Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالتمويل من مبادرة أبحاث مؤسسة لوندبيك حول حواجز الدماغ وتسليم الأدوية (RIBBDD) ومؤسسة عائلة سيمون هوغنرز.

1- إعداد المخازن المؤقتة والحلول استزراع الخلايا
<ol><li>إعداد محلول مخزون الكولاجين عن طريق حل 5 ملغ من الكولاجين الرابع من المشيمة البشرية في 50 مل من برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 °C. Aliquot حل الأسهم في أجزاء 5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد محلول مخزون الليفي عن طريق حل 5 ملغ من ...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

في هذه الدراسة، قمنا بتقديم طريقة لعزل البيرليكات الأولية من أدمغة الأبقار. البروتوكول الموصوف يسمح الثقافة من هذا النوع خلية غير قابلة للوصول بدلاً من ذلك. في وقت لاحق تم الحصول على ثقافة الخلية هو سكان متجانس تقريبا من pericytes، مع تلوث قليل أو معدومة مع الخلايا البطانية والخلايا الدبقية ع?...

الشعيرات الدموية في الدماغ، جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية والخلايا الفلكية، تشكل NVU1،2،3. تشكل الخلايا البطانية ، التي تشكل الأساس الهيكلي للعيعييات ، أنابيب أسطوانية طويلة بقطر 5-8 ميكرومتر. وتغطي الخلايا البطانية بشكل متقطع مع الخصيات وتحيط بها نتوءات من الخلايا الفلكية; endfeet الفلكية.
حاجز الدم في الدماغ (BBB)، يقع في الشعيرات الدموية في الدماغ، هو الموقع الرئيسي لتبادل المواد الغذائية والغازات ونفايات المنتجات بين الدماغ والدم. كما يحمي BBB الدماغ من السموم العصبية الذاتية والخارجية، ويعمل كحاجز لإيصال عدد كبير من مركبات المخدرات. وظيفة الحاجز هو مجال التركيز، فضلا عن عقبة، لشركات الأدوية تطوير أدوية الجهاز العصبي المركزي (CNS). وقد أثار هذا اهتماما كبيرا في التحقيق في خلايا NVU في الثقافة4. وقد تم زراعة الخلايا الفلكية في الدماغ والخلايا البطانية وتتميز في عدد من الدراسات، في حين أن الدراسات والبروتوكولات لثقافة البيرثيت متناثرة.
وقد وصفت البروتوكولات المنشورة سابقا جيل من الثقافات الشعيرات الدموية في الدماغ إلى حد ما، وذلك باستخدام مجموعة من النهج المختلفة مثل المناعة5،وسائل الإعلام عالية ومنخفضة الجلوكوز6،الخلايا الفلورية المنشطة فرز7،كثافة الانحدار المركزي8،الخ. على الرغم من أن هذه الأساليب تبدو كافية للحصول على ثقافات من pericytes، وبعضها مضيعة للوقت، وتكلفة باهظة الثمن وال pericytes الحصول على قد لا تكون مثالية نظرا لعدد من الممرات الثقافة التي يمكن أن دي- تمييز pericytes9. وعلاوة على ذلك، فإن إمكانات pericytes مثقف في دراسات الإشارات في المختبر لم يتم استكشافها إلى حد ما حتى الآن.
يركز العمل الحالي على توليد ثقافات pericyte من الشعيرات الدموية المخية البقرية المعزولة والإعداد اللاحق للقياسات ودراسات التصوير للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ، وهو رسول ثانٍ مهم داخل الخلايا. نحن نصف بإيجاز عزل الشعيرات الدموية عن المادة الرمادية القشرية (للحصول على التفاصيل انظر هيلمز وآخرون10)وعزل وثقافة البيريثيات في زراعة أحادية نقية دون تلوث مع الخلايا البطانية أو الدبقية. ثم نقدم بروتوكولا لبذات من pericytes في 96-جيدا لوحات وبروتوكولات التحميل لمسبار الكالسيوم فورا -2 AM. وأخيرا، فإننا نظهر كيف يمكن استخدام البيرليكات في التصوير confocal في الوقت الحقيقي في غرف ثقافة المجهر ووصف البروتوكولات لهذا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

