Name: vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00
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Cette recherche a été appuyée en partie par le Programme de recherche intra-muros de la LNHBI (DIR HL-006247). Nous tenons à remercier le NIH Mouse Imaging Facility pour ses conseils en matière d’acquisition et d’analyse d’images.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national des poumons et du sang cardiaques.
1. Préparation
<ol><li>Injectez la souris intraperitoneally avec de l’héparine (1 unité/g de poids corporel de la souris) et laissez-la s’ambriculer pendant 2 min.</li>
	<li>Euthanasier l’animal dans une chambre CO2.</li>
	<li>Disposer la souris en position supination sur une planc...

Exécutée correctement, cette méthode donne des images saisissantes des réseaux artériels pulmonaires, permettant la comparaison et l’expérimentation dans les modèles de rongeurs. Plusieurs étapes critiques en cours de route assurent le succès. Tout d’abord, les chercheurs doivent hépariniser l’animal dans l’étape préparatoire pour empêcher les caillots sanguins de se former dans la vascularisation pulmonaire et les chambres du cœur. Cela permet le transit artériel complet du composé polymère. Deu...

L’objectif de cette technique est la visualisation de l’architecture artérielle pulmonaire à l’aide d’un composé à base de polymère chez la souris. Tandis que des travaux étendus ont été exécutés sur les lits vasculaires systémiques tels que le cerveau, le coeur, et le rein1,2,3,4,,5, moins d’information est disponible concernant la préparation et le remplissage du réseau artériel pulmonaire. Le but de cette étude, par conséquent, est d’élargir les travaux précédents6,7,8 et de fournir une référence écrite et visuelle détaillée que les chercheurs peuvent facilement suivre pour produire des images à haute résolution de l’arbre artériel pulmonaire.
Bien qu’il existe de nombreuses méthodes d’étiquetage et d’imagerie de la vascularisation pulmonaire, telles que l’imagerie par résonance magnétique, l’échocardiographie ou l’angiographiect 9,,10,bon nombre de ces modalités ne remplissent pas adéquatement et/ou capturent les petits vaisseaux, limitant ainsi la portée de ce qui peut être étudié. Les méthodes telles que le sectionnage en série et la reconstruction fournissent une haute résolution, mais sont temps / travail intensif11,12,13. L’intégrité des tissus mous environnants est compromise dans le moulage traditionnel de corrosion10,13,14,15,16. Même l’âge et la taille de l’animal deviennent des facteurs lors de la tentative d’introduire un cathéter ou, la résolution fait défaut. La technique d’injection de polymère, d’autre part, remplit les artères au niveau capillaire et lorsqu’elle est combinée avec μCT, permet une résolution inégalée5. Des échantillons de poumons de souris aussi jeunes que le jour postnatal 14 ont été lancés avec succès8 et traités en quelques heures. Ceux-ci peuvent être rescanned indéfiniment, ou même envoyé pour la préparation histologique / microscopie électronique (EM) sans compromettre le tissu mou existant17. Les principales limites à cette méthode sont le coût initial de l’équipement/logiciel de CT, les défis avec la surveillance précise de la pression intravasculaire, et l’incapacité d’acquérir des données longitudinalement dans le même animal.
Cet article s’appuie sur les travaux existants pour optimiser davantage la technique d’injection d’artère pulmonaire et repousser les limites liées à l’âge/taille jusqu’au jour postnatal 1 (P1) pour produire des résultats frappants. Il est plus utile pour les équipes qui veulent étudier les réseaux vasculaires artériels. Par conséquent, nous fournissons de nouvelles directives pour le placement/stabilisation de cathéter, le contrôle accru sur le taux/volume de remplissage, et mettons en évidence les pièges notables pour le succès accru de coulée. Les moulages qui en résultent peuvent ensuite être utilisés pour la caractérisation future et l’analyse morphologique. Peut-être plus important encore, c’est la première démonstration visuelle, à notre connaissance, qui guide l’utilisateur à travers cette procédure complexe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:829px;" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">1cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309659</td>
			<td style="width:346px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">20ml Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>03-340-25P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">30G Needle</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:135px;">Cornin</td>
			<td style="width:117px;">352098</td>
			<td>For sample Storage and scanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">7-0 silk suture</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:117px;">103-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Analyze 12.0 Software</td>
			<td style="width:135px;">AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Primary Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Amira 6.7 Software</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CeramaCut Scissors 9cm</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ceramic Coated Curved Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11272-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">CO2 Tank</td>
			<td style="width:135px;">Robert&#39;s Oxygen Co.</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dual syringe pump</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-74900-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dumont Mini-Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11200-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Pharmco</td>
			<td style="width:117px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma - Life Sciences</td>
			<td style="width:117px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Gauze</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">441215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:231px;">Hemostat</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Heparin (1000USP Units/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Hospira</td>
			<td style="width:117px;">NDC 0409-2720-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Horos Software</td>
			<td style="width:135px;">Horos Project</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">induction chamber</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">06-666</td>
			<td>fiber optic cleaning wipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Labelling Tape</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">15966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Magnetic Base</td>
			<td style="width:135px;">Kanetec</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micro-CT system</td>
			<td style="width:135px;">SkyScan&#160;</td>
			<td style="width:117px;">1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microfil (Polymer Compound)</td>
			<td style="width:135px;">Flowech Inc.</td>
			<td style="width:117px;">Kit B - MV-122</td>
			<td>8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:135px;">Stoelting</td>
			<td style="width:117px;">56131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Monoject 1/2 ml Insulin Syringe</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">1188528012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Octagon Forceps Straight Teeth</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Parafilm</td>
			<td style="width:135px;">Bemis company, Inc.</td>
			<td style="width:117px;">#PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:135px;">Instech</td>
			<td style="width:117px;">BTPE-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Phospahte buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">BioRad</td>
			<td style="width:117px;">#161-0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ring Stand</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S13747</td>
			<td>Height 24in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:135px;">sigma</td>
			<td style="width:117px;">71778-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Steel Plate</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>16 x 16 in. area, 1/16 in thick</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:231px;">Straight Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:117px;">360103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Surgical Board</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>12-587-20</td>
			<td>This is a converted slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Universal 3-prong clamp</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S24280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged Inf. Set 25X3/4, 12&#34; Tubing</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:117px;">PR25G19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zeiss Stemi-508 Dissection Scope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging

Les vaisseaux sanguins forment des réseaux complexes dans l’espace tridimensionnel. Par conséquent, il est difficile d’apprécier visuellement comment les réseaux vasculaires interagissent et se comportent en observant la surface d’un tissu. Cette méthode fournit un moyen de visualiser l’architecture vasculaire tridimensionnelle complexe du poumon.
Pour ce faire, un cathéter est inséré dans l’artère pulmonaire et la vascularisation est simultanément rincée de sang et chimiquement dilatée pour limiter la résistance. Les poumons sont ensuite gonflés par la trachée à une pression standard et le composé polymère est infusé dans le lit vasculaire à un débit standard. Une fois que l’ensemble du réseau artériel est rempli et autorisé à guérir, la vascularisation pulmonaire peut être visualisée directement ou image sur un scanner micro-CT (μCT).
Lorsqu’on les effectue avec succès, on peut apprécier le réseau artériel pulmonaire chez des souris allant de l’âge postnatal précoce aux adultes. En outre, bien que démontré dans le lit artériel pulmonaire, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel lit vasculaire avec le placement optimisé de cathéter et les extrémités.

Un casting réussi présentera un remplissage uniforme de l’ensemble du réseau artériel pulmonaire. Nous le démontrons chez les souris C57Bl/6J dont l’âge est le cas : jour postnatal P90 (figure 4A),P30 (figure 4B), P7 (figure 4C)et P1 (figure 4D). En contrôlant le débit et en surveillant visuellement le remplissage en temps réel, des critères d’évaluation...

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Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Le but de cette technique est la visualisation ex vivo des réseaux artériels pulmonaires des souris postnatales et adultes précoces par l’inflation pulmonaire et l’injection d’un composé à base de polymère radio-opaque par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire. Les applications potentielles pour les tissus moulés sont également discutées.

Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Ce protocole donne des conseils précis, étape par étape pour moulage de la vascularisation artérielle pulmonaire chez les souris adultes et postnatales précoces. Cette technique permet aux utilisateurs de lancer entièrement l’ensemble du réseau vasculaire pour la visualisation par une variété de méthodes, y compris micro-CT, tout en maintenant l’intégrité des tissus mous. Cette technique est particulièrement utile pour examiner la morphologie pulmonaire-vasculaire et l’architecture, mais peut facilement être adaptée pour le ciblage d’autres lits vasculaires.Comme beaucoup de chirurgies et de dissections, il n’y a pas de substitut pour visualiser réellement une procédure, et les téléspectateurs peuvent bénéficier de voir certaines des manœuvres les plus difficiles en cours d’effectuer. Une fois que le processus xiphoïde est exposé, saisissez doucement et élevez la cage thoracique. Faites soigneusement une incision dans le diaphragme semi-transparent, maintenant exposé.Les poumons s’effondreront visiblement et s’éloigneront du diaphragme. Après avoir exposé le poumon et la trachée, enfilez 15 centimètres de tube PE10 sur le moyeu d’une aiguille de calibre 30. Et attachez cette unité à une seringue d’un millilitre, contenant 10 à la 4 molaire de nitroprusside de sodium, dans PBS.Avancez le piston pour amorcer le tube jusqu’à ce que tout l’air ait été purgé. Comme une alternative efficace au texte, pénétrer l’apex du cœur d’un côté, et passer le bout des forceps incurvés à travers le muscle, et de l’autre côté du tissu. Saisissez une extrémité d’une longueur de 10 centimètres de soie 7-0, et tirez environ deux centimètres à travers le tissu.Après avoir lété la suture, utiliser les huit centimètres restants de suture pour tirer le cœur caudally. Et scotchez la fin de la suture à la planche chirurgicale. Accrochez les extrémités des forceps incurvés sous l’aorte ascendante et le tronc d’artère pulmonaire.Et tirez une longueur de trois centimètres de soie 7-0 à travers l’ouverture pour créer une suture lâche d’un seul jet. Utilisez des ciseaux pour faire une incision d’un à deux millimètres vers l’apex du cœur, pénétrant le ventricule droit à paroi mince. Et introduire le tube amorcé dans le ventricule droit, avançant doucement le cathéter dans le tronc de l’artère pulmonaire semi-transparente et à paroi mince.Vérifiez visuellement que le cathéter n’a pas avancé dans les branches pulmonaires gauche ou droite, et n’a pas d’abord le point de branche de l’artère pulmonaire. Collez la partie distale du tube à la planche chirurgicale, et serrez doucement la suture lâche autour des deux grands navires. Couper le morceau de suture de huit centimètres pour remettre le cœur à une position de repos naturelle.Et couper l’oracle gauche du cœur pour permettre au perfusate de sortir de la vascularisation. Ensuite, utilisez une pompe à seringues, pour infuser le nitroprusside de sodium à un débit de 0,5 ml/min à la fois pour rincer le sang, et pour dilater au maximum la vascularisation, jusqu’à ce que le perfusate s’écoule clairement. Pour construire l’unité d’inflation pulmonaire, coupez le cathéter intraveineux flexible de calibre 24 d’une baignoire et connectez-vous à l’aiguille d’un ensemble d’infusion de papillons.Attachez cette unité au robinet d’arrêt et attachez le robinet d’arrêt à une seringue ouverte de 50 millilitres. Après avoir chargé la seringue de formaline et amorcé le cathéter, le robinet fermé, placez la seringue dans un support d’anneau, au point où le ménisque se trouve à 20 centimètres au-dessus de la trachée. Placez deux sutures lâches, de deux à quatre millimètres l’une de l’autre, inférieures au cartilage cricoïde, et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans le ligament cricothyroïde, supérieure aux sutures.Insérez le cathéter dans l’ouverture et avancez la pointe au-delà des deux sutures lâches. Serrez les sutures autour de la trachée et ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre à la formaline d’entrer dans les poumons par gravité. Attendez cinq minutes