Name: vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramuros da NHLBI (DIR HL-006247). Gostaríamos de agradecer ao NIH Mouse Imaging Facility por orientação em aquisição e análise de imagens.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Pulmão e Sangue do Coração.
1. Preparação
<ol><li>Injete o mouse intraperitonealmente com heparina (1 unidade/g de peso corporal do rato) e deixe-o ambulatório por 2 minutos.</li>
	<li>Eutanize o animal em uma câmara de CO2.</li>
	<li>Disponha o mouse em uma posição supina em uma placa cirúrgica e fixe todos os quatro membros na placa c...

Executado corretamente, este método produz imagens marcantes de redes arteriais pulmonares, permitindo comparação e experimentação em modelos de roedores. Vários passos críticos ao longo do caminho garantem o sucesso. Primeiro, os investigadores devem heparinizar o animal na fase preparatória para evitar que coágulos sanguíneos se formem na vasculatura pulmonar e câmaras do coração. Isso permite o trânsito arterial completo do composto polímero. Em segundo lugar, ao perfurar o diafragma e remover a caixa t...

O foco desta técnica é a visualização da arquitetura arterial pulmonar usando um composto à base de polímero em camundongos. Embora tenha sido realizado um trabalho extensivo em leitos vasculares sistêmicos como cérebro, coração e rim1,2,,3,4,5, há menos informações sobre a preparação e o preenchimento da rede arterial pulmonar. O objetivo deste estudo, portanto, é expandir o trabalho anterior6,,7,8 e fornecer uma referência escrita e visual detalhada que os pesquisadores podem facilmente seguir para produzir imagens de alta resolução da árvore arterial pulmonar.
Enquanto existem inúmeros métodos para rotulagem e vasculatura pulmonar de imagem, como ressonância magnética, ecocardiografia ou angiografia ct9,10, muitas dessas modalidades não conseguem preencher adequadamente e/ou capturar os pequenos vasos, limitando o escopo do que pode ser estudado. Métodos como secção serial e reconstrução fornecem alta resolução, mas são tempo/trabalho intensivo11,,12,13. A integridade do tecido mole circundante está comprometida na fundição tradicional de corrosão10,13,14,15,16. Mesmo a idade e o tamanho dos animais tornam-se fatores ao tentar introduzir um cateter ou, falta resolução. A técnica de injeção de polímero, por outro lado, preenche as artérias ao nível capilar e, quando combinada com μCT, permite uma resolução incomparável5. Amostras de pulmões de camundongos tão jovens quanto o pós-natal 14 foram lançadas com sucesso8 e processadas em questão de horas. Estes podem ser rescandados indefinidamente, ou mesmo enviados para preparação histológica/microscopia eletrônica (EM) sem comprometer o tecido mole existente17. As principais limitações para este método são o custo inicial do equipamento/software ct, desafios com o monitoramento preciso da pressão intravascular e a incapacidade de adquirir dados longitudinalmente no mesmo animal.
Este artigo baseia-se no trabalho existente para otimizar ainda mais a técnica de injeção da artéria pulmonar e empurrar os limites relacionados à idade/tamanho até o pós-natal 1 (P1) para produzir resultados impressionantes. É mais útil para equipes que desejam estudar redes vasculares arteriais. Assim, fornecemos novas orientações para a colocação/estabilização do cateter, maior controle sobre taxa/volume de preenchimento e destacamos armadilhas notáveis para o aumento do sucesso de fundição. Elencos resultantes podem então ser usados para caracterização futura e análise morfológica. Talvez mais importante, esta é a primeira demonstração visual, pelo nosso conhecimento, que orienta o usuário através deste procedimento intrincado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:829px;" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">1cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309659</td>
			<td style="width:346px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">20ml Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>03-340-25P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">30G Needle</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:135px;">Cornin</td>
			<td style="width:117px;">352098</td>
			<td>For sample Storage and scanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">60cc syringe</td>
			<td style="width:135px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:117px;">309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">7-0 silk suture</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:117px;">103-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Analyze 12.0 Software</td>
			<td style="width:135px;">AnalyzeDirect Inc.</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Primary Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Amira 6.7 Software</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CeramaCut Scissors 9cm</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ceramic Coated Curved Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11272-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">CO2 Tank</td>
			<td style="width:135px;">Robert&#39;s Oxygen Co.</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dual syringe pump</td>
			<td style="width:135px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-74900-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Dumont Mini-Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11200-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Pharmco</td>
			<td style="width:117px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma - Life Sciences</td>
			<td style="width:117px;">HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Gauze</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">441215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:231px;">Hemostat</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Heparin (1000USP Units/ml)</td>
			<td style="width:135px;">Hospira</td>
			<td style="width:117px;">NDC 0409-2720-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Horos Software</td>
			<td style="width:135px;">Horos Project</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>Alternative Sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">induction chamber</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">06-666</td>
			<td>fiber optic cleaning wipe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Labelling Tape</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">15966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Magnetic Base</td>
			<td style="width:135px;">Kanetec</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micro-CT system</td>
			<td style="width:135px;">SkyScan&#160;</td>
			<td style="width:117px;">1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microfil (Polymer Compound)</td>
			<td style="width:135px;">Flowech Inc.</td>
			<td style="width:117px;">Kit B - MV-122</td>
			<td>8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:135px;">Stoelting</td>
			<td style="width:117px;">56131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Monoject 1/2 ml Insulin Syringe</td>
			<td style="width:135px;">Covidien</td>
			<td style="width:117px;">1188528012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Octagon Forceps Straight Teeth</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Parafilm</td>
			<td style="width:135px;">Bemis company, Inc.</td>
			<td style="width:117px;">#PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:135px;">Instech</td>
			<td style="width:117px;">BTPE-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Phospahte buffered Saline</td>
			<td style="width:135px;">BioRad</td>
			<td style="width:117px;">#161-0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ring Stand</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S13747</td>
			<td>Height 24in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:135px;">sigma</td>
			<td style="width:117px;">71778-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Steel Plate</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:117px;">N/A</td>
			<td>16 x 16 in. area, 1/16 in thick</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:231px;">Straight Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:117px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter</td>
			<td style="width:135px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:117px;">360103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Surgical Board</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td>12-587-20</td>
			<td>This is a converted slide holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Universal 3-prong clamp</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:117px;">S24280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Winged Inf. Set 25X3/4, 12&#34; Tubing</td>
			<td style="width:135px;">Nipro</td>
			<td style="width:117px;">PR25G19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zeiss Stemi-508 Dissection Scope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:117px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vascular casting of adult and early postnatal mouse lungs for micro-ct imaging

