Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende finansiering fra Lundbeckfondens forskningsinitiativ om hjernebarrierer og lægemiddellevering (RIBBDD) og Simon Hougners Family Foundation.

1. Udarbejdelse af buffere og opløsninger til celledyrkning
<ol><li>Forbered kollagen stock opløsning ved at opløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS natten over ved 4 °C. Forstænker lageropløsningen i 5 ml portioner og opbevares ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered fibronectin stock opløsning ved at opløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vand natten over. Fibronectinlagrene opbevares i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Ved optøning tilsættes PBS til et slutvolumen på 50 ml for at klargøre arbejd...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

I denne undersøgelse har vi præsenteret en metode til at isolere primære pericytter fra kvæghjerner. Den beskrevne protokol tillader kultur af denne ellers temmelig utilgængelige celletype. Den efterfølgende opnåede cellekultur var en næsten homogen population af pericytter med ringe eller ingen kontaminering med endotelceller og gliaceller baseret på cellemorfologi og proteinudtryk12. Desuden viste vi en enkel og enkel metode til at indlæse pericytter med calciumfarvestoffer til Ca...

Hjerne kapillær pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, udgør NVU1,2,3. Endotelcellerne, som udgør det strukturelle grundlag for kapillærerne, danner lange cylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellerne er sporadisk dækket med pericytter og omgivet af fremspring fra astrocytter; den astrocyte endfeet.
Blod- og hjernebarrieren (BBB), der ligger ved hjernekapillærerne, er det vigtigste sted for udveksling af næringsstoffer, gasser og affaldsprodukter mellem hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mod endogene og udefrakommende neurotoksiner og fungerer som en barriere for levering af et stort antal narkotikaforbindelser. Barrierefunktionen er et fokusområde, samt en hindring for medicinalfirmaer, der udvikler lægemidler fra centralnervesystemet (CNS). Dette har ansporet en stor interesse i at undersøge cellerne i NVU i kultur4. Hjernen astrocytter og endotelceller er blevet dyrket og karakteriseret i en række undersøgelser, mens undersøgelser og protokoller for pericyte kultur er sparsomme.
Tidligere offentliggjorte protokoller har beskrevet generation af hjernen kapillær pericyte kulturer til en vis grad, ved hjælp af en række forskellige tilgange såsom immunopanning5,høj- og lavglose medier6, fluorescerende-aktiveret celle sortering7, tæthed gradient centrifugering8, osv. Selv om disse metoder synes tilstrækkelige til at opnå kulturer af pericytes, nogle er tidskrævende, omkostninger dyre og pericytes opnået måske ikke være ideel på grund af antallet af kultur passager, der kan de-differentiere pericytes9. Desuden har potentialet i dyrkede pericytes in vitro signalering undersøgelser været temmelig uudforsket indtil nu.
Det nuværende arbejde fokuserer på generation af pericytkulturer fra isolerede kvæghjernens kapillærer og den efterfølgende opsætning til målinger og billeddannelsesundersøgelser af ændringer i intracellulært calcium, en vigtig intracellulær anden budbringer. Vi beskriver kort isoleringen af kapillærer fra kortikale grå materie (se Helms et al.10) og pericytes isolation og kultur i ren monokultur uden forurening med endotel- eller gliaceller. Vi giver derefter en protokol for såning af pericytter i 96-brønd plader og lastning protokoller for calcium sonden Fura-2 AM. Endelig viser vi, hvordan pericytter kan bruges i realtid konfokal billeddannelse i mikroskop kultur kamre og beskrive protokollerne for dette.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytiske endfeet i en struktur kendt som neurovaskulær enhed (NVU). Hjernen kapillær pericyte funktion er ikke fuldt kendt. Pericytter er blevet foreslået at være involveret i kapillær udvikling, regulering af endotel barriere tæthed og trancytose aktivitet, regulering af kapillær tone og til at spille afgørende roller i visse hjernen patologier.
Pericytes er udfordrende at undersøge i den intakte hjerne på grund af vanskelighederne med at visualisere processer i hjernen parenkym, samt tæt på de andre celler i NVU. Denne protokol beskriver en metode til isolering og kultur af primære kvæg hjerne kapillær pericytter og deres følgende brug i calcium billeddannelse undersøgelser, hvor virkningerne af agonister involveret i hjernen signalering og patologier kan undersøges. Kortikale kapillærfragmenter får lov til at binde sig til bunden af kulturkolber, og efter 6 dage er endotelceller og pericytter vokset ud af kapillærfragmenterne. Endotelcellerne fjernes ved blid trypsinisering, og pericytter dyrkes i yderligere 5 dage, før de passerer.
Isolerede pericytter er seedet i 96-brønd kultur plader og fyldt med calcium indikator farvestof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) for at give mulighed for målinger af intracellulære calcium niveauer i en pladelæser setup. Alternativt er pericytter sået på coverslips og monteret i cellekamre. Efter belastning med calciumindikatoren (Cal-520 AM) kan calcium levende billeddannelse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 510-520 nm.
Den metode, der er beskrevet her, er blevet anvendt til at opnå de første intracellulære calciummålinger fra primære hjernekapillære pericytter, hvilket viser, at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til at indgå kontrakter in vitro.

