Name: vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00
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この研究は、NHLBIイントラムラル研究プログラム(DIR HL-006247)によって部分的に支援されました。画像の取得と解析に関する指導を受け、NIHマウスイメージング施設に感謝申し上げます。

ここに記載されているすべての方法は、国立心臓肺血液研究所の施設動物のケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています。
1. 準備
<ol><li>ヘパリン(1単位/gマウス体重)で腹腔内にマウスを注入し、2分間アンブレートさせます。</li>
	<li>CO2チャンバーで動物を安2楽死させる。</li>
	<li>外科用基板の上の上の上の上の位置にマウスを配置し、テープでボードにす?...

適切に実行され、この方法は、げっ歯類モデルの比較と実験を可能にする肺動脈ネットワークの印象的な画像を生成します。いくつかの重要なステップは、成功を保証します。まず、研究者は、肺血管系および心臓のチャンバーに血栓が形成されるのを防ぐために、準備段階で動物をヘパリン化する必要があります。これはポリマー化合物の完全な動脈輸送を可能にする。第二に、横隔膜を?...

この技術の焦点は、マウスにおけるポリマー系化合物を用いた肺動脈アーキテクチャの可視化である。脳、心臓、腎臓,,11、2、3、4、5などの全身血管床に関する広範な作業が行われてきたが、肺動脈ネットワークの準備および充填に関する情報は少ない。,2,345したがって、この研究の目的は、前の研究66、7、87,8に拡大し、調査官が肺動脈樹の高解像度画像を生成するために簡単に従うことができる詳細な書面および視覚的な参照を提供することである。
磁気共鳴画像、心エコー検査、CT血管造影,9、10など、肺血管構造の標識やイメージングには数多くの方法がありますが、これらのモダ9リティの多くは小さな血管を十分に充填および/または捕獲できず、研究できる範囲を制限しています。シリアル断面化や再構築などの方法は、高解像度を提供しますが、時間/労働集約型の11、12、13です。,12,13従来の腐食鋳造,,10、13、14、15、16で、軟部組織の完全性を取り巻く妥協がある。10,13,141516動物の年齢や大きさでさえ、カテーテルを導入しようとするときに、または、解像度が欠けている要因になります。一方、ポリマー注入技術は、動脈を毛細管レベルまで満たし、μCTと組み合わせると、比類ない分解能5を可能にする。出生後14日目の若いマウス肺からのサンプルは、8に正常にキャストされ、数時間で処理されました。これらは、無期限に再スキャンすることも、既存の軟組織17を損なうことなく組織学的準備/電子顕微鏡(EM)のために送ることさえできる。この方法の主な制限は、CT機器/ソフトウェアの先行コスト、血管内圧を正確に監視する課題、および同じ動物の中で縦方向にデータを取得できないことです。
この論文は、肺動脈注射技術をさらに最適化し、年齢/サイズ関連の境界を出生後1日目(P1)に押し下げて顕著な結果を生み出す既存の作業に基づいています。動脈血管ネットワークを研究したいチームにとって最も有用です。したがって、カテーテルの配置/安定化、フィルレート/ボリュームの制御の強化、鋳造成功の増加に対する注目すべき落とし穴のハイライトに関する新しいガイダンスを提供します。その結果、結果のキャストを将来の特性評価と形態解析に使用できます。おそらくもっと重要なのは、これは私たちの知る限りでは、この複雑な手順をユーザーに説明する最初の視覚的なデモンストレーションです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:829px;" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">1cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309659</td>
			<td style="width:346px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">20ml Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>03-340-25P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">30G Needle</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:135px;">Cornin</td>
			<td style="width:117px;">352098</td>
			<td>For sample Storage and scanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">7-0 silk suture</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:117px;">103-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Analyze 12.0 Software</td>
			<td style="width:135px;">AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Primary Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Amira 6.7 Software</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CeramaCut Scissors 9cm</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ceramic Coated Curved Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11272-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">CO2 Tank</td>
			<td style="width:135px;">Robert&#39;s Oxygen Co.</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dual syringe pump</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-74900-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dumont Mini-Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11200-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Pharmco</td>
			<td style="width:117px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma - Life Sciences</td>
			<td style="width:117px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Gauze</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">441215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:231px;">Hemostat</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Heparin (1000USP Units/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Hospira</td>
			<td style="width:117px;">NDC 0409-2720-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Horos Software</td>
			<td style="width:135px;">Horos Project</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">induction chamber</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">06-666</td>
			<td>fiber optic cleaning wipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Labelling Tape</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">15966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Magnetic Base</td>
			<td style="width:135px;">Kanetec</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micro-CT system</td>
			<td style="width:135px;">SkyScan&#160;</td>
			<td style="width:117px;">1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microfil (Polymer Compound)</td>
			<td style="width:135px;">Flowech Inc.</td>
			<td style="width:117px;">Kit B - MV-122</td>
			<td>8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:135px;">Stoelting</td>
			<td style="width:117px;">56131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Monoject 1/2 ml Insulin Syringe</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">1188528012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Octagon Forceps Straight Teeth</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Parafilm</td>
			<td style="width:135px;">Bemis company, Inc.</td>
			<td style="width:117px;">#PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:135px;">Instech</td>
			<td style="width:117px;">BTPE-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Phospahte buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">BioRad</td>
			<td style="width:117px;">#161-0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ring Stand</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S13747</td>
			<td>Height 24in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:135px;">sigma</td>
			<td style="width:117px;">71778-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Steel Plate</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>16 x 16 in. area, 1/16 in thick</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:231px;">Straight Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:117px;">360103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Surgical Board</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>12-587-20</td>
			<td>This is a converted slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Universal 3-prong clamp</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S24280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged Inf. Set 25X3/4, 12&#34; Tubing</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:117px;">PR25G19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zeiss Stemi-508 Dissection Scope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging

