Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

De auteurs willen de financiering van de Lundbeck Foundation Research initiatief on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) en Simon Hougners Family Foundation te erkennen.

1. Voorbereiding van buffers en oplossingen voor celkuring
<ol><li>Bereid collageen voorraad oplossing door het oplossen van 5 mg collageen IV uit de menselijke placenta in 50 mL PBS 's nachts bij 4 °C. Aliquot de voorraadoplossing in 5 mL gedeelten en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid fibronectine voorraad oplossing door het oplossen van 5 mg fibronectine in 5 mL steriel water 's nachts. Bewaar de fibronectinvoorraden in aliquots van 500 μL bij -20 °C. Voeg bij het ontdooien PBS toe aan een eindvolume van 50 m...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

In deze studie hebben we een methode gepresenteerd om primaire pericyten te isoleren van runderhersenen. Het beschreven protocol staat cultuur van dit anders eerder ontoegankelijke celtype toe. De later verkregen celkweek was een bijna homogene populatie van pericyten, met weinig of geen besmetting met endotheelcellen en gliacellen op basis van celmorfologie en eiwitexpressie12. Bovendien hebben we een eenvoudige en eenvoudige methode aangetoond om de pericyten te laden met calciumkleurstoffen voo...

Hersencapillary pericyten vormen samen met endotheelcellen en astrocyten de NVU1,2,3. De endotheelcellen, die de structurele basis van de haarvaten vormen, vormen lange cilindrische buizen met een diameter van 5-8 μm. De endotheelcellen zijn sporadisch bedekt met pericyten en omgeven door uitsteeksels van astrocyten; de astrocyten eindvoeten.
De bloed-hersenbarrière (BBB), gelegen in de hersenvaten, is de belangrijkste plaats voor de uitwisseling van voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen tussen de hersenen en het bloed. De BBB beschermt ook de hersenen tegen endogene en exogene neurotoxinen en dient als een barrière voor de levering van een groot aantal geneesmiddelenverbindingen. De barrièrefunctie is een aandachtsgebied, evenals een obstakel, voor farmaceutische bedrijven die geneesmiddelen ontwikkelen voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Dit heeft een grote belangstelling aangespoord voor het onderzoek naar de cellen van de NVU in cultuur4. Hersen astrocyten en endotheelcellen zijn gekweekt en gekenmerkt in een aantal studies, terwijl de studies en protocollen voor pericyte cultuur zijn schaars.
Eerder gepubliceerde protocollen hebben de generatie van hersencapillaire pericyte culturen tot op zekere hoogte beschreven, met behulp van een reeks verschillende benaderingen, zoals immunopanning5,hoog- en laagglucose media6, fluorescerend geactiveerde celsorden7, dichtheidgradiëntcentrifugatie8, enz. Hoewel deze methoden voldoende lijken om culturen van pericyten te verkrijgen, zijn sommige tijdrovend, duur en de verkregen pericyten misschien niet ideaal vanwege het aantal cultuurpassages dat de pericyten9kan de-differentiëren. Bovendien is het potentieel van gekweekte pericyten in in vitro signaleringsstudies tot nu toe vrij onontgonnen.
Het huidige werk richt zich op het genereren van pericyte culturen uit geïsoleerde runderhersenvaten haarvaten en de daaropvolgende opstelling voor metingen en beeldvorming studies van veranderingen in intracellulair calcium, een belangrijke intracellulaire tweede boodschapper. We beschrijven kort de isolatie van haarvaten van corticale grijze stof (voor details zie Helms et al.10)en de isolatie en cultuur van pericyten in pure monocultuur zonder besmetting met endotheel of gliacellen. Vervolgens bieden we een protocol voor het zaaien van pericyten in 96-well platen en laadprotocollen voor de calciumsonde Fura-2 AM. Tot slot laten we zien hoe pericyten kunnen worden gebruikt in real-time confocale beeldvorming in microscoopcultuurkamers en beschrijven we de protocollen hiervoor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Pericyten worden geassocieerd met endotheelcellen en astrocytische endfeet in een structuur die bekend staat als de neurovasculaire eenheid (NVU). Brain capillary pericyte functie is niet volledig bekend. Pericyten zijn voorgesteld om betrokken te zijn bij capillaire ontwikkeling, regulering van endotheelbarrièredichtheid en trancytoseactiviteit, regulering van capillaire toon en om cruciale rollen te spelen in bepaalde hersenpathologieën.
Pericyten zijn een uitdaging om te onderzoeken in de intacte hersenen als gevolg van de moeilijkheden bij het visualiseren van processen in de hersenen parenchyma, evenals de nabijheid van de andere cellen van de NVU. Het huidige protocol beschrijft een methode voor isolatie en cultuur van primaire boviene hersenen capillaire pericyten en hun volgende gebruik in calcium imaging studies, waar effecten van agonisten die betrokken zijn bij de hersenen signalering en pathologieën kunnen worden onderzocht. Corticale capillaire fragmenten mogen zich aan de bodem van kweekkolven hechten en na 6 dagen zijn endotheelcellen en pericyten uit de haarvaten gegroeid. De endotheelcellen worden verwijderd door zachte trypsinisatie en pericyten worden gekweekt voor 5 extra dagen alvorens te overgaan.
Geïsoleerde pericyten worden gezaaid in 96-well kweekplaten en geladen met de calciumindicatorkleurstof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) om metingen van intracellulaire calciumniveaus in een opstelling van de plaatlezer mogelijk te maken. Als alternatief worden pericyten op coverslips gezaaid en in celkamers gemonteerd. Na het laden met de calciumindicator (Cal-520 AM) kan calcium live-imaging worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie op een excitatiegolflengte van 488 nm en emissiegolflengte van 510-520 nm.
De hier beschreven methode is gebruikt om de eerste intracellulaire calciummetingen te verkrijgen van primaire hersencapillaaire pericyten, waaruit blijkt dat pericyten worden gestimuleerd via ATP en in vitro kunnen samentrekken.

