Name: vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale NHLBI (DIR HL-006247). Ringraziamo il NIH Mouse Imaging Facility per la guida nell'acquisizione e nell'analisi delle immagini.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) del National Heart Lung and Blood Institute.
1. Preparazione
<ol><li>Iniettare il topo intraperitonealmente con epatina (1 unità/g peso corporeo del topo) e lasciare che ambulate per 2 min.</li>
	<li>Eutanasia l'animale in una camera di CO2.</li>
	<li>Disporre il mouse in posizione supina su una tavola chirurgica e fissare tutti e quattro gli arti alla scheda con del nastro a...

Eseguito correttamente, questo metodo produce immagini sorprendenti di reti arteriose polmonari, consentendo il confronto e la sperimentazione nei modelli di roditori. Diversi passaggi critici lungo il percorso garantiscono il successo. In primo luogo, i ricercatori devono eparinizzare l'animale nella fase preparatoria per evitare che si forno coaguli di sangue nella vascolatura polmonare e nelle camere del cuore. Ciò consente il transito arteriosa completo del composto polimero. In secondo luogo, quando si perfora il d...

Il focus di questa tecnica è la visualizzazione dell'architettura arteriosa polmonare utilizzando un composto a base di polimeri nei topi. Mentre è stato eseguito un ampio lavoro su letti vascolari sistemici come cervello, cuore e rene1,2,3,4,5, sono disponibili meno informazioni per quanto riguarda la preparazione e il riempimento della rete arteriosa polmonare. Lo scopo di questo studio, quindi, è quello di ampliare il lavoroprecedente 6,7,8 e fornire un riferimento scritto e visivo dettagliato che i ricercatori possono facilmente seguire per produrre immagini ad alta risoluzione dell'albero arteriosa polmonare.
Mentre esistono numerosi metodi per l'etichettatura e l'imaging della vascolatura polmonare, come la risonanza magnetica, l'ecocardiografia o l'angiografiaTC 9,10, molte di queste modalità non riescono a riempire adeguatamente e/o catturare i piccoli vasi, limitando la portata di ciò che può essere studiato. Metodi come la sezionazione seriale e la ricostruzione forniscono alta risoluzione, ma sono tempo/lavoro ad altaintensità di tempo 11,12,13. L'integrità dei tessuti molli circostante è compromessa nella colata di corrosionetradizionale 10,,13,14,15,16. Anche l'età e le dimensioni degli animali diventano fattori quando si tenta di introdurre un catetere o, la risoluzione è carente. La tecnica di iniezione polimerica, d'altra parte, riempie le arterie al livello capillare e, se combinata con la CT, consente una risoluzione senza precedenti5. I campioni dei polmoni di topo giovani come il giorno postnatale 14 sono stati lanciaticon successo 8 ed elaborati in poche ore. Questi possono essere riscanci a tempo indeterminato, o addirittura inviati per preparazione irologica/ microscopia elettronica (EM) senza compromettere il tessuto molleesistente 17. Le principali limitazioni di questo metodo sono il costo iniziale delle apparecchiature/software CT, le sfide con il monitoraggio accurato della pressione intravascolare e l'incapacità di acquisire dati longitudinalmente nello stesso animale.
Questo documento si basa sul lavoro esistente per ottimizzare ulteriormente la tecnica di iniezione dell'arteria polmonare e spingere i confini relativi all'età/dimensione fino al giorno postnatale 1 (P1) per produrre risultati sorprendenti. È più utile per i team che vogliono studiare le reti vascolari arteriose. Di conseguenza, forniamo nuove linee guida per il posizionamento/stabilizzazione del catetere, un maggiore controllo sulla frequenza/volume di riempimento ed evidenziamo notevoli insidie per un maggiore successo di colata. I cast risultanti possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione futura e l'analisi morfologica. Forse ancora più importante, questa è la prima dimostrazione visiva, a nostra conoscenza, che guida l'utente attraverso questa procedura complessa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:829px;" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">1cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309659</td>
			<td style="width:346px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">20ml Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>03-340-25P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">30G Needle</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:135px;">Cornin</td>
			<td style="width:117px;">352098</td>
			<td>For sample Storage and scanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">7-0 silk suture</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:117px;">103-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Analyze 12.0 Software</td>
			<td style="width:135px;">AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Primary Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Amira 6.7 Software</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CeramaCut Scissors 9cm</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ceramic Coated Curved Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11272-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">CO2 Tank</td>
			<td style="width:135px;">Robert&#39;s Oxygen Co.</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dual syringe pump</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-74900-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dumont Mini-Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11200-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Pharmco</td>
			<td style="width:117px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma - Life Sciences</td>
			<td style="width:117px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Gauze</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">441215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:231px;">Hemostat</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Heparin (1000USP Units/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Hospira</td>
			<td style="width:117px;">NDC 0409-2720-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Horos Software</td>
			<td style="width:135px;">Horos Project</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">induction chamber</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">06-666</td>
			<td>fiber optic cleaning wipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Labelling Tape</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">15966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Magnetic Base</td>
			<td style="width:135px;">Kanetec</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micro-CT system</td>
			<td style="width:135px;">SkyScan&#160;</td>
			<td style="width:117px;">1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microfil (Polymer Compound)</td>
			<td style="width:135px;">Flowech Inc.</td>
			<td style="width:117px;">Kit B - MV-122</td>
			<td>8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:135px;">Stoelting</td>
			<td style="width:117px;">56131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Monoject 1/2 ml Insulin Syringe</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">1188528012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Octagon Forceps Straight Teeth</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Parafilm</td>
			<td style="width:135px;">Bemis company, Inc.</td>
			<td style="width:117px;">#PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:135px;">Instech</td>
			<td style="width:117px;">BTPE-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Phospahte buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">BioRad</td>
			<td style="width:117px;">#161-0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ring Stand</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S13747</td>
			<td>Height 24in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:135px;">sigma</td>
			<td style="width:117px;">71778-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Steel Plate</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>16 x 16 in. area, 1/16 in thick</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:231px;">Straight Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:117px;">360103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Surgical Board</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>12-587-20</td>
			<td>This is a converted slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Universal 3-prong clamp</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S24280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged Inf. Set 25X3/4, 12&#34; Tubing</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:117px;">PR25G19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zeiss Stemi-508 Dissection Scope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging

