Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש (R00MH103531 ו- R01MH116901 ל- J.A.), מענק הכשרה מוקדמת מהמכון הלאומי לרפואה כללית (T32GM007635 ל- S.R.), ומלגת לידה היל גיליאם למחקר מתקדם (GT11021 ל- S.R.). אנו מודים לד"ר קווין וולפרי על העזרה במיקרוסקופ, ד"ר K אולריך באייר על השימוש במיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי שלו, ותומס סודהוף (אוניברסיטת סטנפורד) על פלסמיד LRRTM2.

1. תרבות תאים ו transfection
<ol><li>הפוך את המדיה הסלולרית HEK עם DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של הנשר בינוני) בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז, L-גלוטמין & נתרן פירובט ו 10% FBS. מסנן סטרילי.</li>
	<li>קבוע מראש ליגנדים מתאימים קולטנים לבדיקת צבירה. הערה: Neurexin3α SS4+/- ואחד הליגנדים הידועים שלה, LRRTM2, שימשו במחקר זה. ליגנדים קולטנים ...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון המתרחשות טרנס במהלך הידבקות בתא יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים תאיים בסיסיים כולל היווצרות, פונקציה ותחזוקה של סינפסות במהלך התבגרות ושיפוץ. ההשלכות של אינטראקציות בין תא לתא מתרחבות מעבר לנוירוביולוגיה ויש להן תפקידי?...

אינטראקציות סינפטיות בהנחיית מולקולות הידבקות סינפטית הן הבסיס לפיתוח, ארגון, מפרט, תחזוקה ותפקוד של סינפסות ויצירת רשתות עצביות. הזיהוי של מולקולות הידבקות תאים טרנס-סינפטיות אלה גדל במהירות; לכן, חשוב ביסודו לזהות שותפים מחייבים ולהבין כיצד מולקולות הדבקה חדשות אלה אינטראקציה אחד עם השני. בנוסף, רצף הגנום זיהה מוטציות ברבים ממולקולות הידבקות אלה הקשורות בדרך כלל לשלל הפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירופסיכיאטריות והתמכרות1. מוטציות בגנים המקודדות למולקולות סינפטיות של הידבקות בתאים עלולות לשנות לרעה אינטראקציות טרנסג'נדריות ועשויות לתרום לשינויים פתופיזיולוגיים בהיווצרות סינפסה או תחזוקה.
מבחנים מרובים קיימים כדי להעריך כמותית אינטראקציות חלבון חלבון כגון קלורימטריה איזותרמית, dichroism מעגלי, תהודה פלסמון פני השטח2 ולמרות כמותי בטבע, יש להם מספר מגבלות. ראשית, הם דורשים חלבון רקומביננטי, לפעמים דורשים צעדי טיהור ארוכים ומייגעים. שנית, הם דורשים ציוד מיוחד מתוחכם ומומחיות טכנית. שלישית, הם יכולים להפרז בהיקף הכריכה כפי שהם מאפשרים הן אינטראקציות cis ו טרנס בין חלבונים הקשורים באופן טבעי קרום vivo. כאן אנו מציעים בדיקה פשוטה ומהירה יחסית הבדוקה באופן בלעדי אינטראקציות טרנסג'נדריות.
כדי לעקוף רבים מהסיבוכים הקשורים למטעני חלבון מטוהרים, יש לנו אופטימיזציה של בדיקת אינטראקציה חלבון מבוסס תאים כי recapitulates אינטראקציות טרנס במערכת תאים הטרולוגית מופחתת. מבחנים אלה שימשו בעבר בצורות שונות לחקר אינטראקציות טרנס-תאיות. בגישה זו, מולקולות הידבקות תאים מועמדים הם transfected לתוך תאי HEK293T. בתנאים פיזיולוגיים, תאי HEK293T אינם מפגינים צבירה עצמית, מה שהופך אותם למודלים למופת לבדיקה זו. עם זאת, כאשר אוכלוסיות בודדות של תאי HEK המביעים קולטן ו ligand משולבים, הכריכה של הקולטן ואת ligand כוחות צבירה של תאי HEK להתרחש. צבירה זו מתווכת אך ורק על ידי אינטראקציות טרנסג'נדריות ובדרך כלל ניתן לצפות בה בעשרות דקות. בשיטה זו אין צורך בצעדי טיהור חלבונים, ויעילות השיטה מסתמכת על הפרדיגמה לפיה משולבות אוכלוסיות של תאי HEK המבטאות מולקולות הידבקות קוגניציה ולאחר מכן מצולמות רק עשרות דקות לאחר מכן. בנוסף, שיטה זו זולה יחסית, שכן לא נדרשים נוגדנים ולא ציוד יקר. הציוד היחיד הנדרש לרכישת נתונים הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. יתרון נוסף למבחן מבוסס תא זה הוא היכולת לסנן במהירות את ההשפעה של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלות על אינטראקציות טרנסג'נדריות. זה יכול להתבצע על ידי transfecting תאי HEK עם cDNAs של גרסאות מוטציה של החלבון של עניין.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים דוגמה שבה אנו חוקרים אם מוטציה שגויה Neurexin3α (Neurexin3αA687T), זוהה בחולה שאובחן עם מוגבלות אינטלקטואלית עמוקה ואפילפסיה, משנה אינטראקציות טרנס עם חלבון טרנסממברן חוזר עשיר לאוצין 2 (LRRTM2). Neurexin3α הוא חבר במשפחה השמורה מבחינה אבולוציונית של מולקולות הידבקות תאים presynaptic ובעוד העבודה האחרונה זיהתה תפקידים מרובים בסינפסה3,4,5,6,7, ההבנה הסינפטית שלנו של מולקולה זו וכל בני משפחת neurexin נשאר שלם. LRRTM2 הוא חלבון הידבקות תאים פוסט-סינפטי מעורר המשתתף בהיווצרות סינפסה ותחזוקה8,9,10. חשוב לציין, LRRTM2 באופן בלעדי אינטראקציה עם isoforms neurexin שחסרים באתר splice 4 אקסון חלופי (SS4-) אבל לא עם isoforms neurexin המכיל את אתר splice 4 exon חלופי (SS4+). מוטציית ההחמצה האנושית (A687T) שזוהתה ב Neurexin3α ממוקמת באזור חוץ-תאי לא מתורבת השמור מבחינה אבולוציונית ושמור בין כל אלפא neurexins7. כמו האינטראקציהביןשתי מולקולות אלה הוקמה 8,9,11, אנו מציגים את השאלה: האם היכולת מחייבת של Neurexin3α SS4- כדי LRRTM2 השתנה על ידי מוטציה נקודת A687T? בדיקה זו גילתה כי מוטציית נקודת A687T שיפרה באופן בלתי צפוי את הצבירה של Neurexin3α ל- LRRTM2 מה שמרמז על כך שהאזור החוץ-תאי שבו נמצאת המוטציה הנקודתית, ממלא תפקיד בתיווך אינטראקציות טרנסינפטיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

