Name: vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging at JoVE.com

这项研究部分得到了NHLBI校内研究计划（DIR HL-006247）的支持。我们要感谢NIH鼠标成像设施在图像采集和分析方面的指导。

此处描述的所有方法都已获得国家心肺和血液研究所的机构动物护理和使用委员会 （ACUC） 的批准。
1. 准备
<ol><li>将小鼠内向注入肝素（1单位/克小鼠体重），并允许其调节2分钟。</li>
	<li>在CO2室中对动物实施安乐死 。</li>
	<li>将鼠标放在手术板上的超前位置，用胶带将四肢固定到手术板上。使用放大镜进行精细解剖。</li>
</ol>2. 暴露肺部和气管
...

正确执行，这种方法产生肺动脉网络的惊人图像，允许在啮齿动物模型中进行比较和实验。沿途的几个关键步骤确保了成功。首先，调查人员必须在准备阶段对动物进行肝素化，以防止血块在肺血管和心脏腔室中形成。这允许聚合物化合物的完全动脉传递。其次，当刺穿隔膜和去除肋骨时，注意保护肺部免受意外伤害、割伤或伤害。气道中的任何泄漏都会防止完全膨胀，使样品之间的比较不准确?...

该技术的重点是使用小鼠聚合物化合物的肺动脉结构可视化。虽然在脑、心脏,和肾脏,1、2、3、4、5,2,3等全身血管病床上进行了广泛的工作，但有关肺动脉网络的准备和填充的信息较少。4因此，本研究的目的是扩展先前的工作6，7，8，7,8并提供详细的书面和视觉参考，调查人员可以很容易地遵循，以产生肺动脉树的高分辨率图像。
虽然有许多方法存在标记和成像肺血管，如磁共振成像，超声心动图，或CT血管造影9,9，10，其中许多模式未能充分填充和/或捕获小血管，限制了可以研究的范围。串行分段和重建等方法提供高分辨率，但时间/劳动密集型11，12，13。,1311,在传统的腐蚀铸造10、13、14、15、16中10,13,14，周围的软组织,完整性受到损害。甚至动物的年龄和大小也成为因素，当试图引入导管或，分辨率是缺乏的。另一方面，聚合物注射技术将动脉填充到毛细管水平，当与 +CT 结合使用时，可实现无与伦比的分辨率 5。从小到产后第14天的小鼠肺部样本已成功施用8个，并在几个小时内得到处理。这些可以无限期地重新扫描，甚至发送组织学准备/电子显微镜（EM），而不损害现有的软组织17。此方法的主要限制是 CT 设备/软件的前期成本、准确监测血管内压力方面的挑战，以及无法在同一动物中纵向获取数据。
本文以现有工作为根据，进一步优化肺动脉注射技术，将年龄/尺寸相关边界推至产后第1天（P1），取得显著效果。对于想要研究动脉血管网络的团队来说，这是最有用的。因此，我们为导管放置/稳定提供新的指导，加强对填充率/体积的控制，并突出提高铸造成功率的显著缺陷。然后，结果铸件可用于未来的表征和形态分析。也许更重要的是，据我们所知，这是引导用户完成这个复杂过程的第一个视觉演示。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:829px;" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">1cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309659</td>
			<td style="width:346px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">20ml Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>03-340-25P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">30G Needle</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:135px;">Cornin</td>
			<td style="width:117px;">352098</td>
			<td>For sample Storage and scanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">7-0 silk suture</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:117px;">103-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Analyze 12.0 Software</td>
			<td style="width:135px;">AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Primary Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Amira 6.7 Software</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CeramaCut Scissors 9cm</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ceramic Coated Curved Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11272-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">CO2 Tank</td>
			<td style="width:135px;">Robert&#39;s Oxygen Co.</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dual syringe pump</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-74900-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dumont Mini-Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11200-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Pharmco</td>
			<td style="width:117px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma - Life Sciences</td>
			<td style="width:117px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Gauze</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">441215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:231px;">Hemostat</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Heparin (1000USP Units/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Hospira</td>
			<td style="width:117px;">NDC 0409-2720-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Horos Software</td>
			<td style="width:135px;">Horos Project</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">induction chamber</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">06-666</td>
			<td>fiber optic cleaning wipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Labelling Tape</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">15966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Magnetic Base</td>
			<td style="width:135px;">Kanetec</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micro-CT system</td>
			<td style="width:135px;">SkyScan&#160;</td>
			<td style="width:117px;">1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microfil (Polymer Compound)</td>
			<td style="width:135px;">Flowech Inc.</td>
			<td style="width:117px;">Kit B - MV-122</td>
			<td>8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:135px;">Stoelting</td>
			<td style="width:117px;">56131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Monoject 1/2 ml Insulin Syringe</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">1188528012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Octagon Forceps Straight Teeth</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Parafilm</td>
			<td style="width:135px;">Bemis company, Inc.</td>
			<td style="width:117px;">#PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:135px;">Instech</td>
			<td style="width:117px;">BTPE-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Phospahte buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">BioRad</td>
			<td style="width:117px;">#161-0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ring Stand</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S13747</td>
			<td>Height 24in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:135px;">sigma</td>
			<td style="width:117px;">71778-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Steel Plate</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>16 x 16 in. area, 1/16 in thick</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:231px;">Straight Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:117px;">360103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Surgical Board</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>12-587-20</td>
			<td>This is a converted slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Universal 3-prong clamp</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S24280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged Inf. Set 25X3/4, 12&#34; Tubing</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:117px;">PR25G19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zeiss Stemi-508 Dissection Scope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging

血管在三维空间中形成复杂的网络。因此，很难通过观察组织表面来直观地理解血管网络是如何相互作用和表现的。该方法提供了一种可视化肺部复杂三维血管结构的方法。
为此，导管插入肺动脉，血管同时冲洗血液和化学扩张，以限制阻力。然后，肺以标准压力通过气管膨胀，聚合物化合物以标准流速注入血管床。一旦整个动脉网络被填充并允许治愈，肺血管可以直接可视化或在微CT （μCT） 扫描仪上成像。
当手术成功时，可以欣赏从产后早期到成人的小鼠肺动脉网络。此外，在肺动脉床中演示时，此方法可应用于任何具有优化导管放置和端点的血管床。

一个成功的演员将展示整个肺动脉网络的均匀填充。我们在C57Bl/6J小鼠中演示了这一点：产后一天P90（图4A）、P30（图4B）、P7（图4C）和P1（图4D）。通过控制流量和目视监测填充的实时，最远程血管的可靠终点实现了（图5A）。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

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Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

该技术的目的是通过肺膨胀和通过肺动脉注射放射性不透明聚合物化合物，对早期产后小鼠和成年小鼠的肺动脉网络进行活体可视化。还讨论了铸造组织的潜在应用。

用于微CT成像的成人和早期产后小鼠肺的血管铸造

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

该协议为成年小鼠和产后早期小鼠的肺动脉血管铸造提供精确的分步指导。此技术使用户能够通过多种方法（包括微 CT）完全铸造整个血管网络进行可视化，同时保持软组织的完整性。这种技术对于研究肺血管形态和结构特别有用，但可以很容易地适应其他血管床的目标。像许多手术和解剖一样，实际上可视化程序是无可替代的，观众可能会从看到一些更具挑战性的手术中受益。一旦西腓体过程暴露，轻轻抓住并提升肋骨笼。小心地在现在暴露的半透明隔膜中切开一个切口。肺部将明显崩溃，并收回离隔膜。露出肺和气管后，将15厘米的PE10管子螺纹到30针的轮毂上。并附在PBS中含有10至4摩尔硝基钠的注射器上。推进柱塞以对油管进行加热，直到清除所有空气。作为文本的有效替代，穿透心脏的顶点在一侧，并通过肌肉的弯曲钳子的提示，并走出组织的另一侧。抓住10厘米长7-0丝的一端，拉近约两厘米的组织。缝合线后，用剩下的八厘米缝合线拉心脏。把缝合线端带到手术板上将弯曲钳尖钩在上升的主动脉和肺动脉躯干下。并拉一个三厘米长7-0丝回通过开口，创造一个单一的投掷松散的缝合线。用剪刀向心脏的顶点做一到两毫米的切口，穿透薄壁右心室。将底管引入右心室，轻轻地将导管推进到半透明、薄壁肺动脉干中。目视验证导管未进进左或右肺支点，且未与肺动脉分支点并起。将管子的外部部分固定到手术板上，轻轻拧紧两个大血管周围的松散缝合线。切开八厘米长的缝合线，使心脏恢复自然休息。