I vasi sanguigni formano reti intricate nello spazio tridimensionale. Di conseguenza, è difficile apprezzare visivamente il modo in cui le reti vascolari interagiscono e si comportano osservando la superficie di un tessuto. Questo metodo fornisce un mezzo per visualizzare la complessa architettura vascolare tridimensionale del polmone.
Per raggiungere questo obiettivo, un catetere viene inserito nell'arteria polmonare e la vascolatura viene simultaneamente lavata di sangue e dilatata chimica per limitare la resistenza. I polmoni vengono poi gonfiati attraverso la trachea a una pressione standard e il composto polimerico viene infuso nel letto vascolare ad una velocità di flusso standard. Una volta che l'intera rete arteriosa è stata riempita e autorizzata a curare, la vascolatura polmonare può essere visualizzata direttamente o su uno scanner micro-CT.
Quando eseguito con successo, si può apprezzare la rete arteriosa polmonare nei topi che vanno dalle prime età postnatali agli adulti. Inoltre, mentre dimostrato nel letto arteriosa polmonare, questo metodo può essere applicato a qualsiasi letto vascolare con posizionamento del catetere ottimizzato e punti finali.

Un cast di successo mostrerà un riempimento uniforme dell'intera rete arteriosa polmonare. Lo dimostriamo nei topi C57Bl/6J che variano in età: giorno postnatale P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) e P1 (Figura 4D). Controllando la velocità del flusso e monitorando visivamente il riempimento in tempo reale, sono stati raggiunti endpoint affidabili della v...

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Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Lo scopo di questa tecnica è la visualizzazione ex vivo delle reti arteriliiche polmonari dei primi topi postnatali e adulti attraverso l'inflazione polmonare e l'iniezione di un composto a base di polimeri radio-opaco attraverso l'arteria polmonare. Vengono inoltre discusse le potenziali applicazioni per i tessuti castati.

