Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Tilskud fra National Institute of Mental Health (R00MH103531 og R01MH116901 til J.A.), en prædoc-uddannelse Grant fra National Institute of General Medicine (T32GM007635 til S.R.), og en Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 til S.R.). Vi takker Dr. Kevin Woolfrey for hjælp med mikroskopet, Dr. K Ulrich Bayer for brugen af hans epifluorescerende mikroskop, og Thomas Südhof (Stanford University) for LRRTM2 plasmid.

1. Cellekultur og oversættelse
<ol><li>Gør HEK celle medier med DMEM, 1x (Dulbecco's Ændring af Eagle's Medium) suppleret med 4,5 g / L glukose, L-glutamin & natrium pyruvat og 10% FBS. Sterilt filter.</li>
	<li>Forudbestemme egnede ligands og receptorer til sammenlægning assay. BEMÆRK: Neurexin3α SS4+/- og en af dens kendte ligands, LRRTM2, blev anvendt i denne undersøgelse. Ligands og receptorer af interesse blev udtrykt fra cDNAAs i pcDNA3.1. En Gibson-samling blev brugt til at indsætte Neurexin3α i pcDN...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

Dissekering af proteinproteininteraktioner, der forekommer i trans under cellevedhæftning, kan føre til en bedre forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for grundlæggende cellulære processer, herunder dannelse, funktion og vedligeholdelse af synapser under modning og ombygning. Konsekvenserne af celle-til-celle interaktioner udvide ud over neurobiologi og har bredere roller i signaltransduktion, celle migration og væv udvikling14. Afvigelser i celle vedhæftning kan for...

Synaptiske interaktioner, der lettes af synaptiske vedhæftningsmolekyler, er grundlæggende for udvikling, organisation, specifikation, vedligeholdelse og funktion af synapser og generering af neurale netværk. Identifikationen af disse transsynaptiske celle vedhæftning molekyler er hastigt stigende; Derfor er det grundlæggende vigtigt at identificere bindende partnere og forstå, hvordan disse nye vedhæftningsmolekyler interagerer med hinanden. Derudover har genomsekvensering identificeret mutationer i mange af disse vedhæftningsmolekyler, der er almindeligt forbundet med et væld af neuroudviklingsmæssige, neuropsykiatriske og afhængighedsforstyrrelser1. Mutationer i gener, der koder for synaptiske cellevedhæftningsmolekyler, kan skade transinteraktioner og kan bidrage til patofysiologiske ændringer i synapsedannelse og eller vedligeholdelse.
Der findes flere analyser til kvantitativ vurdering af proteinproteininteraktioner såsom isotermisk kalorimetri, cirkulær dikhroisme, overfladeplasmonresonans2, og selv om de er kvantitative, har de flere begrænsninger. For det første kræver de rekombinant protein, nogle gange krævende lange og kedelige rensningstrin. For det andet kræver de sofistikeret specialiseret udstyr og teknisk ekspertise. For det tredje kan de overvurdere omfanget af binding, da de giver mulighed for både cis og trans interaktioner mellem proteiner, der er naturligt bundet til en membran in vivo. Her foreslår vi en enkel og relativt hurtig analyse, der udelukkende tester transinteraktioner.
For at omgå mange af de komplikationer, der er forbundet med rensede proteinanalyser, har vi optimeret en cellebaseret proteininteraktionsanalyse, der opsummerer transinteraktioner i et reduceret heterologt cellesystem. Denne analyse har tidligere været brugt i forskellige former til at studere transcellulære interaktioner. I denne tilgang, kandidat celle vedhæftning molekyler er transfected i HEK293T celler. Ved fysiologiske forhold udviser HEK293T-celler ikke selvsammenlægning, hvilket gør dem eksemplariske modeller til denne analyse. Men når individuelle populationer af HEK-celler, der udtrykker receptor og ligand, kombineres, tvinger bindingen af receptoren og ligand sammenlægningen af HEK-celler til at forekomme. Denne sammenlægning formidles udelukkende af transinteraktioner og kan normalt observeres på snesevis af minutter. Der kræves ingen proteinrensningstrin i denne metode, og metodens effektivitet afhænger af det paradigme, at populationer af HEK-celler, der udtrykker cognate-vedhæftningsmolekyler, kombineres og derefter afbildes kun få minutter senere. Derudover er denne metode relativt billig, da hverken antistoffer eller dyrt udstyr er påkrævet. Det eneste udstyr, der kræves til erhvervelse af data, er et standard fluorescerende mikroskop. En yderligere fordel ved denne cellebaserede analyse er evnen til hurtigt at screene effekten af sygdomsrelevante punktmutationer på transinteraktioner. Dette kan gøres ved at transfektere HEK-celler med cDA'er af de mutante varianter af det protein, der er af interesse.
I denne protokol præsenterer vi et eksempel, hvor vi undersøger, om en missensemutation i Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificeret hos en patient diagnosticeret med dyb intellektuel handicap og epilepsi, ændrer interaktioner i trans med leucinrigt repeat transmembraneprotein 2 (LRRTM2). Neurexin3α er medlem af den evolutionært bevarede familie af præsynaptiske celle-vedhæftning molekyler og mens de seneste arbejde har identificeret flere roller på synapse3,4,5,6,7, vores synaptiske forståelse af dette molekyle og alle medlemmer af neurexin familien forbliver ufuldstændig. LRRTM2 er et excitatorisk postsynaptisk celle vedhæftningsprotein , der deltager i synapsedannelse og vedligeholdelse8,9,10. Det er vigtigt, at LRRTM2 udelukkende interagerer med neurexin-isoformer, der mangler splejsningsstedet 4 alternative exon (SS4-), men ikke med neurexin-isoformer, der indeholder splejsningsstedet 4 alternative exon (SS4+). Den humane misdannede mutation (A687T), der er identificeret i Neurexin3α, er placeret i en ustudiet ekstracellulær region, der er evolutionært bevaret og bevares mellem alle alfa neurexiner7. Da samspillet mellem disse to molekyler er blevet etableret8,9,11, stillede vi spørgsmålet: Er neurexin3α SS4- til LRRTM2 ændret ved en A687T-punktmutation? Denne analyse afslørede, at A687T-punktmutationen uventet forbedrede sammenlægningen af Neurexin3α til LRRTM2, hvilket tyder på, at den ekstracellulære region, hvor punktmutationen er placeret, spiller en rolle i at formidle transsynaptiske interaktioner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