Runderhersenvaten haarvaten werden geïsoleerd uit vers hersenweefsel en figuur 1 presenteert de capillaire zaaien en cellulaire uitgroei over dagen en de daaropvolgende zuivering van pericyten. De haarvaten zijn op dag 1 volledig aan de kolf bevestigd en op dag 2 is het ontkiemen zichtbaar geworden(figuur 1, dag 2). Na 4 dagen is de cellulaire uitgroei zeer onderscheidend(figuur 1, dag 4a) en worden...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Hersencapillaire pericyten zijn essentiële spelers in de regulatie van bloed-hersenbarrière eigenschappen en bloedstroom. Dit protocol beschrijft hoe hersencapillaire pericyten kunnen worden geïsoleerd, gekweekt, gekenmerkt met betrekking tot celtype en toegepast voor onderzoeken van intracellulaire calcium signalering met fluorescerende sondes.

Cultuur van brain capillaire pericyten voor cytosolische calciummetingen en calciumbeeldvormingsstudies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Dit is een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren en kweken van primaire hersenen pericyten voor studie van intercellulaire calcium signalering. De verkregen celcultuur is een bijna homogene populatie van pericyten, en het is eenvoudig om de pericyten te laden voor calcium beeldvorming. De hier beschreven methoden moeten andere onderzoekers in het veld voorzien van sterke instrumenten voor het bestuderen van pericyte biologie, en intracellulaire signalering in pericyten in vitro.Begin met het ontdooien van een flesje haarvaten in een waterbad van 37 graden Celsius. Zodra de haarvaten ontdooid zijn, breng ze naar een centrifuge buis met 30 milliliter DMEM comp, en centrifugeren ze gedurende vijf minuten op 500 keer G.Dan, verwijder het medium uit de buis, en opnieuw opschorten het palet in 10 milliliter verse DMEM comp. Breng de suspensie over op een gecoate T-75-kolf en laat de haarvaten vier tot zes uur aan de bodem hechten in een 37 graden Celsius-incubator die wordt geleverd met 10% kooldioxide.Inspecteer na de incubatie de kolf onder een lichtmicroscoop. Fracties van haarvaten moeten nu worden bevestigd aan de onderkant van de kolf. Controleer ze op dag vier na het zaaien van de haarvaten onder de microscoop om ervoor te zorgen dat ze ongeveer 60 tot 70% samenvloeien.Aspirate het medium, en voorzichtig wassen van de cellen met PBS. Voeg twee milliliter ontdooide trypsine-EDTA toe en laat de kolf gedurende één tot drie minuten in de couveuse staan, de kolf regelmatig uitnemen en de celloslating met de microscoop observeren. Wanneer de endotheelcellen beginnen te ronden, tik je voorzichtig op de kolf om ze los te maken.Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop trypsinisatie door het toevoegen van 10 milliliter DMEM comp aan de kolf. Spoel de kolf een paar keer met het medium en aspiraat de endotheelcel suspensie, die nu kan worden gebruikt voor andere doeleinden. Voeg 10 milliliter DMEM comp toe aan de kolf en controleer deze onder de lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat de pericyten nog steeds aanwezig en aan de onderkant zijn bevestigd.Zet vervolgens de kolf terug in de couveuse om de met pericyten verrijkte cultuur te laten groeien. Om pericyten in gecoate 96-goed platen te zaaien, los te maken zoals beschreven in het tekstmanuscript. Aspirate het medium, zorg ervoor dat niet te verstoren de cel pellet, En opnieuw op te schorten de pellet in een milliliter verse DMEM comp.Tel de cellen met behulp van een telkamer en bereken vervolgens het suspensievolume dat aan elke put moet worden toegevoegd om 10.000 cellen per put te zaaien. Voeg de cel suspensie, voeg dan genoeg DMEM comp aan de cellen om een totaal volume van 200 microliters per goed te bereiken. Wanneer klaar om de pericyten te laden met Fura-2 AM calcium indicator kleurstof, neem de 96-put plaat met de cellen uit de incubator, en het medium aanzuigen uit de putten.Was de cellen twee keer met testbuffer