ترتبط الـ Pericytes بالخلايا البطانية و endfeet الفلكية في بنية تعرف باسم الوحدة العصبية الوعائية (NVU). وظيفة بيريميري الدماغ غير معروفة تماما. وقد اقترح Pericytes للمشاركة في تطوير الشعيرات الدموية، وتنظيم ضيق الحاجز البطانية ونشاط trancytosis، وتنظيم لهجة الشعرية ولعب أدوار حاسمة في بعض أمراض الدماغ.
Pericytes هي صعبة للتحقيق في الدماغ سليمة بسبب صعوبات في تصور العمليات في الدماغ parenchyma، فضلا عن القرب من الخلايا الأخرى من NVU. يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وثقافة الشعيرات الدموية الدموية الأولية في الدماغ واستخدامها التالي في دراسات تصوير الكالسيوم ، حيث يمكن التحقيق في آثار ناهضين يشاركون في إشارات الدماغ والأمراض. يسمح لشظايا الشعيرات الدموية القشرية بالتعلق بأسفل قارورة الثقافة ، وبعد 6 أيام ، نمت الخلايا البطانية والخلايا من شظايا الشعيرات الدموية. تتم إزالة الخلايا البطانية عن طريق التربسينسيس لطيف ويتم استزراع pericytes لمدة 5 أيام إضافية قبل passaging.
يتم بذر pericytes المعزولة في 96-جيدا لوحات ثقافة وتحميلها مع صبغة مؤشر الكالسيوم (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) للسماح لقياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في إعداد قارئ لوحة. بدلاً من ذلك، يتم بذر البيريسيت على الأغطية ويتم تركيبها في غرف الخلايا. بعد التحميل مع مؤشر الكالسيوم (Cal-520 AM)، يمكن إجراء التصوير الحي للكالسيوم باستخدام المجهر الناظر في الطول الموجي للإثارة من 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 510-520 نانومتر.
وقد استخدمت الطريقة المذكورة هنا للحصول على قياسات الكالسيوم الأولى داخل الخلايا من بيريكيات الشعيرات الدموية الأولية في الدماغ، مما يدل على أن يتم تحفيز بيريكيتس عن طريق ATP وقادرة على العقد في المختبر.

تم عزل الشعيرات الدموية المخ البقرية من أنسجة الدماغ الطازجة والشكل 1 يعرض البذر الشعرية والخروج الخلوي على مدى أيام وتنقية لاحقة من pericytes. يتم إرفاق الشعيرات الدموية بالكامل إلى القارورة في اليوم 1 وفي اليوم 2 براعم البطانية أصبحت مرئية(الشكل 1...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

البيريات الشعيرات الدموية هي لاعبين أساسيين في تنظيم خصائص حاجز الدم في الدماغ وتدفق الدم. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن عزل الشعيرات الشعرية في الدماغ، واستزراعها، وتتميز فيما يتعلق بنوع الخلية، وتطبيقها على التحقيقات في إشارات الكالسيوم داخل الخلايا مع تحقيقات الفلورسنت.

ثقافة بيريكيتس الشعيرات الدموية في الدماغ لقياسات الكالسيوم السيتوسوليك ودراسات تصوير الكالسيوم

