Name: loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation at JoVE.com

Forfatterne takker medlemmer af FDA's Microbiology Methods Validation Underudvalget (MMVS) og Bacteriological Analytical Manual (BAM) Rådet for kritisk gennemgang Salmonella LAMP metode validering undersøgelser.

<ol>
	<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).</li><li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances.">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications.">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li><li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template.">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li><li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP).">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li><li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers.">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li><li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed:+Current+applications+and+future+directions.">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li><li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li><li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+(OIE)+notifiable+viral+diseases+of+ruminants,+swine+and+poultry.">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li><li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li><li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification:+Beyond+microbial+identification.">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).</li><li>. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013)</li><li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+(MDA)+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces:+collaborative+study,+first+action+2016.01.">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li><li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+loop-mediated+amplification/ISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica.">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li><li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food.">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).</li><li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella.">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li><li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA:+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family.">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li><li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li><li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid,+reliable,+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce.">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li><li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time.">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).</li><li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food.">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. De synspunkter, der kommer til udtryk i dette manuskript, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis den officielle politik fra Department of Health and Human Services, U.S. Food and Drug Administration eller den amerikanske regering. Henvisning til kommercielle materialer, udstyr eller processer udgør på ingen måde godkendelse, godkendelse eller anbefaling fra Food and Drug Administration.

Vi har her fremlagt en enkel, hurtig, specifik og følsom LAMP-metode til screening og bekræftelse af salmonella i henholdsvis dyrefoder og ren kultur. Med bekvemmeligheden af en isotermisk master mix, der indeholder fire centrale reagenser, og en klar til brug, in-house forberedt primer mix, samle en LAMP reaktion kræver kun et par pipetter trin (Figur 1). Den samlede køretid inklusive forstærknings- og annealfaser er mindre end 38 min. Positive resultater overvåges via fluorescens i realtid(figur 2C og figur 3C,D) og kan påvises allerede kl. Annealfasen tjener som en ekstra bekræftelse af LAMP's specificitet, da kun prøver med korrekt Tm (ca. 90 °C) rapporteres som positive(figur 2D, E og figur 3E−G). Følsomheden af 1 Salmonellacelle i ren kultur og < 1 CFU/25 g i dyrefoder er tidligere blevet rapporteret26.
Da LAMP er ret effektiv og genererer en stor mængde DNA1, er det afgørende, at bedste laboratoriepraksis bruges til at forhindre krydskontaminering, hvilket kan omfatte fysisk adskillelse af områderne til forberedelse af LAMP-masterblandingen og tilføjelse af DNA-skabeloner, undgå at generere aerosoler, bruge filterpipettespidser, skifte handsker ofte og afstå fra at åbne LAMP-reaktionsrør efter forstærkning.
Specificiteten af denne Salmonella LAMP-metode blev tidligere testet ved hjælp af 300 bakteriestammer (247 Salmonella på 185 serovars og 53ikke-Salmonella) og påvist at være 100% specifikke26. Især blev der observeret betydelige forskelle i Tmax mellem de to Salmonella arter, S. enterica og Salmonella bongori, og blandt S. enterica underarter, især subsp. arizonae (IIIa)26. Ikke desto mindre var disse stadig gyldige positive resultater i henhold til reglerne for fortolkning af LAMP-resultater. I vores multi-laboratorium kollaborativ undersøgelse i tør hundemad, som involverede 14 analytikere19, prøver, der har inkonsekvente resultater i dobbelt LAMP kører blev lejlighedsvis observeret. Disse involverede normalt prøver med forsinkede positive resultater(Tmax > 15 min). Hvis du gentager begge kørsler uafhængigt, blev problemet normalt løst. Mere sjældent observerede vi prøver med korrekte Tm, men ingen eller uregelmæssige Tmax-værdier (< 5 min). Dette var normalt forårsaget af luftbobler i reaktionsrøret.
Gennem hele livscyklus LAMP metode udvikling, evaluering, prækoborativ undersøgelse, og multi-laboratorium validering, har vi observeret høj tolerance over for LAMP til hæmmere i forskellige animalske fødevarer eller fødevarer matricer og kultur medier4,19,22,23,24, fremhæver robusthed af metoden og samarbejder med en lang række andre undersøgelser på globalt plan8. Dette er bedre sammenlignet med PCR eller REAL-TIME PCR, som normalt kræver en intern forstærkningskontrol for at sikre, at negative resultater ikke skyldes matrixhæmning28. Desuden viste LAMP lignende (eller overlegen) specificitet og følsomhed sammenlignet med PCR eller REAL-TIME PCR i langt de fleste undersøgelser8. Omkostningerne ved LAMP reagenser er på omkring $ 1 per reaktion. De LAMP-instrumenter, der bruges i denne protokol, er små, vedligeholdelsesfrie og bærbare. De kan håndtere enhver isotermisk forstærkningsmetode, der anvender måldetektering ved fluorescensmåling, medfølger LAMP. Ved hjælp af LAMP-softwaren kan omfattende rapporter genereres i flere formater (pdf, tekst og billede).
Metodevalidering er et kritisk trin, før der kan anvendes en ny metode til rutinemæssig brug. Det er bemærkelsesværdigt, at lampeprotokollen, der er rapporteret her, har gennemført validering af flere laboratorier19. Med den nylige inkorporering af denne LAMP-protokol i den amerikanske FDA's BAM Kapitel 5 Salmonella27, forventes det, at metoden vil få meget bredere anvendelse, både som en hurtig screeningsmetode i dyrefoder og som en pålidelig bekræftelsesmetode for formodede Salmonella-isolater fra alle fødevarekategorier.

Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) er en ny isotermisk nukleinsyreforstærkningstest (iNAAT), der blev opfundet i 2000 af en gruppe japanske forskere1. Gennem dannelsen af en målspecifik stem-loop DNA-struktur i de indledende trin bruger LAMP en strengfortrængende DNA-polymerase til effektivt at forstærke dette udgangsmateriale kvasi-eksponentielt, hvilket resulterer i 109 kopier af målet på mindre end 1 h1. Sammenlignet med polymerase kædereaktion (PCR), en udbredt NAAT, LAMP besidder flere fordele. For det første udføres LAMP-reaktioner under isotermiske forhold. Dette undgår behovet for et sofistikeret termisk cykelinstrument. For det andet er LAMP meget tolerant over for kulturmedier og biologiske stoffer2 med robusthed demonstreret til både kliniske og fødevareapplikationer3,4. Dette forenkler prøveforberedelsen og minimerer falske negative resultater5. For det tredje er LAMP modtagelig for flere detektionsplatforme, såsom uklarhed, colorimetry, bioluminescens, fluorescens og mikrofluidics6. For det fjerde er LAMP meget specifik, da den bruger fire til seks specialdesignede primere til at målrette seks til otte specifikke regioner1,7. For det femte, LAMP er ultrasensitive og talrige undersøgelser har rapporteret sin overlegne følsomhed over for PCR eller real-time PCR8. Endelig lampe er hurtigere med mange assays nu vedtage en 30 min standard køretid, mens PCR-type assays normalt tage 1−2 h8.
Disse attraktive egenskaber gav næring til anvendelsen af LAMP i områder med detektion af bred patogen, herunder in vitro-diagnostik 9, dyresygdomsdiagnostik10og fødevare- og miljøtest11. Who har især anbefalet en TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberkulose)som en gyldig erstatningstest for sputum-smearmikroskopi for lungetuberkulosediagnoser i perifere miljøer12. LAMP-applikationen udvides også ud over mikrobiel identifikation til også at omfatte påvisning af allergener, dyrearter, lægemiddelresistens, genetisk modificerede organismer og pesticider13.
Nontyphoidal Salmonella er et zoonotisk patogen med betydelig fødevaresikkerhed og folkesundhed på verdensplan14. Det er også blevet identificeret som en vigtig mikrobiel fare i fødevarer til dyr (dvs. dyrefoder)15,16. For at forhindre Salmonella-sygdomme/-udbrud fra forurenede fødevarer til mennesker og animalske fødevarer er det bydende nødvendigt at have hurtige, pålidelige og robuste metoder til at teste Salmonella i en række forskellige matricer. I det seneste årti er der gjort en betydelig indsats internationalt med hensyn til udvikling og anvendelse af Salmonella LAMP-analyse i en lang række fødevarematricer, som for nylig opsummeret i en omfattende gennemgang8. Flere Salmonella LAMP assays, herunder den her præsenterede, har med succes afsluttet multi-laboratorium validering efter veletablerede internationale retningslinjer17,18,19,20.
Vores Salmonella LAMP assay specifikt rettet mod Salmonella invasion gen invA (GenBank tiltrædelse nummer M90846)21 og er hurtig, pålidelig og robust i flere fødevarer matricer4,22,23,24,25,26. Metoden er valideret i seks dyrefodermatrixer i en prækoborativ undersøgelse26 og i tør hundemad i et multilaboratoriekooperativt studie19. Som følge heraf er Salmonella LAMP-metoden, der præsenteres her, for nylig blevet indarbejdet i U.S. Food and Drug Administration (FDA)s Bacteriological Analytical Manual (BAM) Kapitel 5 Salmonella27 for at tjene to formål, en som en hurtig screeningsmetode for tilstedeværelsen af Salmonella i dyrefoder og to som en pålidelig bekræftelsesmetode for formodede Salmonella isoleret fra alle fødevarer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>299070</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water (BPW)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218105</td>
			<td>Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>7010</td>
			<td>Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie Explorer software</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>Version 2.0.6.3</td>
			<td>Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie II or Genie III (LAMP instrument)</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GEN2-02 or GEN3-02</td>
			<td>A small instrument capable of temperature control up to 100 &#176;C with &#177; 0.1 &#176;C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>OP-0008</td>
			<td>8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip holder</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GBLOCK</td>
			<td>Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SA48-500</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>88-860-022</td>
			<td>Heats samples at 100 &#177; 1 oC for DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>3960</td>
			<td>Standard laboratory incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-001 isothermal master mix</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>ISO-001</td>
			<td>An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>A416</td>
			<td>Disinfects work surfaces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td>
			<td>Custom</td>
			<td>LAMP primers with detailed information in Table 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td>
			<td>22620207</td>
			<td>MiniSpin plus personal microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Standard microcentrifuge tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AM9938</td>
			<td>Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R01202</td>
			<td>Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone water</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218071</td>
			<td>Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td>
			<td>Pipet Lite LTS series</td>
			<td>Standard laboratory pipettes and tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrepMan Ultra sample preparation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>4318930</td>
			<td>A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella reference strain LT2</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>700720</td>
			<td>Salmonella reference strain used as positive control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase soy broth (TSB)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>211768</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Standard laboratory vortex mixer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whirl-pak filter bag</td>
			<td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td>
			<td>B01318</td>
			<td>Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation

Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) har vist sig som en kraftfuld nukleinsyreforstærkningstest til hurtig påvisning af adskillige bakterielle, svampe-, parasitære og virale midler. Salmonella er et bakterielt patogen af verdensomspændende fødevaresikkerhedsproblem, herunder fødevarer til dyr. Præsenteret her er en multi-laboratorium-valideret Salmonella LAMP protokol, der kan bruges til hurtigt at screene animalske fødevarer for tilstedeværelsen af Salmonella forurening og kan også bruges til at bekræfte formodede Salmonella isolater inddrives fra alle fødevarekategorier. LAMP-analysen er specifikt rettet mod Salmonella-invasionsgenet (invA) og er hurtigt, følsomt og meget specifikt. Skabelon-DNO'er fremstilles af berigelses bouillon af dyrefoder eller rene kulturer af formodede Salmonella-isolater. LAMP reagensblandingen fremstilles ved at kombinere en isotermisk masterblanding, primere, DNA-skabelon og vand. LAMP-analysen kører ved en konstant temperatur på 65 °C i 30 min. Positive resultater overvåges via fluorescens i realtid og kan påvises så tidligt som 5 min. LAMP-analysen udviser høj tolerance over for hæmmere i dyrefoder eller kulturmedie, der tjener som en hurtig, pålidelig, robust, omkostningseffektiv og brugervenlig metode til screening og bekræftelse af Salmonella. LAMP-metoden er for nylig blevet indarbejdet i U.S. Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual (BAM) kapitel 5.