血管は、3次元空間で複雑なネットワークを形成します。その結果、血管ネットワークが組織の表面を観察することによってどのように相互作用し、動作するかを視覚的に理解することは困難である。この方法は、肺の複雑な3次元血管アーキテクチャを可視化する手段を提供する。
これを達成するために、カテーテルが肺動脈に挿入され、脈管構造が同時に血液を洗い流され、化学的に拡張されて抵抗を制限する。肺は、標準的な圧力で気管を通して膨張し、ポリマー化合物は、標準的な流量で血管床に注入されます。動脈ネットワーク全体が満たされて治癒することが許されると、肺血管構造を直接可視化するか、マイクロCT(μCT)スキャナで画像化することができます。
正常に行われると、出生後の早期から成人までのマウスの肺動脈ネットワークを理解することができる。さらに、肺動脈床で実証されている間、この方法は、最適化されたカテーテルの配置およびエンドポイントを有する任意の血管床に適用することができる。

成功したキャストは、肺動脈ネットワーク全体の均一な充填を示します。これは、C57Bl/6Jマウスの年齢に及ぶ:出生後の日P90(図4A)、P30(図4B)、P7(図4C)、およびP1(図4D)でこれを実証する。Figure 4C流量を制御し、リアルタイムで充填を監視することで、最も遠位血管系の信頼性の高い?...

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Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex vivo視覚化である。キャストされた組織の潜在的な用途についても議論される。

