Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System at JoVE.com

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेंटल हेल्थ (R00MH103531 और R01MH116901 से जेए) तक अनुदान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिसिन (T32GM007635 से एसआर) तक एक प्रीडॉक्टोरल ट्रेनिंग ग्रांट और एडवांस्ड स्टडी (GT11021 से S.R.) के लिए एक Lyda हिल गिलम फैलोशिप (GT11021 से S.R.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम माइक्रोस्कोप के साथ मदद के लिए डॉ केविन वूलफ्रे, डॉ के उलरिच बायर को उनके एपिफ्लोर्सेंट माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं, और थॉमस Südhof (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) LRRTM2 plasmid के लिए ।

1. सेल कल्चर और ट्रांसफैक्शन
<ol><li>डीएमईएम, 1x (ईगल के माध्यम का Dulbecco का संशोधन) के साथ एचईके सेल मीडिया बनाएं, जिसमें 4.5 ग्राम/एल ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन और सोडियम पायरुवेट और 10% एफबीएस के साथ पूरक किया गया है। बा?...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

सेल आसंजन के दौरान ट्रांस में होने वाले प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को विच्छेदन करने से परिपक्वता और पुनर्मॉडलिंग के दौरान सिनेप्स के गठन, कार्य और रखरखाव सहित बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं में अंतर्न?...