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

هذا هو وسيلة بسيطة وفعالة لعزل واستزراع بيريكيات الدماغ الأولية لدراسة إشارات الكالسيوم بين الخلايا. ثقافة الخلايا التي تم الحصول عليها هي مجموعة متجانسة تقريبًا من الـ(بيريكيت)، ومن السهل تحميل الـ pericytes لتصوير الكالسيوم. يجب أن توفر الطرق الموصوفة هنا للباحثين الآخرين في هذا المجال أدوات قوية لدراسة بيولوجيا البيريكس، وإشارات داخل الخلايا في بيريكيتس في المختبر.تبدأ من خلال ذوبان قارورة واحدة من الشعيرات الدموية في حمام الماء 37 درجة مئوية. مرة واحدة قد ذاب الشعيرات الدموية، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي مع 30 ملليلتر من شركات DMEM، والطرد المركزي لهم لمدة خمس دقائق في 500 مرة G.Then، وإزالة المتوسطة من الأنبوب، وإعادة تعليق لوحة في 10 ملليلتر من شركات DMEM الطازجة. نقل التعليق إلى قارورة T-75 المغلفة، والسماح الشعيرات الدموية للتمسك أسفل لمدة أربع إلى ست ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية مزودة 10٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد الحضانة، افحص القارورة تحت مجهر خفيف. وينبغي الآن أن تعلق كسور من الشعيرات الدموية إلى الجزء السفلي من القارورة. في اليوم الرابع بعد زرع الشعيرات الدموية، افحصها تحت المجهر للتأكد من أنها التقاء ما يقرب من 60 إلى 70٪.التعرق المتوسطة، وغسل بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلترين من التربسين-EDTA المذاب، وترك القارورة في الحاضنة لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق، مع أخذ القارورة في كثير من الأحيان، ومراقبة مفرزة الخلايا مع المجهر. عندما تبدأ الخلايا البطانية في الدوس، اضغط بلطف على القارورة لفصلها.عندما يكون لديك فصل الخلايا، إيقاف التبسينية عن طريق إضافة 10 ملليلتر من شركات DMEM إلى القارورة. تدفق قارورة عدة مرات مع المتوسطة، ويؤشّر تعليق الخلية البطانية، والتي يمكن استخدامها الآن لأغراض أخرى. إضافة 10 ملليلتر من شركات DMEM إلى القارورة، والتحقق من ذلك تحت المجهر الخفيف لضمان أن pericytes لا تزال موجودة ومتعلقة إلى أسفل.ثم، ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة للسماح للثقافة الغنية بال pericyte أن تنمو. لزرع pericytes في لوحات 96-جيدا المغلفة، وفصل لهم كما هو موضح في مخطوطة النص. التعرق المتوسطة، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من شركات DMEM الطازجة.عد الخلايا باستخدام غرفة العد، ثم حساب حجم التعليق التي ينبغي أن تضاف إلى كل بئر إلى البذور 10، 000 خلية في البئر. إضافة تعليق الخلية، ثم إضافة ما يكفي من شركات DMEM إلى الخلايا لتحقيق حجم إجمالي 200 ميكرولترس في البئر. عندما تكون جاهزة لتحميل البيريسيت مع صبغة مؤشر الكالسيوم فوا-2 AM، خذ لوحة 96-جيدا مع الخلايا من الحاضنة، ويتبخر المتوسطة من الآبار.غسل الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت المقايسة، وإضافة 100 ميكرولترات من حل التحميل إلى كل بئر. التفاف لوحة مع tinfoil لتجنب تبييض الصور، واحتضان لمدة 45 دقيقة مع 30 دورة في الدقيقة تهتز في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، التعرق العازلة التحميل، وغسل الخلايا مع العازلة مُجرّد مرتين.إضافة 100 ميكرولترات من جديد إلى المخزن المؤقت المقايسة، وترك الخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، تعيين درجة حرارة قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية، ونقل لوحة 96-جيدا مع الخلايا إلى وضع لوحة عينة، ثم وضع لوحة الكاشف مع ناهض في موقف لوحة الكاشف. ابدأ بقياس تحميل الخلايا لضمان التحميل المتساوي لـ Fura-2 AM في جميع الآبار، ثم قم بإجراء القياسات بطول موجي مفلور الإثارة عند 340 إلى 380 نانومتر، والطول الموجي للانبعاثات عند 510 نانومتر.