Vasos sanguíneos formam redes intrincadas no espaço tridimensional. Consequentemente, é difícil apreciar visualmente como as redes vasculares interagem e se comportam observando a superfície de um tecido. Este método fornece um meio de visualizar a complexa arquitetura vascular tridimensional do pulmão.
Para isso, um cateter é inserido na artéria pulmonar e a vasculatura é simultaneamente lavada de sangue e quimicamente dilatada para limitar a resistência. Os pulmões são então inflados através da traqueia a uma pressão padrão e o composto de polímero é infundido no leito vascular a uma taxa de fluxo padrão. Uma vez que toda a rede arterial é preenchida e permitida a cura, a vasculatura pulmonar pode ser visualizada diretamente ou visualizada em um scanner micro-CT (μCT).
Quando realizado com sucesso, pode-se apreciar a rede arterial pulmonar em camundongos que variam de idades pós-natal precoces a adultos. Além disso, enquanto demonstrado no leito arterial pulmonar, este método pode ser aplicado em qualquer leito vascular com colocação otimizada de cateter e pontos finais.

Um elenco bem sucedido exibirá o preenchimento uniforme de toda a rede arterial pulmonar. Demonstramos isso em camundongos C57Bl/6J variando em idade: Dia pós-natal P90 (Figura 4A),P30(Figura 4B),P7(Figura 4C)e P1(Figura 4D). Controlando a taxa de fluxo e monitorando visualmente o preenchimento em tempo real, foram alcançados pontos finais confiáveis da vasculatura m...