Kvæghjernens kapillærer blev isoleret fra frisk hjernevæv, og figur 1 præsenterer kapillær såning og cellulær udvækst over dage og efterfølgende rensning af pericytter. Kapillærerne er fuldt fastgjort til kolben på dag 1, og på dag 2 er endotelspirering blevet synlig(figur 1,dag 2). Efter 4 dage, den cellulære udvækst er meget karakteristisk(Figur 1, dag 4a) og endotelceller fjernes ved...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Hjernen kapillær pericytter er væsentlige aktører i reguleringen af blod - hjerne barrieren egenskaber og blodgennemstrømning. Denne protokol beskriver, hvordan hjernen kapillær pericytter kan isoleres, kulturperler, karakteriseret med hensyn til celletype og anvendes til undersøgelser af intracellulære calcium signalering med fluorescerende sonder.

Kultur af Brain Kapillære Pericytes for cytosolic calcium målinger og calcium Imaging Undersøgelser

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Dette er en enkel og effektiv metode til isolering og dyrkning primær hjerne pericytes til undersøgelse af intercellulære calcium signalering. Den opnåede cellekultur er en næsten homogen population af pericytter, og det er ligetil at indlæse pericytter til calciumbilleddannelse. De metoder, der er beskrevet her bør give andre forskere på området med stærke værktøjer til at studere pericyte biologi, og intracellulære signalering i pericytes in vitro.Begynd med optøning et hætteglas af kapillærer i en 37 grader Celsius vandbad. Når kapillærerne er optøet, overføre dem til en centrifuge rør med 30 milliliter DMEM comp, og centrifuge dem i fem minutter ved 500 gange G.Then fjerne mediet fra røret, og re-suspendere paletten i 10 milliliter frisk DMEM comp. Suspensionen overføres til en belagt T-75-kolbe, og kapillærerne kan klæbes til bunden i fire til seks timer i en 37 grader Celsius-inkubator, der leveres med 10 % kuldioxid.Efter inkubationen inspiceres kolben under et let mikroskop. Fraktioner af kapillærer bør nu fastgøres til bunden af kolben. På dag fire efter såning af kapillærerne, inspicere dem under mikroskopet for at sikre, at de er ca 60 til 70% sammenløb.Aspirer mediet, og vask forsigtigt cellerne med PBS. Der tilsættes to milliliter optøet trypsin-EDTA, og kolben i rugemaskinen i et til tre minutter, idet kolben tages ud hyppigt, og cellerne løsnes med mikroskopet. Når endotelcellerne begynder at runde op, skal du banke på kolben forsigtigt for at løsne dem.Når cellerne er taget af, skal du stoppe trypsiniseringen ved at tilsætte 10 ml DMEM comp til kolben. Kolben skylles et par gange med mediet, og indsugning af endotelcellesuspensionen, som nu kan bruges til andre formål. Der tilsættes 10 milliliter DMEM-comp til kolben, og den kontrolleres under det lette mikroskop for at sikre, at pericyterne stadig er til stede og fastgjort til bunden.Sæt derefter kolben tilbage i kuvøsen, så den pericyteberigede dyrs dyring kan vokse. For at frø pericytter i belagt 96-brønd plader, løsrive dem som beskrevet i teksten manuskript. Aspirere mediet, passe på ikke at forstyrre celle pellet, Og re-suspendere pellet i en milliliter frisk DMEM comp.Tæl cellerne ved hjælp af et tællekammer, og beregn derefter den mængde suspension, der skal tilsættes til hver brønd til frø 10.000 celler pr. brønd. Tilføj celle suspension, derefter tilføje nok DMEM comp til cellerne for at opnå et samlet volumen på 200 mikroliter per brønd. Når du er klar til at indlæse pericytter med Fura-2 AM calcium indikator farvestof, tage 96-godt plade med cellerne ud af inkubatoren, og aspirere mediet fra brøndene.Vask cellerne to gange med analysebuffer, og tilsæt 100 mikroliter af lasteopløsning til hver brønd. Wrap pladen med stanniol for at undgå foto blegning, og inkubere det i 45 minutter med 30 RPM omrystning ved stuetemperatur. Efter inkubationen aspirere lastebufferen, og cellerne vaskes to gange med analysebufferen.Tilsæt 100 mikroliter frisk til analyse buffer, og lad cellerne til at inkubere i 30 minutter. Efter inkubationen indstilles pladelæserens temperatur til 37 grader Celsius, og den 96-brøndplade med celler overføres til prøvepladens position, hvor