Protein interaktioner på cellulære grænseflader diktere et væld af biologiske resultater lige fra væv udvikling og kræft progression til synapse dannelse og vedligeholdelse. Mange af disse grundlæggende interaktioner forekommer i trans og er typisk induceret af heterofile eller homofile interaktioner mellem celler udtrykke membran forankret bindende par. Belysning af, hvordan sygdomsrelevante mutationer forstyrrer disse grundlæggende proteininteraktioner, kan give indsigt i et utal af cellebiologiske felter. Mange proteinproteininteraktionsanalyser er typisk ikke entydige mellem cis og transinteraktioner, hvilket potentielt fører til en overvurdering af omfanget af binding, der forekommer in vivo og involverer arbejdsintensiv rensning af protein og / eller specialiseret overvågningsudstyr. Her præsenterer vi en optimeret enkel protokol, der giver mulighed for observation og kvantificering af kun transinteraktioner uden behov for langvarige proteinrensninger eller specialiseret udstyr. HEK cellesammenlægning assay indebærer blanding af to uafhængige populationer af HEK celler, hver udtrykke membran-bundet cognate ligands. Efter en kort inkubationsperiode afbildes prøver, og de resulterende aggregater kvantificeres.

A687T-mutationen øger Neurexin3α SS4- binding til LRRTM27 For at undersøge, hvordan intercellulære interaktioner mellem to kendte synaptiske proteiner påvirkes af indførelsen af en punktmutation, der findes hos en patient med intellektuel handicap og epilepsi, brugte vi ovenstående HEK-cellesammenlægningsanalyse (Figur 1). Celler blev transfected i henhold til afsnit 1 og forberedt til billeddannelse i henhold til afsnit 1 og 2 i protokollen. Celler ble...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Her præsenterer vi en optimeret protokol til hurtigt og semikvantitativt at måle ligand-receptor interaktioner i trans i et heterologt cellesystem ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Måling af transcellulære interaktioner gennem proteinsammenlægning i et heterologt cellesystem

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Peering into the Dynamics of Social Interactions: Measuring Play Fighting in Rats

Peering i dynamikken i sociale interaktioner: Måling Play Fighting i rotter

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Et let, Hovedtelefoner-baseret system til at manipulere Auditiv Feedback i Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetisk Manipulation af musen Udvikling Hypothalamus gennem<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporering

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Anvendelse af en Caspase Multiplexing assay til bestemmelse af apoptose i en Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...