إضافة 50 ميكرولترات من ناهض، بسرعة 150 ميكرولتر في الثانية الواحدة، من لوحة الكاشف إلى كل بئر مع الخلايا. جبل زلة غطاء في غرفة الخلية، وتشديد عليه لتجنب تسرب. إضافة شركات DMEM وحجم محسوب من تعليق الخلية في كل غرفة، لحجم النهائي من 500 ميكرولترات.احتضان غرف الخلية في 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ستة أيام، أو حتى التقاء. مرة واحدة في الخلايا التقاء، تأخذ غرف الخلية من الحاضنة، ويتبخر المتوسطة. اغسل الخلايا مرتين بمخزن الفحص المؤقت، وأضف 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل إلى كل غرفة، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.بعد الحضانة، وpirate العازلة التحميل، وغسل الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت المقايسة، ثم إضافة 500 ميكرولتررس من المخزن المؤقت مقولاة جديدة إلى كل غرفة واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة، للسماح انشقاق من استر صباحا. استبدل المخزن المؤقت بـ 500 ميكرولترات من مخزن المقايسة الطازج، وامضي في التصوير المباشر في مجهر confocal. قم بتركيب غرفة الخلية على خشبة المجهر برفق ممكن لتجنب اضطراب الخلايا.تعيين الطول الموجي الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 515 نانومتر، واثنين من دقيقة اقتناء صورة متسلسلة مع خمس فترات ثانية، وx، ص حجم الصورة من 512 في 512 بكسل. إضافة 300 ميكرولترات من ATP 100 ملليمولار إلى غرفة الخلية، وبدء الحصول على الصورة. تم استخدام هذا البروتوكول لتنقية pericytes من الشعيرات الدموية المخ البقرية.تم تصوير الخروج الخلوي من الشعيرات الدموية المصنفة على مدى تسعة أيام. كانت الشعيرات الدموية متصلة بالكامل بالقارورة في اليوم الأول ، وبحلول اليوم الثاني ، كانت النتدية البطانية مرئية. بعد أربعة أيام ، كان النمو الخلوي مميزًا ، وتمت إزالة الخلايا البطانية عن طريق التبسيني.وكانت بقايا الشعيرات الدموية موجودة بعد التربسينسيس، ولكنها اختفت من القارورة في الأيام التالية. بعد إزالة طبقة البطانية، سمح لل pericytes أن تنمو حتى التقاء. في اليوم التاسع، وصلت الـ(بيريتس) إلى 80٪ تقريباً من الالتقاء، وشكلت جزراً.إضافة ATP إلى pericytes تحميل فورا-2 أدى إلى زيادة في مستويات الكالسيوم السيتوسولي. حدثت الاستجابة مباشرة بعد إضافة ATP إلى الـ pericytes ، وانخفضت ببطء خلال الفترة الزمنية المقاسة. كما تم قياس استجابة الكالسيوم مع التصوير confocal في الوقت الحقيقي.تم قياس الفلورس الأساسي ، ثم تمت إضافة ATP في 64 ثانية ، وكانت استجابة الكالسيوم داخل الخلايا واضحة. بعد فترة وجيزة، الكالسيوم الخلوي مجزأة في الخلايا، وانخفاض في منطقة الخلية كان مرئيا. وبحلول 300 ثانية، انخفضت منطقة الخلية بشكل كبير، وانخفضت الفلوريسنس تقريبا إلى مستويات خط الأساس.وقد استخدمت هذه الطريقة للحصول على أول قياسات الكالسيوم داخل الخلايا من الشعيرات الشعيرية الأولية في الدماغ، مما يدل على أن يتم تحفيز بيريكيتس عن طريق ATP، وقادرة على العقد في المختبر.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

إعداد شرائح الحاد المنطقة Subventricular للتصوير الكالسيوم

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

الحقن الفيروسي المجسم، وزرع عدسة مؤشر التدرج لتصوير الكالسيوم العميق للدماغ في الجسم الحي

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

تصوير الكالسيوم في القولون العلوي للفأر

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...