सिनैप्टिक आसंजन अणुओं द्वारा सुविधाजनक सिनैप्टिक इंटरैक्शन विकास, संगठन, विनिर्देश, रखरखाव और सिनैप्स के कार्य और तंत्रिका नेटवर्क की पीढ़ी के लिए मूलभूत हैं। इन ट्रांससिनैप्टिक कोशिका आसंजन अणुओं की पहचान तेजी से बढ़ रही है; इस प्रकार, बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करना और यह समझना मौलिक रूप से महत्वपूर्ण है कि ये नए आसंजन अणु एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम अनुक्रमण ने इनमें से कई आसंजन अणुओं में उत्परिवर्तनों की पहचान की है जो आमतौर पर न्यूरोडेवलपमेंटल, न्यूरोसाइकियाट्रिक और व्यसन विकारों की एक भीड़ से जुड़े होते हैं1। जीन में उत्परिवर्तन जो सिनैप्टिक सेल-आसंजन अणुओं के लिए कोड हानिकारक रूप से ट्रांस इंटरैक्शन को बदल सकता है और सिनैप्स गठन और या रखरखाव में रोगविज्ञानी परिवर्तन में योगदान दे सकता है।
मात्रात्मक रूप से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन जैसे आइसोथर्मल कैलोरिमेट्री, परिपत्र डिक्रोमिज्म, सतह प्लाज्मन अनुनाद2 और हालांकि मात्रात्मक प्रकृति में, उनकी कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, उन्हें फिर से संयोजन प्रोटीन की आवश्यकता होती है, कभी-कभी लंबे और थकाऊ शुद्धिकरण चरणों की मांग करते हैं। दूसरा, वे परिष्कृत विशेष उपकरण और तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है । तीसरा, वे बाध्यकारी की सीमा को अधिक आंक सकते हैं क्योंकि वे प्रोटीन के बीच सीआईएस और ट्रांस इंटरैक्शन दोनों के लिए अनुमति देते हैं जो स्वाभाविक रूप से वीवो में एक झिल्ली के लिए सीमित होते हैं। यहां हम एक सरल और अपेक्षाकृत तेजी से परख का प्रस्ताव करते हैं जो विशेष रूप से ट्रांस इंटरैक्शन का परीक्षण करता है।
शुद्ध प्रोटीन परख से जुड़ी कई जटिलताओं को दरकिनार करने के लिए, हमने एक सेल-आधारित प्रोटीन इंटरैक्शन परख को अनुकूलित किया है जो कम विषम कोशिका प्रणाली में ट्रांस इंटरैक्शन को पुनः प्राप्त करता है। इस परख का उपयोग पहले विभिन्न रूपों में ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस दृष्टिकोण में, उम्मीदवार सेल आसंजन अणु एचईके 293T कोशिकाओं में संक्रमित होते हैं। शारीरिक स्थितियों में, HEK293T कोशिकाएं आत्म-एकत्रीकरण का प्रदर्शन नहीं करती हैं, जिससे वे इस परख के लिए अनुकरणीय मॉडल बनाते हैं। हालांकि, जब रिसेप्टर और लिगांड व्यक्त करने वाली एचईके कोशिकाओं की व्यक्तिगत आबादी को संयुक्त किया जाता है, तो रिसेप्टर के बंधन और लिगांड एचईके कोशिकाओं के एकत्रीकरण को होते हैं। यह एकत्रीकरण विशेष रूप से ट्रांस इंटरैक्शन द्वारा मध्यस्थता की जाती है और आमतौर पर दसियों मिनट में नमूदार होती है। इस विधि में कोई प्रोटीन शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता नहीं है, और विधि की दक्षता प्रतिमान पर निर्भर करती है कि एचईसी कोशिकाओं की आबादी को अनुग्नक आसंजन अणुओं को व्यक्त किया जा रहा है और फिर बाद में केवल दसियों मिनट की कल्पना की जा रही है। इसके अतिरिक्त, यह विधि अपेक्षाकृत सस्ती है, क्योंकि न तो एंटीबॉडी और न ही महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। डेटा के अधिग्रहण के लिए आवश्यक एकमात्र उपकरण एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप है। इस सेल आधारित परख के लिए एक अतिरिक्त लाभ ट्रांस इंटरैक्शन पर रोग प्रासंगिक बिंदु म्यूटेशन के प्रभाव को जल्दी से स्क्रीन करने की क्षमता है। यह ब्याज के प्रोटीन के उत्परिवर्ती वेरिएंट के सीडीएनए के साथ एचईके कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करके किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक उदाहरण पेश करते हैं जिसमें हम जांच करते हैं कि क्या गहन बौद्धिक विकलांगता और मिर्गी के साथ निदान किए गए रोगी में पहचाने जाने वाले नेयूरेक्सिन3α (Neurexin3αA687T)में एक मिसेंस उत्परिवर्तन, ल्यूसिन-समृद्ध दोहराने वाले ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 2 (LRRTM2) के साथ ट्रांस में बातचीत को बदल देता है। Neurexin3α presynaptic सेल-आसंजन अणुओं के विकासवादी संरक्षित परिवार का एक सदस्य है और जबकि हाल के काम ने सिनैप्स3,4,5,6,7में कई भूमिकाओं की पहचान की है, इस अणु की हमारी सिनैप्टिक समझ और नेरेक्सिन परिवार के सभी सदस्य अधूरे रहते हैं। एलआरआरटीएम2 एक उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक सेल आसंजन प्रोटीन है जो 8 ,9,10सिनैप्सगठन और रखरखाव में भाग लेता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि LRRTM2 विशेष रूप से नेरेक्सिन आइसोफॉर्म के साथ बातचीत करता है जिसमें स्प्लिस साइट 4 वैकल्पिक एक्सॉन (एसएस 4-) की कमी है, लेकिन स्प्लिस साइट 4 वैकल्पिक एक्सोन (SS4 +) वाले नेयूरेक्सिन आइसोफॉर्म के साथ नहीं। Neurexin3α में पहचाना गया मानव मिसेंसे उत्परिवर्तन (A687T) एक अअयन्डाड एक्सट्रासेलुलर क्षेत्र में स्थित है जो विकासवादी रूप से संरक्षित है और सभी अल्फा नेयूरेक्सिन 7 के बीचसंरक्षितहै। जैसा कि इन दोनों अणुओं के बीच बातचीत8,9,11 स्थापितकी गई है, हमने प्रश्न पूछा: क्या A687T पॉइंट म्यूटेशन द्वारा बदल दिए गए एलआरआरटीएम2 के लिए Neurexin3α SS4 की बाध्यकारी क्षमता है? इस परख से पता चला है कि A687T बिंदु उत्परिवर्तन अप्रत्याशित रूप से Neurexin3α के एकत्रीकरण LRRTM2 को बढ़ाया सुझाव है कि बाह्राश क्षेत्र जिसमें बिंदु उत्परिवर्तन स्थित है, ट्रांससिनैप्टिक बातचीत मध्यस्थता में एक भूमिका निभाता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

