Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door grants van het National Institute of Mental Health (R00MH103531 en R01MH116901 aan J.A.), een predoctorale training Grant van het National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.), en een Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). We danken Dr. Kevin Woolfrey voor hulp met de microscoop, Dr. K Ulrich Bayer voor het gebruik van zijn epifluorescente microscoop, en Thomas Südhof (Stanford University) voor de LRRTM2 plasmide.

1. Celcultuur en transfectie
<ol><li>Maak HEK celmedia met DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) aangevuld met 4,5 g/L glucose, L-glutamine & natriumpyruvaat en 10% FBS. Steriel filter.</li>
	<li>Bepaal vooraf geschikte liganden en receptoren voor aggregatietest. OPMERKING: Neurexin3α SS4+/- en een van de bekende liganden, LRRTM2, werden gebruikt in deze studie. Liganden en receptoren van belang werden uitgedrukt uit cDNA's in pcDNA3.1. Een Gibson-assemblage werd gebruikt om Neurexin3α in pcDNA3.1<s...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

Het ontleden van de eiwit-eiwitinteracties die optreden in trans tijdens celhechting kan leiden tot een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan basis cellulaire processen, waaronder de vorming, functie en onderhoud van synapsen tijdens rijping en remodellering. De implicaties van cel-celinteracties breiden zich verder uit dan neurobiologie en hebben een bredere rol in signaaltransductie, celmigratie en weefselontwikkeling14. Aberraties in celhechting kunnen cellula...

Synaptische interacties gefaciliteerd door synaptische adhesiemoleculen zijn fundamenteel voor de ontwikkeling, organisatie, specificatie, onderhoud en functie van synapsen en de generatie van neurale netwerken. De identificatie van deze transsynaptische celhechtingsmoleculen neemt snel toe; het is dus van fundamenteel belang om bindende partners te identificeren en te begrijpen hoe deze nieuwe hechtingsmoleculen met elkaar interageren. Bovendien heeft genoomsequentie mutaties geïdentificeerd in veel van deze hechtingsmoleculen die vaak verband houden met een veelheid aan neuroontwikkelings-, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen1. Mutaties in genen die coderen voor synaptische celhechtingsmoleculen kunnen transinteracties nadelig veranderen en kunnen bijdragen aan patofysiologische veranderingen in synapsvorming en of onderhoud.
Er bestaan meerdere tests om eiwit-eiwitinteracties kwantitatief te beoordelen, zoals isothermische calorimetrie, circulair dichroïsme, oppervlakteplasmonresonantie2 en hoewel kwantitatief van aard, hebben ze verschillende beperkingen. Ten eerste hebben ze recombinant eiwit nodig, wat soms lange en vervelende zuiveringsstappen vereist. Ten tweede hebben ze geavanceerde gespecialiseerde apparatuur en technische expertise nodig. Ten derde kunnen ze de mate van binding overschatten, omdat ze zowel cis- als transinteracties mogelijk maken tussen eiwitten die van nature aan een membraan in vivo zijn vastgebonden. Hier stellen we een eenvoudige en relatief snelle test voor die uitsluitend transinteracties test.
Om veel van de complicaties in verband met gezuiverde eiwittests te omzeilen, hebben we een op cellen gebaseerde eiwitinteractietest geoptimaliseerd die transinteracties in een verminderd heterologe celsysteem herkapitaliseert. Deze test is eerder in verschillende vormen gebruikt om transcellulaire interacties te bestuderen. In deze benadering worden kandidaatcelhechtingsmoleculen omgezet in HEK293T-cellen. Bij fysiologische omstandigheden vertonen HEK293T-cellen geen zelfaggregatie, waardoor ze voorbeeldige modellen zijn voor deze test. Echter, wanneer individuele populaties van HEK-cellen die receptor en ligand uitdrukken worden gecombineerd, de binding van de receptor en de ligand krachten aggregatie van HEK cellen optreden. Deze aggregatie wordt uitsluitend bemiddeld door transinteracties en is meestal in tientallen minuten waarneembaar. Er zijn geen eiwitzuiveringsstappen vereist in deze methode, en de efficiëntie van de methode is gebaseerd op het paradigma dat populaties hek-cellen die cognate adhesiemoleculen uitdrukken, worden gecombineerd en vervolgens slechts tientallen minuten later in beeld worden gebracht. Bovendien is deze methode relatief goedkoop, omdat er geen antilichamen of dure apparatuur nodig zijn. De enige apparatuur die nodig is voor het verkrijgen van gegevens is een standaard fluorescerende microscoop. Een bijkomend voordeel van deze celgebaseerde test is het vermogen om het effect van ziekterelevante puntmutaties op transinteracties snel te screenen. Dit kan worden uitgevoerd door HEK-cellen te transfecteren met cDCA's van de mutante varianten van het eiwit van belang.
In dit protocol presenteren we een voorbeeld waarin we onderzoeken of een missense mutatie in Neurexin3α (Neurexin3αA687T),geïdentificeerd bij een patiënt gediagnosticeerd met een ernstige verstandelijke beperking en epilepsie, interacties in trans verandert met leucine-rijke herhaalde transmembrane eiwit 2 (LRRTM2). Neurexin3α is een lid van de evolutionair geconserveerde familie van presynaptische celhechtingsmoleculen en hoewel recent werk meerdere rollen heeft geïdentificeerd bij de synaps3,4,5,6,7, blijft ons synaptische begrip van dit molecuul en alle leden van de neurexinefamilie onvolledig. LRRTM2 is een excitatory postsynaptische celhechtingseiwit dat deelneemt aan synapsvorming en -onderhoud8,9,10. Belangrijk is dat LRRTM2 uitsluitend interageert met neurexine isovormen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4-) missen, maar niet met neurexine isoformen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4+) bevatten. De menselijke missense mutatie (A687T) geïdentificeerd in Neurexin3α bevindt zich in een niet-bestudeerd extracellulair gebied dat evolutionair geconserveerd is en wordt bewaard tussen alle alfaneurexinen7. Aangezien de interactie tussen deze tweemoleculenis vastgesteld 8,9,11, stelden we de vraag: is het bindingsvermogen van Neurexin3α SS4- naar LRRTM2 gewijzigd door een A687T-puntmutatie? Deze test onthulde dat de A687T-puntmutatie onverwacht de aggregatie van Neurexin3α naar LRRTM2 verbeterde, wat suggereert dat het extracellulaire gebied waarin de puntmutatie zich bevindt, een rol speelt bij het bemiddelen van transsynaptische interacties.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

