Name: loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation at JoVE.com

המחברים מודים לחברי ועדת המשנה לאימות שיטות מיקרוביולוגיה (MMVS) ומועצת המדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של ה-FDA על סקירה ביקורתית של מחקרי אימות שיטת סלמונלה LAMP.

<ol>
	<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).</li><li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances.">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications.">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li><li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template.">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li><li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP).">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li><li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers.">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li><li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed:+Current+applications+and+future+directions.">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li><li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li><li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+(OIE)+notifiable+viral+diseases+of+ruminants,+swine+and+poultry.">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li><li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP):+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li><li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification:+Beyond+microbial+identification.">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).</li><li>. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013)</li><li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+(MDA)+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces:+collaborative+study,+first+action+2016.01.">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li><li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+loop-mediated+amplification/ISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica.">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li><li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food.">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).</li><li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella.">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li><li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA:+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family.">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li><li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li><li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid,+reliable,+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce.">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li><li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time.">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).</li><li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food.">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. הדעות המובעות בכתב יד זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את המדיניות הרשמית של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, מינהל המזון והתרופות האמריקאי או ממשלת ארה"ב. התייחסות לחומרים מסחריים, ציוד או תהליך כלשהו אינה מהווה בשום אופן אישור, אישור או המלצה של מינהל המזון והתרופות האמריקאי.

הצגנו כאן שיטת LAMP פשוטה, מהירה, ספציפית ורגישה להקרנה ואישור סלמונלה במזון מן החי ובתרבות הטהורה, בהתאמה. עם הנוחות של תערובת מאסטר איזותרמית המכילה ארבעה מגיבים מרכזיים, ותמהיל פריימר מוכן לשימוש, שהוכן בתוך הבית, הרכבת תגובת LAMP דורשת רק כמה שלבי צנרת (איור 1). זמן הריצה הכולל, כולל שלבי הגברה ואנאל, הוא פחות מ-38 דקות(איור 2A, B ואיור 3אמפר,B). תוצאות חיוביות מנוטרות באמצעות פלואורסצנטיות בזמן אמת (איור 2C ואיור 3C,D)וניתן לזהות אותן כבר ב-5 דקותו-26 דקות. שלב האנאל משמש כאישור נוסף לספציפיות LAMP מכיוון שרק דגימות עם Tm נכון (בסביבות 90 °C (בסביבות 90 °C)) מדווחות כחיוביות(איור 2D,E ואיור 3E-G). רגישויות של 1 תא סלמונלה בתרבות טהורה < 1 CFU/25 גרם במזון לבעלי חיים דווחו בעבר26.
כמו LAMP הוא יעיל למדי ומייצר כמות גדולה של DNA1, זה קריטי כי שיטות העבודה הטובות ביותר במעבדה משמשים למניעת זיהום צולב, אשר עשויים לכלול פיזית הפרדה בין האזורים להכנת תערובת הורים LAMP והוספת תבניות DNA, הימנעות יצירת אירוסולים, באמצעות טיפים פיפט מסנן, החלפת כפפות לעתים קרובות, והימנעות מפתיחת צינורות תגובה LAMP לאחר הגברה.
הספציפיות של שיטת סלמונלה LAMP זו נבדקה בעבר באמצעות 300 זנים חיידקיים (247 סלמונלה של 185 סרוברים ו 53 שאינםסלמונלה) והוכח להיות 100% ספציפי26. יש לציין כי הבדלים משמעותיים ב- Tmax נצפו בין שני מיני הסלמונלה, S. enterica וסלמונלה בונגורי, ובין תת המין S. enterica, במיוחד subsp. arizonae (IIIa)26. עם זאת, אלה היו עדיין תוצאות חיוביות תקפות לפי הכללים לפרש תוצאות LAMP. במחקר הרב-מעבדתי שלנו במזון לכלבים יבשים שכלל 14 אנליסטים19, נצפו מדי פעם דגימות עם תוצאות לא עקביות בריצות LAMP כפולות. אלה בדרך כלל מעורבים דגימות עם תוצאות חיוביות מעוכבות (Tmax > 15 דקות). חזרה על שתי ההפעלות באופן עצמאי פתרה בדרך כלל את הבעיה. לעתים רחוקות יותר, ראינו דגימות עם ערכי Tm נכונים אך לא או לא סדירים Tmax (< 5 דקות). זה נגרם בדרך כלל על ידי בועות אוויר בצינור התגובה.
לאורך מחזור החיים של פיתוח שיטת LAMP, הערכה, מחקר precollaborative, אימות רב מעבדה, ראינו סובלנות גבוהה של LAMP למעכבים במזון מן החי שונים או מטריצות מזון ומדיה תרבות4,19,22,23,24, הדגשת החוסן של השיטה ושיתוף מחקרים רבים אחרים בקנה מידה עולמי8. זה עדיף בהשוואה PCR או PCR בזמן אמת, אשר בדרך כלל דורש בקרת הגברה פנימית כדי להבטיח כי תוצאות שליליות אינן בשל עיכוב מטריקס28. יתר על כן, LAMP הפגינה ספציפיות ורגישות דומות (או מעולות) בהשוואה ל- PCR או PCR בזמן אמת ברוב המכריע של מחקרים8. העלות של ריאגנטים LAMP הוא על $1 לכל תגובה. מכשירי LAMP המשמשים בפרוטוקול זה הם קטנים, בעלי תחזוקה נמוכה וניידים. הם יכולים להתמודד עם כל שיטת הגברה isothermal המעסיקה זיהוי היעד על ידי מדידת פלואורסצנטיות, LAMP כלול. באמצעות תוכנת LAMP, ניתן ליצור דוחות מקיפים בפורמט מרובה (pdf, טקסט ותמונה).
אימות פעולת שירות הוא שלב קריטי לפני שניתן יהיה לאמץ שיטה חדשה לשימוש שגרתי. ראוי לציין כי פרוטוקול LAMP שדווח כאן השלים בהצלחה אימות מרובה מעבדות19. עם השילוב האחרון של פרוטוקול LAMP זה לתוך ארה"ב. ה-FDA של BAM פרק 5 סלמונלה27, צפוי כי השיטה תרוויח שימוש רחב הרבה יותר, הן כשיטת סינון מהירה במזון מן החי והן כשיטת אישור אמינה לסלמונלה המשוערת מבודדת מכל קטגוריות המזון.