सेलुलर इंटरफेस पर प्रोटीन इंटरैक्शन ऊतक विकास और कैंसर प्रगति से लेकर इसके गठन और रखरखाव तक जैविक परिणामों की एक भीड़ तय करते हैं। इनमें से कई मौलिक बातचीत ट्रांस में होती है और आम तौर पर झिल्ली लंगरबद्ध बाध्यकारी जोड़े को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के बीच हेट्रोफिलिक या होमोफिलिक इंटरैक्शन से प्रेरित होती है। कैसे रोग प्रासंगिक उत्परिवर्तन इन मौलिक प्रोटीन बातचीत को बाधित स्पष्ट सेल जीव विज्ञान क्षेत्रों के असंख्य में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परखें आमतौर पर सीआईएस और ट्रांस इंटरैक्शन के बीच अस्पष्ट नहीं होती हैं, जो संभावित रूप से वीवो में होने वाली बाध्यकारी की सीमा का अधिक अनुमान लगाते हैं और इसमें प्रोटीन और/या विशेष निगरानी उपकरणों की श्रम गहन शुद्धि शामिल होती है । यहां, हम एक अनुकूलित सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो लंबे प्रोटीन शुद्धिकरण या विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना केवल ट्रांस इंटरैक्शन के अवलोकन और मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। एचईके सेल एकत्रीकरण परख में एचईके कोशिकाओं की दो स्वतंत्र आबादी का मिश्रण शामिल है, प्रत्येक झिल्ली-बाध्य कॉग्नेट लिगांड व्यक्त करता है। एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि के बाद, नमूनों को चित्रित किया जाता है और परिणामस्वरूप एकत्रित होते हैं।

A687T उत्परिवर्तन बढ़ जाती है Neurexin3α SS4-LRRTM27 के लिए बाध्यकारी यह जांचने के लिए कि बौद्धिक विकलांगता और मिर्गी के रोगी में पाए जाने वाले बिंदु उत्परिवर्तन की शुरूआत से दो ज्ञात सिनैप्टिक प्रोट?...

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Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

यहां, हम फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक विषमता कोशिका प्रणाली में ट्रांस में लिगांड-रिसेप्टर इंटरैक्शन को तेजी से और अर्धकंठितकरने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

एक विषमता कोशिका प्रणाली में प्रोटीन एकत्रीकरण के माध्यम से ट्रांससेलुलर इंटरैक्शन को मापने

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Heterologous कक्ष में Chemosensory रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति परख

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

3D तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति में localizing प्रोटीन: एक हाइब्रिड विज़ुअलाइज़ेशन पद्धति

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव Neuronal progenitors और न्यूरॉन्स के कुशल व्युत्पत्ति

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Peering into the Dynamics of Social Interactions: Measuring Play Fighting in Rats

सामाजिक सहभागिता की गतिशीलता में Peering: मापने प्ले चूहों में लड़

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

तीव्र hippocampal स्लाइस में Synaptically पैदा Astroglial और neuronal प्रतिक्रियाएँ की दोहरी electrophysiological रिकॉर्डिंग

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Songbirds में श्रवण प्रतिक्रिया से छेड़छाड़ करने के लिए एक हल्के, Headphones आधारित प्रणाली

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

माउस के आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से Hypothalamus का विकास<em&gt; गर्भाशय में</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

एक<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</emAmylopathy अध्ययन के लिए&gt; मॉडल प्रणाली

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

एक Hypothalamic सेल मॉडल में apoptosis निर्धारित करने के लिए कस्पासे बहुसंकेतन परख का उपयोग

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Neuronal फायरिंग दरों के हेरफेर से astrocytic रिसेप्टर्स की Plasticity उत्प्रेरण

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...