Name: protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00
Duration: 7 min 22 s
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Este trabajo fue apoyado en parte por Kansas INBRE, P20GM103418 a Li y Zinovyeva y R35GM124828 a Zinovyeva. Agradecemos a Min Han por compartir generosamente el anticuerpo anti-AIN-1. Algunas de las cepas utilizadas en el transcurso de este trabajo fueron proporcionadas por el Centro de Genética caenorhabditis (CGC), financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

1. Colección de muestras de gusanos
<ol><li>Sembrar etapa mixta osincronizar 13 gusanos en placas sólidas NGM a la temperatura requerida y permitir que los gusanos crezcan hasta la etapa deseada. Para el crecimiento y mantenimiento básicos de C. elegans, véase Stiernagle et al. y Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Recoge gusanos en un tubo centrífuga cónico de 15 ml lavando las placas de gusano con amortiguador M9.</li>
	<li>Peletizar los gusanos centrifugando a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 2 min y desechar el sobrenadante. NOTA: El tamaño del pellet de gusano para la preparación de extractos es de entre 100 μL y 500 μL. Un pellet de 300 μL de gusanos envasados se recomienda para experimentos de inmunoprecipitación aguas abajo y normalmente produce ~4.5 mg de proteína total, mientras que un pellet de 500 μL producirá ~7.5 mg de proteína total.</li>
	<li>Realice 3-5 lavados adicionales con buffer M9 (ver Tabla 1)o hasta que el sobrenadante ya no esté nublado.</li>
	<li>Realice un lavado final con ddH2O.</li>
	<li>Mueva el pellet de gusano suelto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y gire hacia abajo a 400 x g a RT durante 2 minutos. Deseche el sobrenadante restante para obtener un pellet de gusano embalado y proceda a extraer la preparación. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los pellets de gusano pueden congelarse repentinamente en nitrógeno líquido inmediatamente y almacenarse a -80 °C o en nitrógeno líquido. Tenga en cuenta que los pellets de gusano sólo se pueden descongelar una vez y no se pueden volver a congelar.</li>
</ol>2. Extraer la preparación del pellet de gusano
NOTA: La preparación del extracto debe realizarse en hielo o a 4 °C.
<ol><li>Si está congelado, descongele el pellet de gusano en hielo. NOTA: Si no se obtuvo el tamaño deseado de pellets de gusano envasado de 300 μL durante la recolección de muestras, se pueden combinar varios pellets más pequeños hasta que haya suficiente material para su posterior extracción.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de amortiguador de lisis helada de 2x frío (HEPES de 60 mM, pH = cloruro de magnesio de 7,4, 100 mM cloruro de potasio, 0,1% Tritón X, cloruro de magnesio de 4 mM, 10% de glicerol, TDT de 2 mM con inhibidor de la RNase, inhibidor de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa; ver Tabla 1) y vórtice o pipeta arriba y abajo para mezclar. Gire los tubos hacia abajo para recoger la mezcla en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Mueva la mezcla a un tubo libre de RNase de 1,5 ml que contenga cuentas metálicas (ver Tabla de materiales)y coloque la muestra en el homogeneizador del molino de cuentas (ver Tabla de Materiales)a 4 °C. Asegúrese de que las tapas del tubo estén apretujadas y las muestras estén equilibradas dentro del homogeneizador.</li>
	<li>Homogeneizar la muestra a la velocidad más alta (ajuste 12) durante 4 min.</li>
	<li>Retire la muestra de las cuentas y colóquela en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, un imán provisto con el homogeneizador se puede utilizar para eliminar las cuentas de la muestra.</li>
	<li>Gire el extracto a 19.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para aclarar el extracto de proteína.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 ml sobre hielo, evitando el arrastre del precipitado blanco y nublado que se forma encima de la muestra. El sobrenadante es ahora el extracto aclarado. NOTA: Ahorre 10 μL del extracto aclarado para determinar la concentración total de proteínas.</li>
	<li>Utilice el extracto inmediatamente para los siguientes experimentos o flash congelar el extracto en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los extractos pueden almacenarse a temperatura ultrarrádiga (-80 °C congelador o nitrógeno líquido durante ~6 meses). Extractos congelados pueden ser descongelados una vez y no pueden ser refrozen.</li>
	<li>Determinar la concentración total de proteínas del extracto utilizando un kit de ensayo de concentración de proteínas compatible con detergentes (ver Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>3. Inmunoprecipitación
NOTA: Todos los pasos de inmunoprecipitación para la preparación de extractos deben realizarse en hielo o a 4 °C. Se recomienda utilizar 2 mg de proteína total para cada inmunoprecipitación. Sin embargo, se han realizado inmunoprecipitaciones exitosas con 0,8–1 mg de proteína total. Utilice siempre extractos de proteínas frescos o recién descongelados. Se describe el siguiente protocolo para realizar la inmunoprecipitación a partir de 2 mg de proteína total, o un único experimento de inmunoprecipitación. La cantidad de cuentas y anticuerpos puede aumentarse o disminuirse en consecuencia para múltiples muestras o si se utiliza una cantidad diferente de extracto de proteína.