אינטראקציות חלבון בממשקים סלולריים מכתיבות שפע של תוצאות ביולוגיות החל מהתפתחות רקמות והתקדמות סרטן ועד היווצרות ותחזוקה של סינפסה. רבות מהאינטראקציות הבסיסיות הללו מתרחשות בטרנס ובדרך כלל נגרמות על ידי אינטראקציות הטרופיליות או הומופיליות בין תאים המבטאים זוגות כריכה מעוגנים בקרום. המבהיר כיצד מוטציות רלוונטיות למחלות משבשות את אינטראקציות החלבון הבסיסיות האלה יכול לספק תובנה על מספר עצום של תחומי ביולוגיה של התא. מבחני אינטראקציה רבים של חלבון-חלבון אינם מנטרלים בדרך כלל בין אינטראקציות cis ו- trans, מה שעלול להוביל להערכת יתר של היקף הכריכה המתרחשת ב- vivo וכרוכה בטיהור אינטנסיבי של חלבון ו/או ציוד ניטור מיוחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט אופטימיזציה המאפשר תצפית וכימות של אינטראקציות טרנס בלבד ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. מבחני צבירת תאי HEK כרוכים בערבוב של שתי אוכלוסיות עצמאיות של תאי HEK, שכל אחת מהן מבטאת ליגנדים קוגניאטים הקשורים לקרום. לאחר תקופת דגירה קצרה, הדגימות מסומנות והצטברויות המתקבלות מכמתות.

מוטציית A687T מגבירה את Neurexin3α SS4- מחייב LRRTM27 כדי לחקור כיצד אינטראקציות בין-תאיות של שני חלבונים סינפטיים ידועים מושפעות מהכנסת מוטציה נקודתית שנמצאה בחולה עם מוגבלות אינטלקטואלית ואפילפסיה, השתמשנו במדיין צבירת התאים הנ"ל HEK (איור 1). התאים הודבקו לפי סעיף 1 ו...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

חלבון לוקליזציה ב 3D תרבות גזע עצביים נייד: מתודולוגיה ויזואליזציה היברידי

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Peering into the Dynamics of Social Interactions: Measuring Play Fighting in Rats

צצה אל הדינמיקה של אינטראקציות חברתיות: Play מדידת לחימה בחולדות

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

, מערכת אוזניות קלה משקל מבוססת על מניפולצית משוב שמיעתי בציפורי שיר

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...