夹住心脏的左预言家，让香水退出血管。然后，使用注射器泵，以0.5ml/min的流速注入硝基钠，既冲洗血液，并最大限度地扩张血管，直到香水运行清楚。要构建肺膨胀单元，请从浴缸中切割柔性塑料 24 量静脉导管，并连接到蝴蝶输液装置的针头上。将此装置连接到塞子，然后将塞子连接到打开的 50 毫升注射器上。在用甲醛装载注射器并吸附导管后，在闭塞球关闭的情况下，将注射器放在环位，以半月板高于气管 20 厘米的位置。放置两个松动的缝合线，两到四毫米分开，低于软骨，并使用剪刀在小切口韧带，优于缝合线。将导管插入开口，将尖端推进到两个松动的缝合线之外。拧紧气管周围的缝合线，并打开塞子，让牙素通过重力进入肺部。等待五分钟，让肺完全膨胀。如果肺在通货膨胀期间粘在肋骨笼上，使用钝尖钳抓住肋骨笼的外侧，并向各个方向移动肋骨，以帮助释放叶，而不会与肺部直接接触。五分钟后，在第一个缝合线和利门后面收回导管。然后收回第二个缝合线后面的导管和粘盖。肺现在应该以封闭、加压状态充气。要将血管，将聚合物稀释剂的 8-1-1 溶液的 1 毫升装入一毫升注射器中。小心插入柱塞。将注射器倒置时，按下柱塞以去除空气，并允许在注射器尖端形成半月板。从针头中心取出硝基丙胺注射器，将添加的 PBS 滴入中心，以创建半月板。将聚合物复合注射器加入中心，以每分钟 0.02 毫米的速度开始输液。监测化合物，因为它通过管子自由移动，注意到注射器体积，因为它进入肺动脉躯干。继续大量，直到所有叶完全填充，直到最小的容器。停止泵，并再次注意注射器体积。用光纤清洁擦拭覆盖肺部，并自由应用 PBS。让试样在室温下不受干扰地坐 30 到 40 分钟。一旦聚合物化合物固化和硬化，切断四肢和小鼠的下半部分。将头部和胸部放入一个50毫升圆锥体填充10%缓冲的甲醛，过夜。第二天早上，抓住气管，轻轻地将心脏和肺单元与剩余的肋骨笼和胸骨分离。将收获的组织块放在一个填充的正规的闪烁小瓶中。成功的施用将导致整个肺动脉网络的统一填充。如果肺部或肺气道受损，小泄漏会阻止肺部保持压力。由于空气通过导管进入血管系统，阻塞了化合物的下游流动，气闸可能会产生零碎或不完整的填充。当将太少的化合物引入血管时，即发生填充不足的情况。或者，过度灌装或引入太多的聚合物化合物过快，可能会导致动脉破裂，或者，更常见的是静脉过境。将导管推进到肺干箱下太远会导致尖端楔入一个肺动脉分支，造成流量不平衡，并导致一侧比另一侧填充速度更快。如所证明的，使用对端血管端点的适当直接监测，以及标准输液率可使肺血管的最佳填充。此外，使这种技术适应全身血管可以产生同样有利的结果，在其他血管床。铸造后，样品可进行微计算断层扫描处理。对于后处理，商业软件包可用于生成肺血管树的 3D 体积渲染。首次尝试此技术时，在脆弱的肺和肺动脉周围特别小心。最重要的是，避免将空气引入血管回路。成功施用后，可以通过微CT扫描样品，并探讨血管形态学和结构学的问题。

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