Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Les auteurs souhaitent souligner le financement de l’initiative de recherche de la Fondation Lundbeck sur les barrières cérébrales et la livraison de médicaments (RIBBDD) et de la Fondation de la famille Simon Hougners.

1. Préparation de tampons et de solutions pour la culture cellulaire
<ol><li>Préparer la solution de stock de collagène en dissolvant 5 mg de collagène IV du placenta humain dans 50 mL de PBS pendant la nuit à 4 °C. Aliquot la solution de stock en portions de 5 mL et stocker à -20 °C.</li>
	<li>Préparer la solution de stock de fibronectine en dissolvant 5 mg de fibronectine dans 5 mL d’eau stérile pendant la nuit. Conserver les stocks de fibronectine en aliquots de 500 μL à -20 °C. Lors du dégel, ajou...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

Dans cette étude, nous avons présenté une méthode pour isoler les péricytes primaires des cerveaux bovins. Le protocole décrit permet la culture de ce type de cellule autrement plutôt inaccessible. La culture cellulaire obtenue par la suite était une population presque homogène de péricytes, avec peu ou pas de contamination avec des cellules endothéliales et des cellules gliales basées sur la morphologie cellulaire et l’expression protéique12. En outre, nous avons démontré une mé...

Les péricytes capillaires cérébraux, ainsi que les cellules endothéliales et les astrocytes, constituent le NVU1,2,3. Les cellules endothéliales, qui forment la base structurelle des capillaires, forment de longs tubes cylindriques d’un diamètre de 5 à 8 μm. Les cellules endothéliales sont sporadiquement couvertes de péricytes et entourées de saillies d’astrocytes; l’endfeet d’astrocyte.
La barrière céphalo-encéphalique (BBB), située aux capillaires cérébraux, est le principal site d’échange de nutriments, de gaz et de déchets entre le cerveau et le sang. Le BBB protège également le cerveau contre les neurotoxines endogènes et exogènes et sert de barrière pour la livraison d’un grand nombre de composés médicamenteux. La fonction barrière est un domaine d’intérêt, ainsi qu’un obstacle, pour les compagnies pharmaceutiques qui développent des médicaments du système nerveux central (SNC). Cela a suscité un grand intérêt dans l’étude des cellules de l’OND dans la culture4. Les astrocytes cérébraux et les cellules endothéliales ont été cultivés et caractérisés dans un certain nombre d’études, tandis que les études et les protocoles pour la culture péricyte sont clairsemés.
Les protocoles précédemment édités ont décrit la génération des cultures capillaires de péricyte capillaire de cerveau dans une certaine mesure, utilisant une gamme de différentes approches telles que l’immunopannage5,les médias à haut et à faible glucose6,le tri cellulairefluorescent-activé 7,centrifugation de gradient dedensité 8,etc. Bien que ces méthodes semblent suffisantes pour obtenir des cultures de péricytes, certaines prennent beaucoup de temps, coûtent cher et les péricytes obtenus pourraient ne pas être idéales en raison du nombre de passages de culture qui peuvent différencier les péricytes9. En outre, le potentiel des péricytes cultivés dans les études de signalisation in vitro a été assez inexploré jusqu’à présent.
Les travaux actuels portent sur la génération de cultures péricyte à partir de capillaires cérébraux bovins isolés et sur la configuration subséquente pour les mesures et les études d’imagerie des changements dans le calcium intracellulaire, un deuxième messager intracellulaire important. Nous décrivons brièvement l’isolement des capillaires de la matière grise corticale (pour plus de détails voir Helms et coll.10)et l’isolement et la culture des péricytes en monoculture pure sans contamination par des cellules endothéliales ou gliales. Nous fournissons ensuite un protocole pour l’ensemencement des péricytes dans des plaques de 96 puits et des protocoles de chargement pour la sonde de calcium Fura-2 AM. Enfin, nous montrons comment les péricytes peuvent être utilisés en imagerie confocale en temps réel dans les chambres de culture au microscope et décrivons les protocoles pour cela.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Les péricytes sont associés aux cellules endothéliales et à l’endfeet astrocytique dans une structure connue sous le nom d’unité neurovasculaire (NVU). La fonction capillaire de pericyte de cerveau n’est pas entièrement connue. Des péricytes ont été suggérés pour être impliqués dans le développement capillaire, la régulation de l’étanchéité endothéliale de barrière et de l’activité de trancytosis, la régulation du tonus capillaire et pour jouer des rôles cruciaux dans certaines pathologies de cerveau.
Les péricytes sont difficiles à étudier dans le cerveau intact en raison des difficultés à visualiser les processus dans le parenchyme cérébral, ainsi que la proximité avec les autres cellules de l’INN. Le présent protocole décrit une méthode d’isolement et de culture des péricytes capillaires capillaires primaires du cerveau bovin et leur utilisation suivante dans les études d’imagerie calcique, où les effets des agonistes impliqués dans la signalisation cérébrale et les pathologies peuvent être étudiés. Les fragments capillaires corticals sont autorisés à s’attacher au fond des flacons de culture et, après 6 jours, les cellules endothéliales et les péricytes sont sortis des fragments capillaires. Les cellules endothéliales sont enlevées par trypsinisation douce et les péricytes sont cultivés pendant 5 jours supplémentaires avant de passer.
Les péricytes isolés sont ensemencés dans des plaques de culture de 96 puits et chargés du colorant indicateur de calcium (Fura-2 acéoxyméthyle (AM)) pour permettre des mesures des niveaux intracellulaires de calcium dans une configuration de lecteur de plaque. Alternativement, les péricytes sont ensemencés sur des coverslips et montés dans des chambres cellulaires. Après chargement avec l’indicateur de calcium (Cal-520 AM), la formation image vivante de calcium peut être exécutée utilisant la microscopie confocale à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et la longueur d’onde d’émission de 510-520 nm.
La méthode décrite ici a été utilisée pour obtenir les premières mesures intracellulaires de calcium à partir de péricytes capillaires cérébraux primaires, démontrant que les péricytes sont stimulés par ATP et sont capables de se contracter in vitro.