Eiwitinteracties op cellulaire interfaces dicteren een veelheid aan biologische uitkomsten, variërend van weefselontwikkeling en kankerprogressie tot synapsvorming en -onderhoud. Veel van deze fundamentele interacties komen voor in trans en worden meestal veroorzaakt door heterofiele of homofiele interacties tussen cellen die membraanverankerde bindingsparen uitdrukken. Het ophelderen hoe ziekterelevante mutaties deze fundamentele eiwitinteracties verstoren, kan inzicht geven in een groot aantal celbiologievelden. Veel eiwit-eiwit interactietests zijn meestal niet disambiguate tussen cis en trans interacties, wat mogelijk leidt tot een overschatting van de mate van binding die optreedt in vivo en omvat arbeidsintensieve zuivering van eiwitten en / of gespecialiseerde bewakingsapparatuur. Hier presenteren we een geoptimaliseerd eenvoudig protocol dat het mogelijk maakt om alleen transinteracties te observeren en te kwantificeren zonder dat langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn. De HEK-celaggregatietest omvat het mengen van twee onafhankelijke populaties HEK-cellen, die elk membraangebonden cognate liganden uitdrukken. Na een korte incubatieperiode worden monsters in beeld genomen en worden de resulterende aggregaten gekwantificeerd.

De A687T-mutatie verhoogt de Neurexin3α SS4-binding aan LRRTM27 Om te onderzoeken hoe intercellulaire interacties van twee bekende synaptische eiwitten worden beïnvloed door de introductie van een puntmutatie gevonden bij een patiënt met een verstandelijke beperking en epilepsie, gebruikten we de bovenstaande HEK-celaggregatietest (figuur 1). Cellen werden getransfecteerd volgens sectie 1 en voorbereid op beeldvorming volgens secties 1 en 2 van het protocol....

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Het testen van oppervlakte-expressie van receptoren Chemosensory in heterologe cellen

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Peering into the Dynamics of Social Interactions: Measuring Play Fighting in Rats

Peering in de dynamiek van de sociale interacties: Het meten van Play Vechten bij ratten

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Een lichtgewicht, hoofdtelefoon-gebaseerd systeem voor het manipuleren van auditieve feedback in Zangvogels

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...