Name: measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental (R00MH103531 y R01MH116901 a J.A.), una beca de capacitación predoctoral del Instituto Nacional de Medicina General (T32GM007635 a S.R.), y una Beca Lyda Hill Gilliam de Estudio Avanzado (GT11021 a S.R.). Agradecemos al Dr. Kevin Woolfrey la ayuda con el microscopio, el Dr. K Ulrich Bayer por el uso de su microscopio epifluorescente, y Thomas Südhof (Universidad de Stanford) por el plásmido LRRTM2.

1. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Hacer medios celulares HEK con DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) complementado con glucosa de 4,5 g/L, piruvato de L-glutamina y sodio y 10% FBS. Filtro estéril.</li>
	<li>Predeterminar ligandos y receptores adecuados para el ensayo de agregación. NOTA: Neurexin3α SS4+/- y uno de sus ligandos conocidos, LRRTM2, fueron utilizados en este estudio. Ligandos y receptores de interés se expresaron a partir de CDNAs en pcDNA3.1. Se utilizó un conjunto Gibso...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

La disección de las interacciones proteína-proteínas que se producen en trans durante la adhesión celular puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a los procesos celulares básicos, incluyendo la formación, función y mantenimiento de sinapsis durante la maduración y remodelación. Las implicaciones de las interacciones de célula a célula se expanden más allá de la neurobiología y tienen un papel más amplio en la transducción de la señal, la migración celular y el d...

Las interacciones sinápticas facilitadas por moléculas de adhesión sináptica son fundamentales para el desarrollo, la organización, la especificación, el mantenimiento y la función de las sinapsis y la generación de redes neuronales. La identificación de estas moléculas de adhesión celular transsináptica está aumentando rápidamente; por lo tanto, es fundamental identificar socios de unión y entender cómo estas nuevas moléculas de adhesión interactúan entre sí. Además, la secuenciación del genoma ha identificado mutaciones en muchas de estas moléculas de adhesión que comúnmente están relacionadas con una multitud de trastornos neurodesarrollo, neuropsiquiátrico y de adicción1. Las mutaciones en genes que codifican para moléculas sinápticas de adhesión celular pueden alterar perjudicialmente las interacciones trans y pueden contribuir a alteraciones fisiológicas en la formación y el mantenimiento de sinapsis.
Existen múltiples ensayos para evaluar cuantitativamente las interacciones proteína-proteínas como calorimetría isotérmica, dichroismo circular, resonancia de plasmón superficial2 y aunque de naturaleza cuantitativa, tienen varias limitaciones. En primer lugar, requieren proteínas recombinantes, a veces exigiendo pasos de purificación largos y tediosos. En segundo lugar, requieren sofisticados equipos especializados y conocimientos técnicos. En tercer lugar, pueden sobreestimar el grado de unión, ya que permiten interacciones cis y trans entre proteínas que están naturalmente atadas a una membrana in vivo. Aquí proponemos un ensayo simple y relativamente rápido que prueba exclusivamente las interacciones trans.
Para eludir muchas de las complicaciones asociadas con los ensayos de proteínas purificadas, hemos optimizado un ensayo de interacción proteica basado en células que recapitula las interacciones trans en un sistema celular heterologoso reducido. Este ensayo se ha utilizado previamente en varias formas para estudiar interacciones transcelulares. En este enfoque, las moléculas de adhesión celular candidatas se transfectan en células HEK293T. En condiciones fisiológicas, las células HEK293T no exhiben autoagregación, por lo que son modelos ejemplares para este ensayo. Sin embargo, cuando se combinan poblaciones individuales de células HEK que expresan receptor y ligando, la unión del receptor y el ligando obliga a que se produzca la agregación de células HEK. Esta agregación se media exclusivamente mediante interacciones trans y suele ser observable en decenas de minutos. No se requieren pasos de purificación de proteínas en este método, y la eficiencia del método se basa en el paradigma de que las poblaciones de células HEK que expresan moléculas de adherencia de cognato se están combinando y luego se tienen imágenes sólo decenas de minutos más tarde. Además, este método es relativamente barato, ya que no se requieren anticuerpos ni equipos costosos. El único equipo necesario para la adquisición de datos es un microscopio fluorescente estándar. Una ventaja adicional a este ensayo basado en células es la capacidad de examinar rápidamente el efecto de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans. Esto se puede realizar mediante la transfectación de células HEK con CDNAs de las variantes mutantes de la proteína de interés.
En este protocolo, presentamos un ejemplo en el que investigamos si una mutación de missense en Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identificada en un paciente diagnosticado con profunda discapacidad intelectual y epilepsia, altera las interacciones en trans con la proteína transmembrana repetida rica en leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α es miembro de la familia evolutivamente conservada de moléculas presintáticas de adhesión celular y aunque el trabajo reciente ha identificado múltiples roles en la sinapsis3,4,5,6,7,nuestra comprensión sináptica de esta molécula y todos los miembros de la familia de la neurexina sigue incompleta. LRRTM2 es una proteína de adherencia de células postsinápticas excitatorias que participa en la formación y mantenimiento de sinapsis8,9,10. Es importante destacar que LRRTM2 interactúa exclusivamente con isoformes de neurexina que carecen del sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4-) pero no con isoformes de neurexina que contienen el sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4+). La mutación de missense humano (A687T) identificada en Neurexin3α se encuentra en una región extracelular no auditada que se conserva evolutivamente y se conserva entre todas las neurexinas alfa7. Como la interacción entre estas dos moléculas se ha establecido8,9,11, planteamos la pregunta: ¿la capacidad de unión de Neurexin3α SS4- a LRRTM2 alterada por una mutación de punto A687T? Este ensayo reveló que la mutación del punto A687T mejoró inesperadamente la agregación de Neurexin3α a LRRTM2, lo que sugiere que la región extracelular en la que se encuentra la mutación de puntos desempeña un papel en la mediación de las interacciones transsintápticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