<ol><li>Coloque o descongele el extracto de proteína en el hielo. La muestra se puede diluir a 10 mg/ml o 5 mg/ml con amortiguador de lisis 1x frío en hielo (ver Tabla 1).</li>
	<li>Resuspend las cuentas magnéticas por inversión y transferir 150 μL de la suspensión de cuentas del 50% en un tubo de 1,5 ml. Magnetice las cuentas sobre hielo contra un soporte magnético durante 1 minuto o hasta que la solución esté clara. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Retire el tubo del soporte magnético y lave las cuentas en 1 amortiguador de lisis 1x utilizando 2 volúmenes (es decir, 300 μL) de lodo de cuentas. Repita el lavado 2x para un total de tres lavados.</li>
	<li>Resuspend las cuentas en 150 μL de tampón de lisis helada.</li>
	<li>Transferir 75 μL de la loda de cuentas a 2 mg de extracto de proteína e incubar a 4 °C durante 1 h con agitación suave. Guarde la suspensión de cordón restante en hielo para su uso posterior. NOTA: Este paso se realiza para reducir la unión de proteínas no específicas a las cuentas durante el paso de inmunoprecipitación.</li>
	<li>Coloque el tubo con muestra en el soporte magnético sobre hielo durante 1 minuto o hasta que las cuentas estén completamente magnetizadas y la muestra esté clara. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml; no molesten a las cuentas. Este es el lisato de proteína precleared. Ahorre un 10% de la muestra para el análisis de manchas occidentales.</li>
	<li>Añadir 20 μg de anticuerpo purificado de afinidad al lisato preclearizado e incubar a 4 °C durante 1 h con agitación suave. NOTA: La cantidad de anticuerpos utilizados para la inmunoprecipitación es específica del anticuerpo y la proteína y debe determinarse empíricamente para garantizar una inmunoprecipitación eficaz de la proteína objetivo.</li>
	<li>Añada los 75 μL restantes de la suspensión de cuentas prelavadas (paso 3.5) a la mezcla de anticuerpos/liados e incubar durante 1 h a 4 °C con agitación suave.</li>
	<li>Coloque el tubo en el soporte magnético sobre hielo durante 1 minuto o hasta que las cuentas estén completamente magnetizadas y la muestra esté clara. Guarde el sobrenadante para el análisis de manchas occidentales (opcional).</li>
	<li>Lave las cuentas que contienen el inmunoprecipitado 3x en 450 μL de tampón de lavado (30 mM HEPES, pH = 7,4, cloruro de potasio de 100 mM, 0,1% Tritón X, cloruro de magnesio de 2 mM, 10% glicerol, 1 mM TDT; ver Tabla 1)sobre hielo. NOTA: Se pueden realizar lavados adicionales si se prefieren condiciones de lavado más estrictas.</li>
	<li>Resuspend el pellet de cuentas en 20 μL de 2x Tampón de carga de gel proteico SDS/BME (ver Tabla de Materiales)y desnatura hirviendo a 95 °C durante 5 minutos antes de cargar en un gel SDS-PAGE. Alternativamente, las muestras desnaturalizados se pueden almacenar a -20 °C durante varios meses. NOTA: Una porción del inmunoprecipitato del cordón se puede guardar para el aislamiento del ARN aguas abajo, si se desea.</li>
</ol>4. Detección de manchas occidentales de muestras ip
<ol><li>Cargue las muestras IP en el gel SDS-PAGE (consulte Tabla de materiales). Evite transferir las cuentas colocando los tubos IP en el soporte magnético durante 1 minuto antes de la aspiración de la muestra.</li>
	<li>Realizar la hinchazón occidental15,16 y la tinción de anticuerpos16 con las siguientes modificaciones: diluir el anticuerpo ALG-117 1:500 en 5% leche seca no grasa (NFDM); diluir el anticuerpo HRPK-12 1:1,000 en 5% NFDM; y diluir el anticuerpo AIN-118 1:10,000 en 5% NFDM. Se utilizaron anticuerpos secundarios (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Detecte las bandas con quimioluminiscencia basada en HRP (consulte Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