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Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

O objetivo desta técnica é a visualização ex vivo de redes arteriais pulmonares de camundongos pós-natais e adultos precoces através da inflação pulmonar e injeção de um composto radio-opaco à base de polímero através da artéria pulmonar. Também são discutidas possíveis aplicações para tecidos fundidos.

Fundição Vascular de Pulmões de Camundongos Adultos e Precoces para Imagem Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Este protocolo fornece orientação precisa passo a passo para lançar a vasculatura arterial pulmonar em camundongos adultos e pós-natais precoces. Esta técnica permite que os usuários lancem integralmente toda a rede vascular para visualização por uma variedade de métodos, incluindo microCC, mantendo a integridade dos tecidos moles. Esta técnica é particularmente útil para olhar para morfologia pulmonar-vascular e arquitetura, mas pode ser facilmente adaptada para o alvo de outros leitos vasculares.Como muitas cirurgias e dissecções, não há substituto para realmente visualizar um procedimento, e os espectadores podem se beneficiar de ver algumas das manobras mais desafiadoras que estão sendo realizadas. Uma vez que o processo xifoide é exposto, segure suavemente e eleve a caixa torácica. Faça cuidadosamente uma incisão no diafragma semi-transparente e agora exposto.Os pulmões entrarão em colapso visivelmente, e se afastarão do diafragma. Depois de expor o pulmão e a traqueia, rosca de 15 centímetros de tubo PE10 sobre o cubo de uma agulha de calibre 30. E anexar esta unidade a uma seringa de um mililitro, contendo 10 ao molar 4 de nitroprusside de sódio, em PBS.Avance o êmbolo para preparar a tubulação até que todo o ar tenha sido purgado. Como uma alternativa eficaz ao texto, penetrar o ápice do coração de um lado, e passar as pontas de fórceps curvas através do músculo, e para fora do outro lado do tecido. Segure uma extremidade de um comprimento de 10 centímetros de seda 7-0, e puxe aproximadamente dois centímetros através do tecido.Depois de amarrar a sutura, use os oito centímetros restantes de sutura para puxar o coração caudalmente. E grave a ponta da sutura no quadro cirúrgico. Enganche as pontas dos fórceps curvos sob a aorta ascendente e o tronco da artéria pulmonar.E puxe um comprimento de três centímetros de seda de 7-0 de volta através da abertura para criar uma sutura de lançamento único. Use uma tesoura para fazer uma incisão de um a dois milímetros em direção ao ápice do coração, penetrando no ventrículo direito de parede fina. E introduza a tubulação preparada no ventrículo direito, avançando suavemente o cateter no tronco semi-transparente e de parede fina da artéria pulmonar.Verifique visualmente se o cateter não avançou nos ramos pulmonar esquerdo ou direito, e não apontou o ponto do ramo da artéria pulmonar. Tape a porção distal da tubulação na placa cirúrgica, e aperte suavemente a sutura solta em torno de ambos os grandes vasos. Corte a peça de oito centímetros de sutura para devolver o coração a uma posição de repouso natural.E corte o oráculo esquerdo do coração para permitir que o perfusado saia da vasculatura. Em seguida, use uma bomba de seringa, para infundir o nitroprusside de sódio a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min para lavar o sangue, e dilatar a vasculatura, até que o perfusato se esclaie. Para construir a unidade de inflação pulmonar, corte o cateter intravenoso de plástico flexível de 24 bitolas de uma banheira e conecte-se à agulha de um conjunto de infusão de borboletas.Conecte esta unidade à torneira e conecte a torneira a uma seringa aberta de 50 mililitros. Depois de carregar a seringa com formalina e escorrizar o cateter, com a torneira fechada, posicione a seringa em um suporte de anel, ao ponto em que o menisco está 20 centímetros acima da traqueia. Coloque duas suturas soltas, de dois a quatro milímetros de distância, inferiores à cartilagem cricoide, e use uma tesoura para