pour que les poumons se gonflent complètement.Si les poumons adhèrent à la cage thoracique pendant l’inflation, utilisez des forceps à pointe émoussée pour saisir l’extérieur de la cage thoracique et déplacez les côtes dans toutes les directions pour aider à libérer les lobes sans entrer en contact direct avec les poumons. Après cinq minutes, rétractez le cathéter derrière la première suture et ligate. Puis rétractez le cathéter derrière la deuxième suture et ligate.Les poumons doivent maintenant être gonflés dans un état fermé et sous pression. Pour jeter la vasculature, chargez un millilitre d’une solution 8-1-1 d’agent curateur diluant polymère dans une seringue d’un millilitre. Et insérez soigneusement le piston.Avec la seringue inversée, déprimez le piston pour enlever l’air, et pour permettre la formation d’un ménisque à l’extrémité de la seringue. Retirez la seringue nitroprusside de sodium du moyeu de l’aiguille et égoutter l’ajout de PBS dans le moyeu, pour créer un ménisque. Joignez la seringue composée de polymères au moyeu et commencez l’infusion à 0,02 millimètre par minute.Surveillez le composé pendant qu’il se déplace librement à travers le tube, notant le volume de seringue pendant qu’il entre dans le tronc pulmonaire d’artère. Continuez la profusion jusqu’à ce que tous les lobes soient complètement remplis, jusqu’au plus petit récipient. Arrêtez la pompe, et une fois de plus, notez le volume de seringue.Couvrez les poumons d’un lingette nettoyant à fibres optiques et appliquez généreusement le PBS. Laisser reposer l’échantillon intact de 30 à 40 minutes à température ambiante. Une fois que le composé polymère est guéri et durci, couper les membres et la moitié inférieure de la souris.Et placez la tête et le thorax dans un cône de 50 millilitres rempli de formaline tamponnée à 10%, pendant la nuit. Le lendemain matin, saisissez la trachée pour séparer doucement l’unité cardiaque et pulmonaire de la cage thoracique et du thorax restants. Placer le bloc de tissu récolté dans un flacon de scintillation rempli de formaline.Un casting réussi se traduira par un remplissage uniforme de l’ensemble du réseau artérielle pulmonaire. S’il y a des dommages aux voies respiratoires pulmonaires ou pulmonaires, de petites fuites empêcheront les poumons de tenir la pression. Le remplissage inégal ou incomplet peut résulter d’un sas à la suite de l’introduction d’air dans le système vasculaire par l’intermédiaire du cathéter, bloquant le flux en aval du composé.Le sous-remplissage se produit lorsque trop peu de composé est introduit dans la vascularisation. Alternativement, le remplissage excessif, ou l’introduction trop de composé de polymère trop rapidement, peut causer la rupture artérielle, ou, plus généralement, le transit veineux. L’avancement du cathéter trop bas dans le tronc pulmonaire peut causer la pointe de coincer dans une branche de l’artère pulmonaire, créant un déséquilibre dans le flux, et provoquant un côté à remplir plus vite que l’autre.La performance soigneuse de la technique comme démontré, utilisant la surveillance directe appropriée des points d’extrémité distal de vasculature, et les taux standard d’infusion peuvent avoir comme conséquence le remplissage optimal de la vascularisation pulmonaire. En outre, l’adaptation de cette technique à la vascularisation systémique peut donner des résultats tout aussi favorables dans d’autres lits vasculaires. Après coulée, les échantillons peuvent être traités pour la numérisation de la tomographie micro-calculée.Pour le post-traitement, un logiciel commercial peut être utilisé pour générer un rendu en volume 3D de l’arbre pulmonaire-vasculaire. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, soyez particulièrement prudent autour des poumons fragiles, et l’artère pulmonaire. Plus important encore, évitez d’introduire de l’air dans le circuit vasculaire.Après un casting réussi, un échantillon peut être scanné par micro-CT, et des questions impliquant la morphométrie vasculaire et l’architecture peuvent être explorées.

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