C. elegans es un excelente modelo para estudiar cuestiones fundamentales en biología celular, molecular y de desarrollo19. Además de su poder como sistema de modelos genéticos, C. elegans es apto para enfoques bioquímicos, incluyendo, pero no limitado a, inmunoprecipitación de proteínas y co-inmunoprecipitación. Un obstáculo potencial a la hora de llevar a cabo experimentos de inmunoprecipitación es la falta de anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Si no hay anticuerpo disponible, se pueden generar anticuerpos policlonales o monoclonales personalizados. Sin embargo, las innovaciones recientes en la tecnología de edición del genoma han permitido a los investigadores introducir rápidamente mutaciones o etiquetar genes C. elegans endógenos 20,21, facilitando estudios que desentrañan las interacciones genéticas, funcionales y físicas entre los genes y las proteínas codificadas. En concreto, el etiquetado mediado por CRISPR/Cas9 de los genes C. elegans en el loci endógeno ha reducido la dependencia de los experimentos de inmunoprecipitación en la disponibilidad de anticuerpos, haciendo que los experimentos de inmunoprecipitación sean mucho más factibles. Los genes C. elegans se pueden etiquetar con una variedad de etiquetas que van desde etiquetas fluorescentes como GFP o mCherry hasta pequeñas etiquetas como FLAG y HA. Los anticuerpos que reconocen estas etiquetas están disponibles comercialmente, facilitando los estudios de interacciones proteína-proteína a través de enfoques de inmunoprecipitación.
El protocolo presentado, descrito en la Figura 1,se puede realizar para un pequeño número de muestras o escalar verticalmente, lo que permite hasta 24 preparaciones de muestras a la vez. Mientras que las caracterizaciones iniciales de las interacciones proteína-proteína a través de la inmunoprecipitación se realizan típicamente en fondos de tipo salvaje en condiciones normales de cultivo, los estudios de seguimiento con frecuencia requieren probar las interacciones proteína-proteína en una variedad de orígenes genéticos o en diferentes condiciones de crecimiento. La capacidad de preparar simultáneamente múltiples extractos ahorra tiempo y, lo que es más importante, asegura la consistencia de preparación de extractos entre las diferentes muestras. Siempre se requiere un control negativo, siendo el control ideal una mutación nula en la codificación genética de la proteína inmunoprecipitada de interés (Ver Figura 3 y Figura 4 como ejemplos).
Este protocolo de extracto permite la preparación rápida de extractos de proteínas de muestras de C. elegans y es comparable a la homogeneización basada en abalorios de circonio8. La homogeneización de cuentas en general se puede escalar hasta múltiples preparaciones simultáneas de muestras utilizando una variedad de homogeneizadores de molinos de cuentas o equipos similares. Sin embargo, algunos homogeneizadores de molinos de cuentas más económicos pueden reducir el número de muestras que se pueden procesar simultáneamente. Alternativamente, el protocolo de extracto presentado es compatible con la preparación de extractos a base de dounce, que representa una alternativa económica. Mientras que diferentes homogeneizadores de molino de cuentas no fueron probados, la mayoría es probable que sean compatibles con este protocolo de extracto de proteínas, siempre y cuando se logre la interrupción completa de las muestras de C. elegans.