en voeg 100 microliter laadoplossing toe aan elke put. Wikkel de plaat met aluminiumfolie om te voorkomen dat foto bleken, en uitbroed het gedurende 45 minuten met 30 RPM schudden bij kamertemperatuur. Na de incubatie, aspirate de laadbuffer, en was de cellen met de test buffer tweemaal.Voeg 100 microliter vers toe om de testbuffer te testen en laat de cellen 30 minuten inbroeden. Stel na de incubatie de temperatuur van de plaatlezer in op 37 graden Celsius en breng de 96-putplaat met cellen over naar de positie van de monsterplaat en plaats de reagensplaat met agonist op de reagensplaatpositie. Begin met het meten van de belasting van de cellen om gelijke belasting van Fura-2 AM in alle putten te garanderen, voer dan de metingen uit met excitatiefluorescentiegolflengte op 340 tot 380 nanometer, en de emissiegolflengte op 510 nanometer.Voeg 50 microliter agonist toe, met een snelheid van 150 microliter per seconde, van de reagensplaat tot elke put met cellen. Monteer een deksel slip in de celkamer, en draai het om lekken te voorkomen. Voeg DMEM comp en het berekende volume van celsuspensie toe aan elke kamer, voor een eindvolume van 500 microliter.Broed de celkamers op 37 graden Celsius en 10% kooldioxide gedurende zes dagen, of tot confluent. Zodra de cellen samenvloeiend zijn, neem de celkamers uit de incubator en aspirate het medium. Was de cellen twee keer met testbuffer en voeg 500 microliter laadbuffer toe aan elke kamer en broed ze vervolgens 45 minuten op kamertemperatuur uit.Na de incubatie, aspirate de laadbuffer, en was de cellen twee keer met testbuffer, voeg dan 500 microliter van verse testbuffer aan elke kamer en incuberen ze voor nog eens 30 minuten op kamertemperatuur, om decollete van de AM ester mogelijk te maken. Vervang de buffer door 500 microliters van verse testbuffer en ga verder met live beeldvorming bij een confocale microscoop. Monteer de celkamer zo voorzichtig mogelijk op het stadium van de microscoop om verstoring van de cellen te voorkomen.Stel de excitatiegolflengte in op 488 nanometer, emissie op 515 nanometer, twee minuten sequentiële beeldverwerving met vijf seconden intervallen, en een x, y beeldgrootte van 512 bij 512 pixels. Voeg 300 microliter van 100 millimolar ATP toe aan de celkamer en start beeldacquisitie. Dit protocol werd gebruikt om pericyten te zuiveren uit runderhersenhervatten.Cellulaire uitgroei van de gezaaide haarvaten werd afgebeeld in de loop van negen dagen. De haarvaten waren volledig bevestigd aan de fles op dag een, en door dag twee, endotheel ontkiemen was zichtbaar. Na vier dagen was de cellulaire uitgroei onderscheidend en werden de endotheelcellen verwijderd via trypsinisatie.Resten van de haarvaten waren aanwezig na de trypsinisatie, maar verdwenen in de volgende dagen uit de kolf. Na verwijdering van de endotheellaag mochten de pericyten tot de samenloop groeien. Op dag negen bereikten de pericyten ongeveer 80%-samenvloeiing en vormden eilanden.Toevoeging van ATP aan de Fura-2 geladen pericyten resulteerde in een toename van cytosolic calcium niveaus. De respons vond onmiddellijk plaats na toevoeging van ATP aan de pericyten, en daalde langzaam over de gemeten periode. De calciumrespons werd ook gemeten met real-time confocale beeldvorming.Baseline fluorescentie werd gemeten, vervolgens ATP werd toegevoegd op 64 seconden, en een sterke intracellulaire calcium respons was duidelijk. Kort daarna werd het cytosolische calcium gecompartimenteerd in de cellen en was een vermindering van het celgebied zichtbaar. Met 300 seconden, de cel gebied sterk verminderd, en de fluorescentie daalde bijna tot baseline niveaus.Deze methode is gebruikt om de eerste intracellulaire calciummetingen te verkrijgen van primaire hersencapillaaire pericyten, waaruit blijkt dat pericyten worden gestimuleerd via ATP en in staat zijn om in vitro samen te contracteren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...