הגברה איסותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין איסותרמית חדשנית (iNAAT) שהומצא בשנת 2000 על ידי קבוצה של מדענים יפנים1. באמצעות היווצרות מבנה DNA ספציפי לגזע-לולאת במהלך השלבים הראשונים, LAMP משתמשת פולימראז DNA עקירת גדילים כדי להגביר ביעילות את החומר ההתחלתי הזה מעין אקספוננציאלית, וכתוצאה מכך 109 עותקים של היעד בפחות מ 1 שעות1. בהשוואה לתגובת שרשרת פולימראז (PCR), NAAT בשימוש נרחב, LAMP יש מספר יתרונות. ראשית, תגובות LAMP מתבצעות בתנאים איסותרמיים. זה מייתר את הצורך במכשיר רכיבה תרמי מתוחכם. שנית, LAMP סובלנית מאוד למדיית תרבות וחומרים ביולוגיים2 עם חוסן שהוכח עבור יישומים קליניים ומזון3,4. פעולה זו מפשטת את ההכנה לדוגמה וממזערת תוצאות שליליות כוזבות5. שלישית, LAMP נוח לפלטפורמות זיהוי מרובות, כגון מערבולת, צבעים, ביולומינציה, פלואורסצנטיות ומיקרופלואידיקה6. רביעית, LAMP הוא מאוד ספציפי כפי שהוא משתמש ארבעה עד שישה פרייומרים שתוכננו במיוחד כדי למקד שישה עד שמונה אזורים ספציפיים1,7. החמישית, LAMP הוא רגיש במיוחד ומחקרים רבים דיווחו על רגישות מעולה שלה PCR או PCR בזמן אמת8. לבסוף, LAMP הוא מהיר יותר עם מבחנים רבים עכשיו לאמץ זמן ריצה סטנדרטי 30 דקות בעוד PCR סוג מבחנים בדרך כלל לקחת 1-2 שעות8.
תכונות אטרקטיביות אלה תדלקו את היישום של LAMP באזורים רחבים לגילוי פתוגן, כוללאבחון במבחנה 9 , אבחון מחלות בעליחיים 10, ובדיקות מזון וסביבה11. יש לציין, TB-LAMP (מנורה עבור שחפת Mycobacterium) הומלץ על ידי WHO כמבחן חלופי תקף עבור מיקרוסקופיה מריחת כיח עבור אבחונים שחפת ריאות בהגדרות היקפיות12. יישום LAMP מתרחב גם מעבר לזיהוי מיקרוביאלי כדי לכלול גילוי של אלרגנים, מיני בעלי חיים, עמידות לסמים, אורגניזמים מהונדסים גנטית וחומרי הדברה13.
סלמונלה לא הטיפוסית היא פתוגן זואונוטי של בטיחות מזון משמעותית ודאגה לבריאות הציבור ברחבי העולם14. הוא זוהה גם כמפגע מיקרוביאלי חשוב במזון לבעלי חיים (כלומר, מזון לבעליחיים) 15,16. כדי למנוע מחלות/התפרצויות סלמונלה ממזון אנושי מזוהם ומזון לבעלי חיים, חובה על שיטות מהירות, אמינות וחזקות לבדיקת סלמונלה במגוון מטריצות. בעשור האחרון נעשו מאמצים ניכרים ברחבי העולם בפיתוח ויישום של מבחני סלמונלה LAMP במגוון רחב של מטריצות מזון, כפי שסוכם לאחרונה בסקירה מקיפה8. מספר מבחני מנורת סלמונלה, כולל זה המוצג כאן, השלימו בהצלחה אימות רב מעבדה בעקבות הנחיות בינלאומיות מבוססות היטב17,18,19,20.
מבחני מנורת הסלמונלה שלנו מתמקדים במיוחד בגן הפלישה לסלמונלה invA (מספר הצטרפות GenBank M90846)21 והוא מהיר, אמין וחזק במספר מטריצות מזון4,22,23,24,25,26. השיטה קיבלה תוקף בשש מטריצות מזון מן החי במחקר טרום קולבוריטיבי26 ובמזון לכלבים יבשים במחקר רב מעבדתימשותף 19. כתוצאה מכך, שיטת סלמונלה LAMP המוצגת כאן שולבה לאחרונה במינהל המזון והתרופות האמריקאי (המדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של ה-FDA פרק 5 סלמונלה27 לשרת שתי מטרות, אחת כשיטת סינון מהירה לנוכחות סלמונלה במזון מן החי ושתיים כשיטת אישור אמינה לסלמונלה חזקה מבודדת מכל המזונות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>299070</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water (BPW)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218105</td>
			<td>Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA AWAY</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>7010</td>
			<td>Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie Explorer software</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>Version 2.0.6.3</td>
			<td>Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie II or Genie III (LAMP instrument)</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GEN2-02 or GEN3-02</td>
			<td>A small instrument capable of temperature control up to 100 &#176;C with &#177; 0.1 &#176;C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>OP-0008</td>
			<td>8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 &#181;l.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie strip holder</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>GBLOCK</td>
			<td>Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SA48-500</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>88-860-022</td>
			<td>Heats samples at 100 &#177; 1 oC for DNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>3960</td>
			<td>Standard laboratory incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISO-001 isothermal master mix</td>
			<td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td>
			<td>ISO-001</td>
			<td>An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>A416</td>
			<td>Disinfects work surfaces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td>
			<td>Custom</td>
			<td>LAMP primers with detailed information in Table 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td>
			<td>22620207</td>
			<td>MiniSpin plus personal microcentrifuge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Standard microcentrifuge tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AM9938</td>
			<td>Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>R01202</td>
			<td>Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone water</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>218071</td>
			<td>Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA</td>
			<td>Pipet Lite LTS series</td>
			<td>Standard laboratory pipettes and tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrepMan Ultra sample preparation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>4318930</td>
			<td>A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella reference strain LT2</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>700720</td>
			<td>Salmonella reference strain used as positive control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase soy broth (TSB)</td>
			<td>BD Diagnostic Systems, Sparks, MD</td>
			<td>211768</td>
			<td>Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Standard laboratory vortex mixer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whirl-pak filter bag</td>
			<td>Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI</td>
			<td>B01318</td>
			<td>Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loop-mediated isothermal amplification for screening salmonella in animal food and confirming salmonella from culture isolation