Como se presenta, este protocolo de preparación de extractos es compatible con múltiples experimentos posteriores, incluyendo inmunoprecipitación de proteínas2 y microRNA pull-down12 y permite la recolección aguas abajo de componentes de proteínas y ARN. También extrae eficientemente proteínas nucleares y citoplasmáticas(Figura 2, Figura 3y Figura 4). Del mismo modo, el protocolo de inmunoprecipitación presentado permite el aislamiento del ARN de los inmunoprecipitatos asociados a proteínas. Mientras que el protocolo de inmunoprecipitación fue desarrollado originalmente para identificar interactores proteicos ALG-1, el método se puede adaptar para probar las interacciones entre cualquier proteína de interés. De hecho, las condiciones de inmunoprecipitación utilizadas funcionaron igualmente bien para la inmunoprecipitación de ALG-1 (Figura 3) y HRPK-1 (Figura 4). Este protocolo es un excelente punto de partida para la inmunoproficación de proteínas que unen ARN. Sin embargo, cabe señalar que algunos cambios en la composición del buffer pueden ser necesarios para otras proteínas de interés. Los cambios pueden depender de las propiedades físicas y bioquímicas de la proteína de interés y deben implementarse caso por caso.
Una vez que la proteína objetivo (aquí, ALG-1 o HRPK-1) está inmunoprecipitada, la hinchazón occidental se puede utilizar para probar el co-inmunoprecipitado para interactores proteicos específicos.
Alternativamente, el inmunoprecipitato copurificado puede someterse a análisis de espectrometría de masas para identificar todas las proteínas que interactúan con el putativo. Las interacciones confirmadas de inmunoprecipitación conjunta pueden examinarse en una variedad de antecedentes genéticos o condiciones para identificar la regulación potencial de la interacción específica. Por ejemplo, para determinar si hrpk-1 desempeña un papel en el ensamblado MIRISC ALG-1/AIN-1, se evaluó la coprecipitación ALG-1-AIN-1 tanto en un fondo de tipo salvaje como en ausencia de HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 se encontró que era prescindible para la interacción ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Además, la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 se puede emplear para generar mutaciones de eliminación de un solo punto o dominio en las proteínas de interés. Volver a probar la capacidad de los mutantes generados para coprecipitar con sus interactores proteicos puede revelar qué dominios o residuos median en la interacción física. Estos estudios futuros pueden producir información inestimable sobre el mecanismo de función y regulación de las proteínas. Estos enfoques, combinados con el poder de la genética C. elegans, pueden proporcionar información importante sobre los procesos moleculares fundamentales que rigen el desarrollo animal y la función celular.

Identificar las interacciones macromoleculares de una proteína de interés puede ser clave para aprender más sobre su función. Los experimentos de inmunoprecipitación y co-inmunoprecipitación se pueden utilizar para identificar todo el interactoma de una proteína a través de enfoques proteómicos a gran escala1 o para probar específicamente la capacidad de una proteína para coprecipitar con un interactor hipotético. En C. elegans,ambos métodos se han empleado con éxito para aprender más sobre la actividad de una variedad de proteínas, incluidas las que funcionan estrechamente con microRNAs para regular la expresión génica2,3,4. Los experimentos de inmunoprecipitación co-tienen la ventaja de probar las interacciones proteína-proteína en su entorno celular nativo, pero la preparación de extractos puede ser desafiante y llevar mucho tiempo. Es necesaria una lisis eficiente de la muestra, pero se debe tener cuidado de minimizar la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Métodos como la dotación5,sonicación6,homogeneización de Balch7,y zirconia cuentas-homogeneización8,9 se han utilizado para preparar con éxito C. elegans extractos de proteína total. Estos métodos, con la excepción de la homogeneización de cuentas zirconia, tienen limitaciones en términos del número de muestras que se pueden procesar simultáneamente. Presentado es un método alternativo que se puede escalar fácilmente para permitir la preparación de extractos proteicos rápidos de alto rendimiento a partir de muestras de C. elegans seguida de co-inmunoprecipitación. Específicamente, el método puede preparar hasta 24 muestras a la vez, reduciendo en gran medida el tiempo necesario para la preparación de extractos. Por el contrario, por ejemplo, el douncing normalmente permite una sola preparación de muestra a la vez. Este método de extracto se puede utilizar para preparar extractos de cualquier etapa de desarrollo de C. elegans.