Las interacciones proteicas en las interfaces celulares dictan una multitud de resultados biológicos que van desde el desarrollo de tejidos y la progresión del cáncer hasta la formación y mantenimiento de sinapsis. Muchas de estas interacciones fundamentales ocurren en trans y suelen ser inducidas por interacciones heterofílicas u homofílicas entre células que expresan pares de unión anclados por membrana. Dilucidar cómo las mutaciones relevantes para la enfermedad interrumpen estas interacciones proteicas fundamentales puede proporcionar una visión de una miríada de campos de biología celular. Muchos ensayos de interacción proteína-proteína no suelen desambiguar entre las interacciones cis y trans, lo que potencialmente conduce a una sobreestimación del grado de unión que se está produciendo in vivo e implican la purificación intensiva de proteínas y/o equipos de monitoreo especializados. Aquí, presentamos un protocolo simple optimizado que permite la observación y cuantificación de sólo interacciones trans sin necesidad de largas purificaciones de proteínas o equipos especializados. El ensayo de agregación celular HEK implica la mezcla de dos poblaciones independientes de células HEK, cada una expresando ligandos de cognato unidos a membrana. Después de un breve período de incubación, las muestras se muestran en imágenes y se cuantifican los agregados resultantes.

La mutación A687T aumenta la unión de Neurexin3α SS4 a LRRTM27 Para investigar cómo las interacciones intercelulares de dos proteínas sinápticas conocidas se ven afectadas por la introducción de una mutación puntual encontrada en un paciente con discapacidad intelectual y epilepsia, utilizamos el ensayo de agregación celular HEK anterior (Figura 1). Las células fueron transfectadas de acuerdo con la sección 1 y preparadas para la toma de imágenes de...

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Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.

Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Analizando la expresión de superficie de los receptores Quimiosensoriales en células heterólogas

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Investigación

Neurociencias

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Mirando en la dinámica de las interacciones sociales: Juego de medición combates en ratas

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Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...