הגברה איסותרמית בתיווך לולאה (LAMP) התגלתה כבדיקת הגברה עוצמתית של חומצת גרעין לגילוי מהיר של סוכנים חיידקיים, פטרייתיים, טפיליים ויראליים רבים. סלמונלה היא פתוגן חיידקי של דאגה עולמית לבטיחות מזון, כולל מזון לבעלי חיים. מוצג כאן הוא פרוטוקול רב מעבדה מאומת סלמונלה LAMP שניתן להשתמש בהם כדי לסנן במהירות מזון מן החי לנוכחות של זיהום סלמונלה והוא יכול לשמש גם כדי לאשר סלמונלה המשוער מבודד התאושש מכל קטגוריות המזון. מבחני LAMP מכוונים באופן ספציפי לגן הפלישה לסלמונלה (invA) והוא מהיר, רגיש וספציפי מאוד. DNAs תבנית מוכנים מרקים העשרה של מזון מן החי או תרבויות טהורות של סלמונלה המשוערת מבודדת. תערובת ריאגנט מנורה מוכנה על ידי שילוב של תערובת הורים isothermal, פרייומרים, תבנית DNA, ומים. בדיקת LAMP פועלת בטמפרטורה קבועה של 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. תוצאות חיוביות מנוטרות באמצעות פלואורסצנטיות בזמן אמת וניתן לזהותן כבר 5 דקות. בדיקת LAMP מפגינה עמידות גבוהה כלפי מעכבים במדיום מזון או תרבות מן החי, ומשמשת כשיטה מהירה, אמינה, איתנה, חסכונית וידידותית למשתמש לסינון ולאישור סלמונלה. שיטת LAMP שולבה לאחרונה במדריך האנליטי הבקטריולוגי (BAM) של מינהל המזון והתרופות האמריקאי (BAM) פרק 5.