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

このプロトコルは、成人マウスおよび出生後早期マウスの両方で肺動脈血管系をキャスティングするための正確なステップバイステップのガイダンスを提供します。この技術により、ユーザーは柔らかい組織の完全性を維持しながら、マイクロCTを含む様々な方法で視覚化のために血管ネットワーク全体を完全にキャストすることができます。この技術は、肺血管形態および建築を見る場合に特に有用であるが、他の血管床の標的化のために容易に適合させることができる。多くの手術や分節と同様に、実際に手順を視覚化することに代わるものはなく、視聴者はより困難な操縦の一部が実行されているのを見て恩恵を受けるかもしれません。xiphoidプロセスが露出したら、リブケージをそっとつかんで高めます。現在露出している半透明の横隔膜を慎重に切開します。肺は目に見えて崩壊し、横隔膜から引き離されます。肺と気管を露出させた後、30ゲージの針のハブにPE10チューブの糸15センチメートル。そして、PBSでニトロトルシドナトリウムの4モルに10を含む1ミリリットルの注射器にこのユニットを取り付けます。すべての空気がパージされるまで、チューブをプライミングするためにプランジャーを進めます。テキストの効果的な代替として、一方の側の心臓の頂点を貫通し、筋肉を通して湾曲した鉗子の先端を渡し、組織の反対側を出す。長さ7~0シルクの10センチメートルの片端をつかみ、組織を通して約2センチ引っ張ります。縫合糸を引き離した後、縫合糸の残りの8センチメートルを使用して心臓を大胆に引っ張ります。そして、縫合糸の端を外科用ボードにテープで貼ります。上昇大動脈と肺動脈幹の両方の下に湾曲した鉗子の先端を引っ掛けます。そして、開口部を通して7-0シルクの3センチメートルの長さを引き戻し、単一投げ緩い縫合糸を作成します。はさみを使用して心臓の頂点に向かって1〜2ミリメートルの切開を行い、薄壁の右心室を貫通します。そして、右心室にプライミングチューブを導入し、カテーテルを半透明の薄壁の肺動脈幹に静かに進めます。カテーテルが左または右の肺枝に進んでいないこと、および肺動脈枝点に隣接していないことを視覚的に確認する。チューブの遠位部分を外科用ボードにテープで貼り付け、両大血管の周りの緩い縫合をそっと締めます。8センチメートルの縫合糸を切り、心臓を自然な休息位置に戻します。そして、心臓の左のオラクルをクリップして、パーフューズが脈管系を出るようにします。次に、注射器ポンプを使用して、0.5ml/分流量でニトロクロスシドナトリウムを血液を洗い流し、血管構造を最大限に拡張し、パーフューズが透明になるまで希釈する。肺膨張ユニットを構築するには、柔軟なプラスチック24ゲージの静脈内カテーテルを浴槽から切断し、蝶の注入セットの針に接続します。このユニットをストップコックに取り付け、栓コックを50ミリリットルのシリンジに取り付けます。ホルマリンで注射器をロードし、カテーテルをプライミングした後、ストップコックを閉じた状態で、メニスカスが気管の上に20センチメートルあるポイントまで、シリンジをリングスタンドに置きます。2~4ミリメートル離れた2本の緩い縫合糸を、cricoid軟骨より劣り、縫合糸よりも優れた、コリコ甲状腺靭帯の小さな切開を行うためにはさみを使用する。開口部にカテーテルを挿入し、2つの緩い縫合糸を超えて先端を進めます。気管の周りの縫合線を締め、ホルマリンが重力によって肺に入ることができるようにストップコックを開きます。肺が完全に膨張するまで5分待ちます。インフレーション中に肺がリブケージに付着する場合は、鈍い先端の鉗子を使用してリブケージの外側をつかみ、肋骨を四方八方に動かして、肺に直接接触することなくローブを解放するのを助ける。5分後、最初の縫合糸とリゲートの後ろのカテーテルを引き込みます。その後、第2縫合糸とリゲートの後ろのカテーテルを引き込む。肺は閉鎖された加圧状態で膨張する必要があります。血管系をキャストするには、8-1-1溶液のポリマー希釈剤を1ミリリットルのシリンジにロードします。そして慎重にプランジャーを挿入します。シリンジを反転させた後、プランジャーを押して空気を取り除き、注射器の先端に半月板を形成できるようにします。針のハブからニトロトルシド注射器を取り出し、PBSをハブに滴下して半月板を作成します。高分子化合物シリンジをハブに結合し、1分間に0.02ミリメートルで注入を開始します。それは肺動脈幹に入る注射器の体積を示して、チューブを通って自由に移動する化合物を監視します。すべてのローブが完全に満杯になるまで、最小の容器まで拡散を続けます。ポンプを停止し、もう一度、シリンジのボリュームに注意してください。光ファイバークリーニングワイプで肺を覆い、PBSを自由に適用します。試料を室温で30〜40分間邪魔されずに座るようにします。高分子化合物が硬化して硬化したら、手足とマウスの下半分を切断する。そして、頭と胸郭を50ミリリットル円錐状に入れ、10%緩衝ホルマリンを一晩置きます。翌朝、気管をつかんで心臓と肺のユニットを残りの肋骨ケージと胸部から穏やかに分離します。収穫した組織ブロックをホルマリンで満たされたシンチレーションバイアルに入れる。成功したキャストは、肺動脈ネットワーク全体の均一な充填をもたらす。肺や肺気道に損傷がある場合、小さな漏れは肺が圧力を保持するのを妨げる。パッチ状または不完全な充填は、カテーテルを介して空気が血管系に導入され、化合物の下流流を遮断した結果としてエアロックから生じる可能性がある。過充填は、あまりにも少ない化合物が血管系に導入されたときに発生します。あるいは、過剰充填、またはあまりにも多くの高分子化合物をあまりにも速く導入すると、動脈破裂、または、より一般的には静脈通過を引き起こす可能性がある。肺幹を下りすぎると、先端が肺動脈枝にくさびを起こし、流れの不均衡が生じ、一方の側が他方よりも速く満杯になる可能性があります。示されているように、遠位血管系の終点の適切な直接モニタリングを使用して、示された技術の慎重な性能、および標準的な注入率は、肺血管系の最適な充填をもたらすことができます。さらに、この技術を全身血管系に適応させることは、他の血管床でも同様に有利な結果をもたらす可能性がある。鋳造後、マイクロコンピュータ断層撮影スキャン用にサンプルを処理することができます。後処理では、市販のソフトウェアパッケージを使用して、肺血管樹の3Dボリュームレンダリングを生成することができます。この技術を初めて試すときは、脆弱な肺、および肺動脈の周りに特に注意してください。最も重要なことは、血管回路に空気を導入しないようにします。成功したキャストに続いて、サンプルはマイクロCTによってスキャンすることができ、血管穿刺および建築に関する質問を探求することができる。

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