Name: loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation at JoVE.com

يشكر المؤلفون أعضاء اللجنة الفرعية للتحقق من صحة أساليب الميكروبيولوجيا (MMVS) في إدارة الأغذية والعقاقير ومجلس دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) على المراجعة النقدية لدراسات التحقق من طريقة السالمونيلا مصباح.

<ol>
	<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).</li><li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances.">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications.">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li><li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template.">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li><li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP).">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li><li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers.">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li><li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed:+Current+applications+and+future+directions.">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li><li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li><li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+(OIE)+notifiable+viral+diseases+of+ruminants,+swine+and+poultry.">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li><li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li><li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification:+Beyond+microbial+identification.">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).</li><li>. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013)</li><li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+(MDA)+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces:+collaborative+study,+first+action+2016.01.">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li><li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+loop-mediated+amplification/ISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica.">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li><li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food.">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).</li><li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella.">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li><li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA:+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family.">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li><li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li><li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid,+reliable,+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce.">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li><li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time.">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).</li><li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food.">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة. الآراء التي تم التعبير عنها في هذه المخطوطة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة السياسة الرسمية لوزارة الصحة والخدمات الإنسانية، أو إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، أو الحكومة الأميركية. لا تشكل الإشارة إلى أي مواد أو معدات أو عملية تجارية بأي شكل من الأشكال موافقة أو موافقة أو توصية من إدارة الغذاء والدواء.

لقد قدمنا هنا بسيطة وسريعة ومحددة ، وطريقة حساسة لفرز و تأكيد السالمونيلا في الغذاء الحيواني والثقافة النقية ، على التوالي. مع الراحة من مزيج سيد isothermal الذي يحتوي على أربع الكواشف الرئيسية، وجاهزة للاستخدام، في المنزل إعداد مزيج التمهيدي، وتجميع رد فعل مصباح يتطلب سوى بضع خطوات pipetting (الشكل 1). إجمالي وقت التشغيل بما في ذلك التضخيم ومراحل الثني أقل من 38 دقيقة(الشكل 2A، B والشكل 3A، B). يتم رصد النتائج الإيجابية عن طريق الفلورسينس في الوقت الحقيقي (الشكل 2C والشكل 3C, D) ويمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 5 دقيقة26. الطور الهاد بمثابة تأكيد إضافي خصوصية مصباح حيث أن العينات التي اُصيبت بـ Tm (حوالي 90 درجة مئوية) يتم الإبلاغ عنها على أنها إيجابية(الشكل 2D و E والشكل 3E−G). وقد تم الإبلاغ عن حساسيات من 1 خلية السالمونيلا في الثقافة النقية < 1 CFU/25 ز في الغذاء الحيواني سابقا26.
كما مصباح فعالة جدا ويولد كمية كبيرة من الحمض النووي1، فمن الأهمية بمكان أن يتم استخدام أفضل الممارسات المختبرية لمنع التلوث المتبادل ، والتي قد تشمل فصل جسديا المناطق اللازمة لإعداد المزيج الرئيسي مصباح وإضافة قوالب الحمض النووي ، وتجنب توليد الهباء الجوي ، وذلك باستخدام نصائح ماصة مرشح ، وتغيير القفازات في كثير من الأحيان ، والامتناع عن فتح ردود فعل المصباح بعد التضخيم.
وقد سبق اختبار خصوصية هذا الأسلوب لمبة السالمونيلا باستخدام 300 سلالات بكتيرية (247 السالمونيلا من 185 سيروفارس و 53 غيرالسالمونيلا)و أظهرت أن 100٪ محددة26. وتجدر الإشارة إلى أن الاختلافات الكبيرة في Tماكس لوحظ بين نوعي السالمونيلا، S. enterica وبونغوري السالمونيلا، وبين الأنواع الفرعية S. enterica، وخاصة subsp. أريزونا (IIIa)26. ومع ذلك، كانت هذه النتائج الإيجابية لا تزال صالحة وفقا لقواعد لتفسير نتائج مصباح. في دراستنا التعاونية متعددة المختبرات في الغذاء الكلب الجاف التي شملت 14 المحللين19، وعينات وجود نتائج غير متناسقة في تشغيل مصباح مكررة لوحظت أحيانا. هذه عادة ما تنطوي على عينات مع نتائج إيجابية متأخرة (Tmax > 15 دقيقة). تكرار كلا تشغيل بشكل مستقل عادة حل المشكلة. أكثر نادرا، لاحظنا عينات مع Tم الصحيح ولكن لا أو غير منتظمة Tالقيم القصوى (< 5 دقيقة). وعادة ما يكون هذا بسبب فقاعات الهواء في أنبوب رد الفعل.
طوال دورة حياة تطوير الأسلوب LAMP ، والتقييم ، والدراسات قبل الدراسة ، والتحقق من صحة المختبرات المتعددة ، لاحظنا تحملًا عاليًا من LAMP إلى مثبطات في مختلف المواد الغذائية الحيوانية أو مصفوفات الطعام ووسائل الإعلام الثقافية4،19،22،23،24، تسليط الضوء على قوة الطريقة والتعاون في العديد من الدراسات الأخرى على نطاق عالمي8. وهذا أعلى بالمقارنة مع PCR أو PCR في الوقت الحقيقي، الأمر الذي يتطلب عادة مراقبة التضخيم الداخلية لضمان أن النتائج السلبية ليست بسبب تثبيطمصفوفة 28. وعلاوة على ذلك، أظهر مصباح مماثلة (أو متفوقة) خصوصية وحساسية مقارنة PCR أو PCR في الوقت الحقيقي في الغالبية العظمى من الدراسات8. تكلفة كاشفات مصباح هو في حوالي 1 دولار لكل رد فعل. أجهزة LAMP المستخدمة في هذا البروتوكول هي صغيرة ومنخفضة الصيانة والمحمولة. ويمكن التعامل مع أي طريقة التضخيم متساوي الحرارة التي تستخدم الكشف عن الهدف عن طريق قياس الفلورانس، وشملت مصباح. باستخدام برنامج LAMP، يمكن إنشاء تقارير شاملة بتنسيق متعدد (pdf، نص، وصورة).
التحقق من صحة الأسلوب هو خطوة هامة قبل أن يمكن اعتماد أسلوب جديد للاستخدام الروتيني. ومن الجدير بالذكر أن بروتوكول المصابيح المبلغ عنها هنا قد أكمل بنجاح التحقق من صحة المختبرات المتعددة19. مع دمج مؤخرا هذا البروتوكول مصباح في الولايات المتحدة FDA في BAM الفصل 5 السالمونيلا27, ومن المتوقع أن الطريقة سوف تكسب استخدام أوسع بكثير, سواء كوسيلة للفحص السريع في الغذاء الحيواني وكوسيلة تأكيد موثوق بها لعزلات السالمونيلا المفترضة من جميع فئات الغذاء.

Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة (مصباح) هو رواية اختبار تضخيم الحمض النووي متساوي المدى (iNAAT) اخترع في عام 2000 من قبل مجموعة من العلماء اليابانيين1. من خلال تشكيل هيكل الحمض النووي الجذعية حلقة محددة الهدف خلال الخطوات الأولية، يستخدم مصباح سليمر الحمض النووي الذي يُشرّد حبلاً لتضخيم هذه المادة بدءاً بشكل شبه أسي، مما أدى إلى 109 نسخ من الهدف في أقل من 1 ساعة1. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو NAAT مستخدم على نطاق واسع ، يمتلك مصباح العديد من المزايا. أولاً، يتم تنفيذ تفاعلات المصباح في ظل ظروف متساوية. هذا يغني الحاجة إلى آلة متطورة للدراجات الحرارية. ثانيا، مصباح متسامحة للغاية لوسائل الإعلام والثقافة والمواد البيولوجية2 مع متانة أظهرت للتطبيقات السريرية والغذائية على حد سواء3،4. هذا يبسط إعداد العينة ويقلل من النتائج السلبية الخاطئة5. ثالثاً، إن LAMP قابل لمنصات الكشف المتعددة، مثل العكر، وقياس الألوان، والإنارة الحيوية، والفلور، وميكروفيويديك6. رابعاً، إن LAMP محدد للغاية لأنه يستخدم أربعة إلى ستة اُبُر مصممة خصيصاً لاستهداف ست إلى ثماني مناطق محددة1و7. خامساً، إن LAMP شديد الحساسية والعديد من الدراسات التي أفادت عن حساسيتها الفائقة ل PCR أو PCR8في الوقت الحقيقي . وأخيرا، LAMP هو أسرع مع العديد من المقايسات اعتماد الآن 30 دقيقة وقت التشغيل القياسي في حين PCR من نوع المقايسات عادة ما تأخذ 1-2 ح8.
غذت هذه الميزات الجذابة تطبيق مصباح في مناطق الكشف عن مسببات الأمراض واسعة، بما في ذلك التشخيص في المختبر 9، تشخيص الأمراض الحيوانية10، والغذاء واختبارات البيئية11. والجدير بالذكر أنّ منظمة الصحة العالمية أوصت بإجراء اختبار بديل صالح لفحص المجهر باستخدام اللطخة البلغمية لتشخيص السل الرئوي في البيئات الطرفية12. تطبيق مصباح يمتد أيضا إلى ما بعد تحديد الميكروبات لتشمل الكشف عن المواد المسببة للحساسية، والأنواع الحيوانية، ومقاومة المخدرات، والكائنات المعدلة وراثيا، والمبيدات13.
السالمونيلا غير التيفويدي هو مسبب أمراض حيوانية لسلامة الأغذية كبيرة والصحة العامة القلق في جميع أنحاء العالم14. كما تم تحديدها كخطر مكروبي مهم في الغذاء للحيوانات (أي، الغذاء الحيواني)15،16. لمنع أمراض السالمونيلا / تفشي من الأغذية البشرية الملوثة والغذاء الحيواني، لا بد من وجود أساليب سريعة وموثوقة وقوية لاختبار السالمونيلا في مجموعة متنوعة من المصفوفات. في العقد الماضي، بذلت جهود كبيرة على الصعيد الدولي على تطوير وتطبيق مقايسات السالمونيلا لامب في مجموعة واسعة من مصفوفات الغذاء، كما لخصت مؤخرا في استعراض مستفيض8. وقد أكملت عدة اختبارات مصباح السالمونيلا، بما في ذلك واحد المعروضة هنا، بنجاح التحقق من صحة المختبرات المتعددة بعد المبادئ التوجيهية الدولية الراسخة17،18،19،20.
لدينا السالمونيلا مصباح فحص يستهدف على وجه التحديد في غزو السالمونيلا الجينات invA (GenBank الانضمام رقم M90846)21 وسريعة وموثوقة وقوية في مصفوفات الغذاء متعددة4,22,23,24,25,26. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة في ستة مصفوفات الأغذية الحيوانية في دراسة قبل26 وفي الغذاء الكلب الجاف في دراسة تعاونية متعددة المختبرات19. ونتيجة لذلك، تم مؤخرا إدراج طريقة مصباح السالمونيلا المعروضة هنا في الولايات المتحدة للأغذية والعقاقير (FDA) في دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) الفصل 5 السالمونيلا27 لخدمة غرضين، واحد كوسيلة فحص سريع لوجود السالمونيلا في الغذاء الحيواني واثنين كوسيلة تأكيد موثوق بها لسالمونيلا المفترضة معزولة عن جميع الأطعمة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>299070</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water (BPW)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218105</td>
			<td>Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>7010</td>
			<td>Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie Explorer software</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>Version 2.0.6.3</td>
			<td>Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie II or Genie III (LAMP instrument)</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GEN2-02 or GEN3-02</td>
			<td>A small instrument capable of temperature control up to 100 &#176;C with &#177; 0.1 &#176;C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>OP-0008</td>
			<td>8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip holder</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GBLOCK</td>
			<td>Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SA48-500</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>88-860-022</td>
			<td>Heats samples at 100 &#177; 1 oC for DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>3960</td>
			<td>Standard laboratory incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-001 isothermal master mix</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>ISO-001</td>
			<td>An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>A416</td>
			<td>Disinfects work surfaces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td>
			<td>Custom</td>
			<td>LAMP primers with detailed information in Table 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td>
			<td>22620207</td>
			<td>MiniSpin plus personal microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Standard microcentrifuge tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AM9938</td>
			<td>Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R01202</td>
			<td>Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone water</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218071</td>
			<td>Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td>
			<td>Pipet Lite LTS series</td>
			<td>Standard laboratory pipettes and tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrepMan Ultra sample preparation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>4318930</td>
			<td>A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella reference strain LT2</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>700720</td>
			<td>Salmonella reference strain used as positive control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase soy broth (TSB)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>211768</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Standard laboratory vortex mixer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whirl-pak filter bag</td>
			<td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td>
			<td>B01318</td>
			<td>Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation

وقد برز التضخيم متساوي الحراري (مصباح) بوساطة حلقة كاختبار قوي التضخيم حمض النووي للكشف السريع عن العديد من العوامل البكتيرية والفطرية والطفيلية والفيروسية. السالمونيلا هي مسببة أمراض بكتيرية للقلق سلامة الأغذية في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك الغذاء للحيوانات. هنا هو متعدد المختبرات التحقق من صحة السالمونيلا لامب البروتوكول الذي يمكن استخدامه لفحص بسرعة الغذاء الحيواني لوجود التلوث السالمونيلا ويمكن أيضا أن تستخدم لتأكيد عزل السالمونيلا المفترضة تعافى من جميع فئات المواد الغذائية. ويستهدف فحص المصباح على وجه التحديد جين غزو السالمونيلا (invA)وسريعة وحساسة ومحددة للغاية. يتم إعداد DNAs قالب من مرق إثراء من الأغذية الحيوانية أو الثقافات النقية لعزل السالمونيلا المفترضة. يتم إعداد خليط مُكْشف المصباح من خلال الجمع بين مزيج رئيسي متساوي الحرارة، واعمدة، وقوالب حمض نووي، والمياه. يعمل مقايسة المصباح عند درجة حرارة ثابتة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم رصد النتائج الإيجابية عن طريق الفلوريس في الوقت الحقيقي ويمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 5 دقائق. اختبار المصباح معارض التسامح عالية لمثبطات في الغذاء الحيواني أو الثقافة المتوسطة، بمثابة سريعة وموثوقة وقوية، فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستعمال لفحص وتأكيد السالمونيلا. وقد تم مؤخرا إدراج طريقة مصباح في الولايات المتحدة للأغذية والدواء دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) الفصل 5.