fazer uma pequena incisão no ligamento cricothiroide, superior às suturas.Insira o cateter na abertura e avance a ponta além das duas suturas soltas. Aperte as suturas ao redor da traqueia, e abra a torneira para permitir que a formalina entre nos pulmões pela gravidade. Espere cinco minutos para os pulmões inflarem completamente.Se os pulmões aderirem à caixa torácica durante a inflação, use fórceps de ponta bruta para agarrar o lado de fora da caixa torácica, e mova as costelas em todas as direções para ajudar a liberar os lóbulos sem fazer contato direto com os pulmões. Após cinco minutos, retraia o cateter atrás da primeira sutura e ligadura. Em seguida, retraia o cateter atrás da segunda sutura e ligadura.Os pulmões devem agora ser inflados em um estado fechado e pressurizado. Para lançar a vasculatura, carregue um mililitro de uma solução 8-1-1 de agente de cura diluente de polímero em uma seringa de um mililitro. E insira cuidadosamente o êmbolo.Com a seringa invertida, pressione o êmbolo para remover o ar, e para permitir a formação de um menisco na ponta da seringa. Remova a seringa nitroprusside de sódio do cubo da agulha, e gotejar pbs adição no cubo, para criar um menisco. Junte-se à seringa composta por polímero ao cubo e inicie a infusão a 0,02 milímetros por minuto.Monitore o composto enquanto ele se move livremente através da tubulação, observando o volume da seringa ao entrar no tronco da artéria pulmonar. Continue a profusão até que todos os lóbulos estejam completamente cheios, até o menor navio. Pare a bomba e, mais uma vez, observe o volume da seringa.Cubra os pulmões com um lenço de limpeza de fibra óptica e aplique liberalmente PBS. Deixe o espécime ficar imperturbável por 30 a 40 minutos em temperatura ambiente. Uma vez que o composto de polímero esteja curado e endurecido, corte os membros e a metade inferior do mouse.E coloque a cabeça e o tórax em uma formalina conônica de 50 mililitros, durante a noite. Na manhã seguinte, segure a traqueia para separar suavemente o coração e a unidade pulmonar da caixa torácica e tórax restantes. Coloque o bloco de tecido colhido em um frasco de cintilação cheio de formalina.Um elenco bem sucedido resultará em um preenchimento uniforme de toda a rede arterial pulmonar. Se houver danos nas vias aéreas pulmonares ou pulmonares, pequenos vazamentos impedirão que os pulmões ressuquem a pressão. O enchimento irregular ou incompleto pode surgir de uma câmara de ar como resultado do ar ser introduzido no sistema vascular através do cateter, bloqueando o fluxo a jusante do composto.O enchimento ocorre quando um composto muito pequeno é introduzido na vasculatura. Alternativamente, o excesso de enchimento, ou a introdução de muito composto de polímero muito rapidamente, pode causar ruptura arterial, ou, mais comumente, trânsito venoso. Avançar o cateter muito longe do tronco pulmonar pode fazer com que a ponta se enraizar em um ramo da artéria pulmonar, criando um desequilíbrio no fluxo, e fazendo com que um lado encha mais rápido que o outro.O desempenho cuidadoso da técnica como demonstrado, utilizando o monitoramento direto adequado dos pontos finais de vasculatura distal, e as taxas de infusão padrão podem resultar em preenchimento ideal da vasculatura pulmonar. Além disso, adaptar essa técnica à vasculatura sistêmica pode produzir resultados igualmente favoráveis em outros leitos vasculares. Após a fundição, as amostras podem ser processadas para digitalização de tomografias microcomputadas.Para pós-processamento, um pacote de software comercial pode ser usado para gerar uma renderização de volume 3D da árvore pulmonar-vascular. Ao tentar esta técnica pela primeira vez, tenha especialmente cuidado ao redor dos pulmões frágeis e da artéria pulmonar. O mais importante é evitar introduzir ar no circuito vascular.Seguindo um elenco bem sucedido, uma amostra pode ser escaneada por micro-CT, e questões envolvendo morfometria vascular e arquitetura podem ser exploradas.

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