Figur 2 og figur 3 viser repræsentative LAMP-grafer/tabeller, der vises på begge platforme. I denne LAMP-kørsel er prøverne S1 til S6 10 gange serielle fortyndinger af S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 fra 1,1 x 106 CFU til 11 CFU pr. reaktion. Positiv kontrol er S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ved 1,7 x 104 CFU pr. reaktion, og NTC er vand af molekylær kvalitet.
Som vist i figur 2E og figur 3Ger både NTC- og PC-brønde gyldige kontrolelementer. NTC-brønden har tom Tmax, mens Tm er < 83 °C på LAMP instrumentpanelet og blank i LAMP-softwaren, hvilket tyder på et negativt resultat. Pc-brønden har enT-max på 7 min. 45 sek. og Tm på ~ 90 °C på begge platforme, hvilket tyder på et positivt resultat. Prøver S1 til S6 har Tmax mellem 6 min 30 sek og 12 min 15 sek, alle salmonella-positive.
Efter dobbeltkørsler af det samme sæt prøver rapporteres de endelige LAMP-resultater for disse prøver. Denne repræsentative LAMP-kørsel viser, at LAMP med succes registrerer Salmonella med en bred vifte af koncentrationer i prøverne.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> Figur 2: Repræsentative LAMP-resultater, der vises på LAMP-instrumentpanelet. (a)Fanen Profil viser den programmerede temperaturprofil. (B) Temperaturfanen viser de faktiske temperaturer i prøvebrøndene, efterhånden som LAMP-reaktionen fortsætter. (C) Forstærkningsfanen viser lysstofmålinger under LAMP-forstærkning. (D) Fanen Anneal viser ændringer i fluorescens (afledt) i annealfasen. (E) Fanen Resultater viser en tabelvisning af LAMP-resultaterne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> Figur 3: Repræsentative LAMP-resultater set i LAMP-softwaren. (a)Fanen Profil viser den programmerede temperaturprofil. (B) Temperaturfanen viser de faktiske temperaturer i prøvebrøndene, efterhånden som LAMP-reaktionen fortsætter. (C) Forstærkningsfanen viser lysstofmålinger under LAMP-forstærkning. (D) Fanen Forstærkningshastighed viser ændringer i lysstof (fluorescensforhold) under LAMP-forstærkning. (E) Fanen Anneal viser fluorescensaflæsninger i annealfasen. (F) Fanen Anneal-derivat viser ændringer i fluorescens (afledt) i annealfasen. (G) Fanen Resultat viser en tabelvisning af LAMP-resultaterne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation at JoVE.com

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) er en isotermisk nukleinsyreforstærkningstest (iNAAT), der har tiltrukket sig bred interesse for patogendetektionsfeltet. Her præsenterer vi en multilaboratorie-valideret Salmonella LAMP-protokol som en hurtig, pålidelig og robust metode til screening af Salmonella i dyrefoder og bekræftelse af formodede Salmonella fra kulturisolation.

Loop-medieret isotermisk forstærkning til screening af salmonella i dyrefoder og bekræftelse af salmonella fra kulturisolation

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

En simpel højeffektiv protokol til den pankreatiske ø-isolation fra mus

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

Bestemmelse af reproduktive kompetence ved bekræfter puberteten indsættende og udføre en fertilitet Assay i mus og rotter

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Kvasi-metagenomic analyse af Salmonella fra mad og miljøprøver

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...