איור 2 ואיור 3 מציגים גרפים/טבלאות LAMP מייצגים המוצגים בשתי הפלטפורמות. בהפעלת LAMP זו, דגימות S1 עד S6 הן דילול סדרתי פי 10 של S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 החל מ- 1.1 x 106 CFU עד 11 CFU לכל תגובה. שליטה חיובית היא S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ב 1.7 x 10 4 CFU לכלתגובה NTC הוא מים כיתה מולקולרית.
כפי שמוצג באיור 2E ובאיור 3G, הן בארות NTC והן בארות מחשב הן פקדים חוקיים. באר NTC יש Tmax ריק בעוד Tm הוא < 83 °C (70 °F) על לוח מכשיר LAMP וריק בתוכנת LAMP, מה שמרמז על תוצאה שלילית. המחשב גם יש Tמקסימום של 7 דקות 45 שניות ו Tm של ~ 90 °C (60 °F) על שתי הפלטפורמות, מה שמרמז על תוצאה חיובית. דגימות S1 כדי S6 יש Tמקסימום בין 6 דקות 30 שניות ו 12 דקות 15 שניות, כל להיות סלמונלה-חיובי.
לאחר ריצות כפולות של אותה קבוצת דגימות, תוצאות LAMP הסופיות מדווחות עבור דגימות אלה. ריצת LAMP מייצגת זו מראה כי LAMP מזהה בהצלחה סלמונלה עם מגוון רחב של ריכוזים בדגימות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> איור 2: תוצאות LAMP מייצגות המוצגות בלוח המכשירים של LAMP. (A)הכרטיסיה פרופיל מציגה את פרופיל הטמפרטורה מתוכנת. (B) הכרטיסיה טמפרטורה מציגה טמפרטורות בפועל בבארות המדגם כאשר תגובת LAMP ממשיכה. (C)הכרטיסייה הגברה מציגה קריאות פלואורסצנטיות במהלך הגברה של LAMP. (ד)הכרטיסייה Anneal מציגה שינויים בפלואורסצנטיות (נגזרת) במהלך שלב האנאל. (ה)הכרטיסיה תוצאות מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> איור 3: תוצאות LAMP מייצגות המוצגות בתוכנת LAMP. (A)הכרטיסיה פרופיל מציגה את פרופיל הטמפרטורה מתוכנת. (B) הכרטיסיה טמפרטורה מציגה טמפרטורות בפועל בבארות המדגם כאשר תגובת LAMP ממשיכה. (C)הכרטיסייה הגברה מציגה קריאות פלואורסצנטיות במהלך הגברה של LAMP. (D)הכרטיסיה קצב הגברה מציגה שינויים בפלואורסצנטיות (יחס פלואורסצנטיות) במהלך הגברה של LAMP. (E)הכרטיסייה Anneal מציגה קריאות פלואורסצנטיות בשלב האנאל. (ו)הכרטיסייה נגזרת Anneal מציגה שינויים בפלואורסצנטיות (נגזרת) במהלך שלב anneal. (G) הכרטיסיה 'תוצאה' מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation at JoVE.com

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

כרוני סלמונלה עכבר אינפקטד דגם

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

קביעת כשירות הרבייה על-ידי המאשר תחילת המתבגר וביצוע וזמינותו של פוריות ב עכברים וחולדות

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...