Descrito es un procedimiento paso a paso para la recolección de muestras de animales, preparación de extractos, inmunoprecipitación y presentación de datos de distensión occidental para confirmar el cierre exitoso de proteínas y la detección de la proteína co-inmunoprecipitante de interés. Para demostrar la eficacia del protocolo, se realizaron dos experimentos de inmunoprecipitación compartida entre 1) microRNA Argonaute ALG-1 y AIN-1, un homolog GW182; y 2) ALG-1 y HRPK-1, un interactor ALG-1 recientemente identificado2. ALG-1 y AIN-1 son proteínas básicas que comprenden el complejo de silenciamiento inducido por microRNA (miRISC) y la interacción entre estas dos proteínas está bien establecida10,11. El protocolo de preparación de extractos fue eficaz en el experimento de coinprecipitación ALG-1-AIN-1. Este protocolo también confirmó con éxito la interacción entre ALG-1 y su interactor recién identificado, HRPK-12.
En resumen, el manuscrito describe un protocolo de preparación de extractos de C. elegans que se puede escalar hasta procesar simultáneamente 24 muestras junto con un protocolo de inmunoprecipitación que se puede utilizar para identificar interacciones nuevas o confirmar hipotestesizadas entre proteínas. El protocolo de preparación de extractos es compatible con una serie de experimentos posteriores, incluyendo inmunoprecipitación de proteínas2 y pulldowns de microRNA12. Además, el protocolo de inmunoprecipitación se puede adaptar para detectar interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, etiquetadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de orígenes genéticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:989px;" width="989">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">15 mL tube</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-664</td>
			<td style="width:213px;">STEP 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>1610737</td>
			<td>STEP 3.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8211;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>4561096</td>
			<td>STEP 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-AIN-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-ALG-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td>
			<td style="width:195px;">custom generated by PRF&#38;L</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm Homogenizer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9779-5G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10002D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>STEP 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">GFP antibody (FL)</td>
			<td style="width:195px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-8334</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">BioRed</td>
			<td style="width:119px;">1662408</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31470</td>
			<td>STEP 4.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H4034-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-95000</td>
			<td>STEP 4.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:463px;">Magnesium chloride hexahydrate ACS</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">VWRV0288-500G</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Magnesium Sulfate Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-333</td>
			<td>STEP 1.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 wild type</td>
			<td>CGC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>NAVYR1-RNA</td>
			<td>STEP 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P217-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P285-3</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RC DC Protein Assay Kit I</td>
			<td>BioRed</td>
			<td>5000121</td>
			<td>STEP 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10777019</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S271-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S374-500</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">TritionX-100</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100-500ML</td>
			<td>Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UY38 hrpk-1(zen17)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:463px;">VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VT3841 alg-1(tm492)</td>
			<td>available upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Los métodos de inmunoprecipitación co-se utilizan con frecuencia para estudiar interacciones proteína-proteína. La confirmación de interacciones hipotizadas proteína-proteínas o la identificación de otras nuevas puede proporcionar información invaluable sobre la función de una proteína de interés. Algunos de los métodos tradicionales para la preparación de extractos con frecuencia requieren técnicas intensivas en mano de obra y que consumen mucho tiempo. Aquí, un protocolo de preparación de extractos modificados utilizando un homogeneizador de molino de cuentas y cuentas de metal se describe como una alternativa rápida a los métodos tradicionales de preparación de proteínas. Este método de preparación de extractos es compatible con estudios de co-inmunoprecipitación aguas abajo. Como ejemplo, el método se utilizó para co-inmunoprecipitar correctamente C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 y dos interactores conocidos alG-1: AIN-1 y HRPK-1. Este protocolo incluye descripciones de la recolección de muestras de animales, preparación de extractos, aclaración de extractos e inmunoprecipitación de proteínas. El protocolo descrito se puede adaptar para detectar interacciones entre dos o más proteínas C. elegans endógenas, etiquetadas endógenamente o sobreexpresadas en una variedad de orígenes genéticos.