الشكل 2 والشكل 3 تظهر الرسوم البيانية المصابيح التمثيلية / الجداول المعروضة على كلا المنصات. في هذا تشغيل المصباح، عينات S1 إلى S6 هي 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من S. enterica serovar ATCC ATCC 51741 تتراوح بين 1.1 × 106 CFU إلى 11 CFU لكل رد فعل. السيطرة الإيجابية هو S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) في 1.7 × 104 CFU لكل رد فعل NTC هو المياه الصف الجزيئية.
كما هو مبين في الشكل 2E و 3G الشكل، كل من المجلس الوطني الانتقالي و آبار الكمبيوتر هي ضوابط صالحة. المجلس الوطني الانتقالي جيدا لديه T ماكس فارغة في حين أن T m هو < 83 درجة مئوية على لوحة أداة مصباح وفارغة في برنامج مصباح، مما يشير إلى نتيجة سلبية. الكمبيوتر جيدا لديه Tكحد أقصى من 7 دقيقة 45 ثانية و T م من ~ 90 درجة مئوية على كلا المنصات، مما يشير إلى نتيجة إيجابية. عينات S1 إلى S6 لديها Tكحد أقصى بين 6 دقيقة 30 ثانية و 12 دقيقة 15 ثانية، وكلها السالمونيلا-إيجابية.
بعد تشغيل مكررة من نفس المجموعة من العينات، يتم الإبلاغ عن نتائج المصباح النهائية لهذه العينات. هذا التمثيل مصباح تشغيل يبين أن المصباح يكشف بنجاح السالمونيلا مع مجموعة واسعة من التركيزات في العينات.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> الشكل 2: عرض نتائج المصباح التمثيلية على لوحة أداة LAMP. (A) تعرض علامة التبويب الملف الشخصي ملف درجة الحرارة المبرمج. (B) علامة التبويب درجة الحرارة يظهر درجات الحرارة الفعلية في الآبار عينة كما امبال رد فعل العائدات. (C) علامة التبويب التضخيم يظهر قراءات الفلوريسنس أثناء تضخيم المصباح. (D)علامة التبويب الـ Anneal تظهر التغيرات في الفلور (المشتق) خلال مرحلة الـ(هابل). (E) تظهر علامة التبويب "النتائج" طريقة عرض جدولية لنتائج المصباح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> الشكل 3: نتائج المصابيح التمثيلية التي يتم عرضها في برنامج LAMP. (A) تعرض علامة التبويب الملف الشخصي ملف درجة الحرارة المبرمج. (B) علامة التبويب درجة الحرارة يظهر درجات الحرارة الفعلية في الآبار عينة كما امبال رد فعل العائدات. (C) علامة التبويب التضخيم يظهر قراءات الفلوريسنس أثناء تضخيم المصباح. (D) علامة التبويب معدل التضخيم يظهر التغيرات في الفلوريسنس (نسبة الفلوريسين) أثناء تضخيم المصباح. (E) علامة التبويب الـ Anneal تعرض قراءات الفلورانس أثناء مرحلة الوَل. (F) علامة التبويب مشتقة الولاي تظهر التغيرات في الفلور (المشتق) خلال المرحلة اللدّية. (G) تظهر علامة التبويب النتيجة عرض جدولي لنتائج المصباح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation at JoVE.com

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

التضخيم الحراري الأيزوحرارية (LAMP) بوساطة حلقة هو اختبار تضخيم حمض النوى الحرارية (iNAAT) الذي اجتذب اهتمامًا واسعًا في مجال الكشف عن مسببات الأمراض. هنا، نقدم بروتوكول مصباح السالمونيلا متعدد المختبرات كوسيلة سريعة وموثوقة وقوية لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا المفترضة من عزلة الثقافة.

Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

مزمن السالمونيلا نموذج الفأر المصاب

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

تحديد الكفاءة الإنجابية التي تؤكد بداية البلوغ، والقيام تحليل خصوبة في الفئران والجرذان

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...