك عن طريق نقل خلايا HEK مع cDNAs من المتغيرات المتحولة من البروتين من الفائدة.
في هذا البروتوكول، نقدم مثالاً نتحقق فيه مما إذا كانت طفرة الميزنس في Neurexin3α (Neurexin3αA687T)،التي تم تحديدها في مريض تم تشخيصه بإعاقة ذهنية عميقة والصرع، يغير التفاعلات في ترانس مع بروتين تكرار الغشاء اللين الغني باليوسين 2 (LRRTM2). Neurexin3α هو عضو في الأسرة المحفوظة تطوريا من الجزيئات presynaptic الخلية التصاق وبينما عمل مؤخرا قد حددت أدوار متعددة في المشبك3,4,5,6,7, فهمنا متشابك من هذا الجزيء وجميع أعضاء الأسرة neurexin لا تزال غير مكتملة. LRRTM2 هو عبارة عن بروتين التصاق الخلايا بعد التصاقات ما بعد التصاقات التي تشارك في تشكيل المشبك العصبي والصيانة8,9,10. الأهم من ذلك، LRRTM2 يتفاعل حصرا مع isoforms neurexin التي تفتقر إلى موقع لصق 4 exon البديل (SS4-) ولكن ليس مع isoforms neurexin التي تحتوي على موقع لصق 4 البديلة exon (SS4 +). يقع الطفرة البشرية (A687T) التي تم تحديدها في Neurexin3α في منطقة خارج الخلية غير مدروسة يتم حفظها تطورياً ويتم الحفاظ عليها بين جميع نويات ألفا7. كما تم تأسيس التفاعل بين هذين الجزيئات8,9,11, طرحنا السؤال: هل القدرة على الربط من Neurexin3α SS4- إلى LRRTM2 غيرت بواسطة A687T نقطة طفرة؟ وكشفت هذه الأقوال أن طفرة نقطة A687T عززت بشكل غير متوقع تجميع Neurexin3α إلى LRRTM2 مما يشير إلى أن المنطقة خارج الخلية التي تقع فيها الطفرة النقطة، تلعب دورا في التوسط التفاعلات عبرسينابتيك.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

التفاعلات البروتينية في الواجهات الخلوية تملي العديد من النتائج البيولوجية التي تتراوح بين تطوير الأنسجة وتطور السرطان إلى تشكيل المشبك العصبي والصيانة. العديد من هذه التفاعلات الأساسية تحدث في مغايرة وعادة ما يتم الناجمة عن التفاعلات غير المتغايرة أو المثلية بين الخلايا التي تعبر عن أزواج الربط الراسية الغشاء. توضيح كيف الطفرات المرض ذات الصلة تعطيل هذه التفاعلات البروتين الأساسية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عدد لا يحصى من حقول بيولوجيا الخلايا. العديد من البروتين البروتين التفاعل المقايسة لا عادة توضيح بين رابطة الدول المستقلة والتفاعلات عبر, مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مدى الربط الذي يحدث في الجسم الحي وينطوي على تنقية كثيفة العمالة من البروتين و / أو معدات الرصد المتخصصة. هنا، نقدم بروتوكول بسيط الأمثل الذي يسمح لمراقبة وكمية التفاعلات عبر فقط دون الحاجة إلى تنقية البروتين طويلة أو المعدات المتخصصة. يتضمن فحص تجميع خلايا HEK خلط مجموعتين مستقلتين من خلايا HEK، يعبر كل منهما عن أربطة مزدوجة مُلزمة بالغشاء. بعد فترة حضانة قصيرة، يتم تصوير العينات ويتم تحديد المجاميع الناتجة.

طفرة A687T يزيد Neurexin3α SS4- ملزمة LRRTM27 للتحقيق في كيفية تأثر التفاعلات بين الخلايا من اثنين من البروتينات متشابك المعروفة من خلال إدخال طفرة نقطة وجدت في المريض مع الإعاقة الفكرية والصرع، استخدمنا أعلاه هيك خلية تجميع المقايسة(الشكل 1). وقد تم نقل الخلايا وفقا ل...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

معايرة تعبير حسي كيميائي السطحية من المستقبلات في خلايا غيروي

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

إضفاء الطابع المحلي على البروتين في 3D الجذعية العصبية خلية الثقافة : منهجية التصور الهجين

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Peering into the Dynamics of Social Interactions: Measuring Play Fighting in Rats

التناظر في ديناميات التفاعلات الاجتماعية: العب قياس القتال في الفئران

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

خفيفة الوزن، القائم على نظام سماعات لمعالجة ملاحظات السمعية في العصافير

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; النظام النموذجي للدراسات Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

استخدام كاسباس المتعدد الفحص لتحديد موت الخلايا المبرمج في المهاد الخليوي نموذج

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...