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Questo protocollo fornisce una guida precisa e passo dopo passo per la fusione della vascolarizzazione arteriosa polmonare sia nei topi postnatali adulti che in quello precoci. Questa tecnica consente agli utenti di lanciare completamente l'intera rete vascolare per la visualizzazione con una varietà di metodi, tra cui la micro-TC, mantenendo al contempo l'integrità dei tessuti molli. Questa tecnica è particolarmente utile per guardare alla morfologia e all'architettura vascolare polmonare, ma può essere facilmente adattata per il targeting di altri letti vascolari.Come molti interventi chirurgici e dissezioni, non c'è alternativa alla visualizzazione di una procedura e gli spettatori possono trarre vantaggio dal vedere alcune delle manovre più impegnative eseguite. Una volta esposto il processo xifoide, afferrare ed elevare delicatamente la gabbia toracica. Fai con cura un'incisione nel diaframma ora esposto e semitrasparente.I polmoni collasseranno visibilmente e si ritireranno dal diaframma. Dopo aver esposto il polmone e la trachea, infilare 15 centimetri di tubi PE10 sul mozzo di un ago calibro 30. E attaccare questa unità a una siringa da un millilitro, contenente 10 al 4 molare di nitroprusside di sodio, in PBS.Far avanzare lo stantuffo per innescare i tubi fino a quando tutta l'aria non è stata epurata. Come alternativa efficace al testo, penetrare l'apice del cuore da un lato e passare le punte delle forcelle curve attraverso il muscolo e fuori dall'altro lato del tessuto. Afferrare un'estremità di una lunghezza di 10 centimetri di seta 7-0 e tirare circa due centimetri attraverso il tessuto.Dopo aver legato la sutura, usa i restanti otto centimetri di sutura per tirare il cuore caudally. E registra l'estremità della sutura alla tavola chirurgica. Agganciare le punte delle forcep curve sia sotto l'aorta ascendente che con il tronco dell'arteria polmonare.E tirare indietro una lunghezza di tre centimetri di seta 7-0 attraverso l'apertura per creare una sutura sciolta a lancio singolo. Usa le forbici per fare un'incisione da uno a due millimetri verso l'apice del cuore, penetrando nel ventricolo destro dalle pareti sottili. E introdurre i tubi innescati nel ventricolo destro, facendo avanzare delicatamente il catetere nel tronco dell'arteria polmonare semitrasparente a parete sottile.Verificare visivamente che il catetere non sia avanzato nei rami polmonari sinistro o destro e non abut il punto del ramo dell'arteria polmonare. Fissare la porzione distale del tubo alla tavola chirurgica e stringere delicatamente la sutura sciolta attorno a entrambi i grandi vasi. Tagliare il pezzo di sutura di otto centimetri per riportare il cuore in una posizione di riposo naturale.E ritagliare l'oracolo sinistro del cuore per permettere al perfusato di uscire dalla vascucolatura. Quindi, utilizzare una pompa per siringhe, per infondere il nitroprusside di sodio a una portata di 0,5 ml / min sia per sciacquare il sangue, sia per dilatare al massimo la vascucolatura, fino a quando il perfusato non si libera. Per costruire l'unità di gonfiaggio polmonare, tagliare il catetere endovenoso flessibile calibro 24 da una vasca e collegarsi all'ago di un set di infusione di farfalle.Attaccare questa unità al ferma ferma ferma ferma ferma fermarsi a una siringa aperta da 50 millilitri. Dopo aver caricato la siringa con formalina e aver adescato il catetere, con il tappo chiuso, posizionare la siringa in un supporto ad anello, al punto in cui il menisco si trova a 20 centimetri sopra la trachea. Posizionare due suture sciolte, distanti da due a quattro millimetri l'una dall'altra, inferiori alla cartilagine cricoide, e usare le forbici per fare una piccola incisione nel legamento cricotiroideo, superiore alle suture.Inserire il catetere nell'apertura e avanzare la punta oltre le due suture sciolte. Stringere le suture intorno alla trachea e aprire il fermaglio per consentire alla formalina di entrare nei polmoni per gravità. Attendere cinque minuti prima che i polmoni si gonfino