efterlyse-pladen med agonist ved reagenspladens position. Start med at måle belastning af cellerne for at sikre lige belastning af Fura-2 AM i alle brønde, derefter udføre målingerne med excitation fluorescens bølgelængde på 340 til 380 nanometer, og emissionen bølgelængde på 510 nanometer.Tilsæt 50 mikroliter af agonist, med en hastighed på 150 mikroliter per sekund, fra reagenspladen til hver brønd med celler. Monter et dæksel i cellekammeret, og stram det for at undgå lækager. Dmem-comp og den beregnede mængde cellesuspension i hvert kammer til et endeligt volumen på 500 mikroliter.Inkuber cellekamrene ved 37 grader Celsius og 10% kuldioxid i seks dage, eller indtil sammenløbet. Når cellerne er sammenløbet, tage cellekamrene ud af rugemaskinen, og aspirere mediet. Vask cellerne to gange med analysebuffer, og tilsæt 500 mikroliter læssebuffer til hvert kammer, og inkuber dem derefter ved stuetemperatur i 45 minutter.Efter inkubationen, aspirere lastebufferen, og vask cellerne to gange med analysebuffer, tilsæt derefter 500 mikroliter frisk analysebuffer til hvert kammer og inkuber dem i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur, så AM-esteren kan spaltning. Erstat bufferen med 500 mikroliter frisk analysebuffer, og fortsæt med levende billeddannelse ved et konfokal mikroskop. Monter cellekammeret på mikroskopets stade så forsigtigt som muligt for at undgå forstyrrelse af cellerne.Indstil excitation bølgelængde på 488 nanometer, emission på 515 nanometer, to minutter sekventiel billede erhvervelse med fem sekunders intervaller, og en x, y billede størrelse på 512 af 512 pixels. Tilføj 300 mikroliter på 100 millimolar ATP til cellekammeret, og initier billedopetagelse. Denne protokol blev brugt til at rense pericytter fra kvæg hjerne kapillærer.Cellulære udvækst fra de seedede kapillærer blev afbildet i løbet af ni dage. Kapillærerne var fuldt fastgjort til kolben på dag ét, og ved dag to var endotelspiring synlig. Efter fire dage, den cellulære udvækst var karakteristisk, og endotelceller blev fjernet via trypsinization.Rester af kapillærerne var til stede efter trypsinisering, men forsvandt fra kolben i de følgende dage. Efter fjernelse af endotellaget fik pericytterne lov til at vokse indtil sammenløbet. På dag ni, pericytes nåede ca 80% sammenløb, og dannede øer.Tilsætning af ATP til Fura-2 lastede pericytter resulterede i en stigning i cyklisk calcium niveauer. Responsen forekom umiddelbart efter tilsætning af ATP til pericytterne og faldt langsomt over den målte tidsperiode. Calciumresponsen blev også målt med konfokal billeddannelse i realtid.Baseline fluorescens blev målt, derefter BLEV ATP tilføjet ved 64 sekunder, og en stærk intracellulær calciumrespons var tydelig. Kort tid efter var det cykliske calcium opdelt i cellerne, og en reduktion i celleområdet var synlig. Med 300 sekunder reducerede celleområdet kraftigt, og fluorescensen faldt næsten til baseline-niveauerne.Denne metode er blevet anvendt til at opnå de første intracellulære calciummålinger fra primære hjernekapillære pericytter, hvilket viser, at pericytter stimuleres via ATP, og er i stand til at indgå in vitro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Funktionel Calcium Imaging i udviklingslandene Kortikal Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Fremstilling af akutte Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-foton Calcium Imaging i Neuronal dendritter i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation af Neuronal indbyggere ved hjælp af en to-foton Laser og dets vurdering ved hjælp af Calcium Imaging og adfærdsmæssige optagelse i zebrafisk larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjerne pericyt calcium og hæmodynamisk billeddannelse i transgene mus In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaksisk viral injektion og gradientindekslinseimplantation til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellulær billeddannelse af neuronal calciumhåndtering in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Calciumbilleddannelse i mus overlegen colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...