Este protocolo (esquematizado en la Figura 1)se utilizó con éxito para obtener extractos de proteína total C. elegans (Figura 2) para la inmunoprecipitación descendente de varias proteínas2 (Figura 3 y Figura 4). El protocolo de homogeneizador de molino de cuentas presentado era comparable en la extracción total de proteínas a métodos basados en dounce(Figura 2)y se extraía eficientemente nuclear (COL-19::GFP(NLS) (Figura 2) y proteínas citoplasmáticas (Figura 3 y Figura 4). Se extrajeron varias muestras de varios tamaños simultáneamente(Figura 2). Las proteínas Argonaute interactúan con los miembros de la familia de proteínas GW182, formando los miRISCs que se unen al mensajero objetivo RNAs y reprimen su expresión10. La Figura 3 muestra la co-inmunoprecipitación exitosa de los componentes miRISC centrales ALG-1 y AIN-1, de acuerdo con los informes anteriores11,17. Más recientemente, se hicieron esfuerzos para identificar interactores proteicos adicionales de Argonaute ALG-13 con el fin de aprender más acerca de cómo la biogénesis y la actividad del microRNA podrían estar reguladas por factores auxiliares. La proteína de unión al ARN HRPK-1 se identificó en inmunoprecipitatos ALG-13. Esta interacción se confirmó recientemente en un experimento recíproco de inmunoprecipitación HRPK-12. Los protocolos de extracción e inmunoprecipitación presentados recuperaron con éxito ALG-1 en co-inmunoprecipitatos específicos de HRPK-1 (Figura 4). Además, la interacción ALG-1—AIN-1 se probó en una variedad de antecedentes genéticos y se demostró que el HRPK-1 no era necesario para el ensamblaje2 de ALG-1/AIN-1 miRISC (Figura 3). Se proporcionan figuras suplementarias para mostrar la membrana completa sondeada(Figura suplementaria 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de flujo de trabajo para preparación e inmunoprecipitación de extractos de C. elegans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Comparación de manchas occidentales de un GFP localizado nuclear, COL-19::GFP(NLS), niveles en muestras preparadas para dounce y homogeneizadas de pellets de gusano de 250 μL y 100 μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: GW182 homolog AIN-1 co-inmunoprecipita con ALG-1. Hinchazón occidental para proteínas ALG-1 y AIN-1 en inmunoprecipitatos ALG-1. La co-inmunoprecipitación ALG-1/AIN-1 no se vio afectada por la ausencia de hrpk-1. Entrada = 10% de IP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: ALG-1 co-inmunoprecipita con HRPK-1. Se muestra hinchazón occidental para HRPK-1 y ALG-1 en inmunoprecipitatos HRPK-1. Entrada = 10% de IP. * indica la cadena pesada de anticuerpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Búfer M9 (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>hasta 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x búfer de lisis (5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>hasta 5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Añadir fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TDT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibidor de la proteasa libre de EDTA</td>
			<td>1 comprimido</td>
		</tr>
<tr>
<td>cóctel inhibidor de la fosfatasa 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cóctel inhibidor de la fosfatasa 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x búfer de lisis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluir 2x búfer de lisis con un volumen igual de ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x búfer de lavado 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% glicerol</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>hasta 10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M TDT</td>
			<td>20 μL (añadir fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Recetas
Figura suplementaria 1. Se muestran las membranas de mancha occidental sondeadas completas utilizadas para generar figuras 2-4. (A) Membrana sondeada para la Figura 2. Tenga en cuenta que la membrana se cortó para permitir el sondeo simultáneo de GFP y Tubulin, reduciendo el tamaño total de la mancha. (B) Membrana sondeada para la Figura 3. (C) Membrana sondeada para la Figura 3. *denota una cadena pesada de anticuerpos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

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Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

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Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

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Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Reconstitución in Vitro de patrones de contacto de células espaciales con Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres aislados y perlas de poliestireno adhesivo

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...