completamente.Se i polmoni aderiscono alla gabbia toracica durante l'inflazione, utilizzare le forcette a punta smussata per afferrare l'esterno della gabbia toracica e spostare le costole in tutte le direzioni per aiutare a liberare i lobi senza prendere contatto diretto con i polmoni. Dopo cinque minuti, ritrarre il catetere dietro la prima sutura e ligate. Quindi ritrarre il catetere dietro la seconda sutura e ligate.I polmoni dovrebbero ora essere gonfiati in uno stato chiuso e pressurizzato. Per gettare la vascucolatura, caricare un millilitro di una soluzione 8-1-1 di agente polimerico diluente polimerico in una siringa da un millilitro. E inserire con cura lo stantuffo.Con la siringa invertita, deprimere lo stantuffo per rimuovere l'aria e consentire la formazione di un menisco sulla punta della siringa. Rimuovere la siringa al nitroprusside di sodio dal mozzo dell'ago e gocciolare l'aggiunta di PBS nel mozzo, per creare un menisco. Unire la siringa polimero-composto al mozzo e iniziare l'infusione a 0,02 millimetri al minuto.Monitora il composto mentre si muove liberamente attraverso il tubo, notando il volume della siringa mentre entra nel tronco dell'arteria polmonare. Continuare la profusione fino a quando tutti i lobi sono completamente riempiti, fino al vaso più piccolo. Arrestare la pompa e, ancora una volta, notare il volume della siringa.Coprire i polmoni con una salvietta per la pulizia in fibra ottica e applicare liberamente PBS. Lasciare riposare indisturbato il campione per 30-40 minuti a temperatura ambiente. Una volta che il composto polimerico è guarito e indurito, edire gli arti e la metà inferiore del topo.E posizionare la testa e il torace in una formalina conica riempita al 10% tamponata da 50 millilitri, durante la notte. La mattina seguente, afferrare la trachea per separare delicatamente il cuore e l'unità polmonare dalla gabbia toracica e dal torace rimanenti. Posizionare il blocco di tessuto raccolto in una fiala a scintillazione riempita di formalina.Un cast di successo si tradurrà in un riempimento uniforme dell'intera rete arteriosa polmonare. Se ci sono danni alle vie respiratorie polmonari o polmonari, piccole perdite impediranno ai polmoni di tenere pressione. Il riempimento irregolare o incompleto può derivare da una camera d'aria a seguito dell'introduzione dell'aria nel sistema vascolare attraverso il catetere, bloccando il flusso a valle del composto.Il riempimento eccessivo si verifica quando nella vascucolatura viene introdotto troppo poco composto. In alternativa, il riempimento eccessivo, o l'introduzione troppo composto polimerico troppo rapidamente, può causare rotture arteriose o, più comunemente, transito venoso. Far avanzare il catetere troppo in basso nel tronco polmonare può causare il cuneo della punta in un ramo dell'arteria polmonare, creando uno squilibrio nel flusso e facendo sì che un lato si riempia più velocemente dell'altro.Un'attenta esecuzione della tecnica come dimostrato, utilizzando l'appropriato monitoraggio diretto dei punti finali della vascucolatura distale, e i tassi standard di infusione possono comportare un riempimento ottimale della vascucolatura polmonare. Inoltre, adattare questa tecnica alla vascolarizzazione sistemica può produrre risultati altrettanto favorevoli in altri letti vascolari. Dopo la fusione, i campioni possono essere elaborati per la scansione della tomografia micro-computerizzata.Per la post-elaborazione, un pacchetto software commerciale può essere utilizzato per generare un rendering in volume 3D dell'albero vascolare polmonare. Quando tenti questa tecnica per la prima volta, fai particolare attenzione ai polmoni fragili e all'arteria polmonare. Ancora più importante, evitare di introdurre aria nel circuito vascolare.Dopo un cast di successo, un campione può essere scansionato dalla micro-TC e possono essere esplorate domande che coinvolgono la morfometria vascolare e l'architettura.

Research

JoVE Journal

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Ricerca

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