Les capillaires du cerveau bovin ont été isolés du tissu cérébral frais et la figure 1 présente l’ensemencement capillaire et l’excroissance cellulaire pendant des jours et la purification subséquente des péricytes. Les capillaires sont entièrement fixés au flacon au jour 1 et le jour 2, la germination endothéliale est devenue visible (figure 1, jour 2). Après 4 jours, l’excroissance cellulaire est très distinc...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Les péricytes capillaires cérébraux sont des acteurs essentiels dans la régulation des propriétés de la barrière céphalo-cérébrale et du flux sanguin. Ce protocole décrit comment les péricytes capillaires cérébraux peuvent être isolés, cultivés, caractérisés en ce qui concerne le type de cellule et appliqués pour des investigations de signalisation intracellulaire de calcium avec des sondes fluorescentes.

Culture des péricytes capillaires cérébraux pour les mesures cytosoliques du calcium et les études d’imagerie calcique

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Il s’agit d’une méthode simple et efficace pour isoler et cultiver les péricytes primaires du cerveau pour l’étude de la signalisation intercellulaire du calcium. La culture cellulaire obtenue est une population presque homogène de péricytes, et il est facile de charger les péricytes pour l’imagerie calcique. Les méthodes décrites ici devraient fournir à d’autres chercheurs sur le terrain des outils solides pour étudier la biologie péricyte, et la signalisation intracellulaire chez les péricytes in vitro.Commencez par décongeler une fiole de capillaires dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Une fois que les capillaires ont décongelé, transférez-les dans un tube de centrifugeuse avec 30 millilitres de maquette DMEM, et centrifugez-les pendant cinq minutes à 500 fois G.Then, retirez le milieu du tube et suspendez la palette en 10 millilitres de maquette DMEM fraîche. Transférer la suspension dans un flacon T-75 enduit et permettre aux capillaires d’adhérer au fond pendant quatre à six heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius alimenté à 10 % de dioxyde de carbone.Après l’incubation, inspecter le flacon au microscope léger. Des fractions de capillaires doivent maintenant être fixées au fond du flacon. Le quatrième jour après l’ensemencement des capillaires, inspectez-les au microscope pour vous assurer qu’ils sont environ 60 à 70 % confluents.Aspirez le milieu et lavez doucement les cellules avec du PBS. Ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA décongelée, et laisser le flacon dans l’incubateur pendant une à trois minutes, en prenant le flacon fréquemment, et en observant le détachement cellulaire avec le microscope. Lorsque les cellules endothéliales commencent à arrondir, appuyez doucement sur le flacon pour les détacher.Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la trypsinisation en ajoutant 10 millilitres de maquette DMEM au flacon. Rincer le flacon à quelques reprises avec le milieu, et aspirer la suspension cellulaire endothéliale, qui peut maintenant être utilisé à d’autres fins. Ajouter 10 millilitres de maquette DMEM au flacon, et le vérifier au microscope léger pour s’assurer que les péricytes sont toujours présents et fixés au fond.Ensuite, remettre le flacon dans l’incubateur pour permettre à la culture enrichie de péricyte de croître. Pour ensemencer les péricytes dans des plaques enduites de 96 puits, détachez-les comme décrit dans le manuscrit du texte. Aspirez le milieu, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire, et re-suspendre la pastille dans un millilitre de maquette DMEM frais.Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage, puis calculez le volume de suspension qui doit être ajouté à chaque puits pour ensemencer 10 000 cellules par puits. Ajouter la suspension cellulaire, puis ajouter suffisamment de maquette DMEM aux cellules pour atteindre un volume total de 200 microlitres par puits. Lorsque vous êtes prêt à charger les péricytes avec du colorant indicateur de calcium Fura-2 AM, prenez la plaque de 96 puits avec les cellules hors de l’incubateur, et aspirez le milieu des puits.Lavez les cellules deux fois avec un tampon d’essai, et ajoutez 100 microlitres de solution de chargement à chaque puits. Enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment photo, et incubez-la pendant 45 minutes avec 30 RPM secouant à température ambiante. Après l’incubation, aspirer le tampon de chargement, et laver les cellules avec le tampon d’essai deux fois.Ajouter 100 microlitres de frais au tampon d’essai, et laisser les cellules à incuber pendant 30 minutes. Après l’incubation, réglez la température du lecteur de plaque à 37 degrés Celsius, et transférez la plaque de 96 puits avec des cellules à la position de la plaque de l’échantillon, puis placez la plaque du reagent avec un agoniste à la position de la plaque de réaccente. Commencez par mesurer la charge des cellules pour assurer une charge égale de Fura-2 AM dans tous les puits, puis effectuez les mesures avec la longueur d’onde de fluorescence d’excitation à 340 à 380 nanomètres, et la longueur d’onde d’émission à 510 nanomètres.Ajouter 50 microlitres d’agoniste, à une vitesse de 150 microlitres par seconde, de la plaque de réaccente à chaque puits avec des cellules. Montez un couvercle glisser dans la chambre cellulaire, et le serrer pour éviter les fuites. Ajoutez la maquette DMEM et le volume calculé de suspension cellulaire dans chaque chambre, pour un volume final de 500 microlitres.Incuber les chambres cellulaires à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone pendant six jours, ou jusqu’à ce qu’elles soient confluentes. Une fois que les cellules sont confluentes, sortez les chambres cellulaires de l’incubateur et aspirez le milieu. Lavez les cellules deux fois avec un tampon d’essai, et ajoutez 500 microlitres de tampon de chargement à chaque chambre, puis incubez-les à température ambiante pendant 45 minutes.Après l’incubation, aspirer le tampon de chargement, et laver les cellules deux fois avec tampon d’essai, puis ajouter 500 microlitres de tampon d’essai frais à chaque chambre et les incuber pendant encore 30 minutes à température ambiante, pour permettre le clivage de l’ester AM. Remplacez le tampon par 500 microlitres de tampon d’essai frais et procédez à l’imagerie en direct au microscope confocal. Montez la chambre cellulaire sur la scène du microscope aussi doucement que possible pour éviter la perturbation des cellules.Réglez la longueur d’onde excitation à 488 nanomètres, émission à 515 nanomètres, acquisition d’image séquentielle de deux minutes avec cinq intervalles de seconde, et une taille d’image x, y de 512 par 512 pixels. Ajouter 300 microlitres de 100 milli molaires ATP à la chambre cellulaire, et initier l’acquisition d’images. Ce protocole a été utilisé pour purifier les péricytes des capillaires cérébraux bovins.L’excroissance cellulaire des capillaires ensemencés a été photographiée au cours de neuf jours. Les capillaires étaient entièrement attachés au flacon au premier jour, et au deuxième jour, la germination endothéliale était visible. Après quatre jours, l’excroissance cellulaire était distinctive, et les cellules endothéliales ont été enlevées par trypsinization.Des restes des capillaires étaient présents après la trypsinisation, mais ont disparu du flacon dans les jours suivants. Après l’enlèvement de la couche endothéliale, les péricytes ont été autorisés à croître jusqu’à la confluence. Le neuvième jour, les péricytes atteignaient environ 80 % de confluent et formaient des îles.L’ajout de l’ATP aux péricytes chargés Fura-2 a entraîné une augmentation des niveaux cytosoliques de calcium. La réponse s’est produite immédiatement après l’ajout de l’ATP aux péricytes, et a diminué lentement au cours de la période mesurée. La réponse de calcium a également été mesurée avec la formation image confocale en temps réel.La fluorescence de ligne de base a été mesurée, puis l’ATP a été ajouté à 64 secondes, et une réponse intracellulaire forte de calcium était évidente. Peu de temps après, le calcium cytosolique compartimenté dans les cellules, et une réduction de la zone cellulaire était visible. Par 300 secondes, la zone cellulaire fortement réduite, et la fluorescence a diminué presque aux niveaux de ligne de base.Cette méthode a été utilisée pour obtenir les premières mesures intracellulaires du calcium à partir de péricytes capillaires cérébraux primaires, démontrant que les péricytes sont stimulés par l’ATP, et sont capables de se contracter in vitro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Imagerie fonctionnelle en calcium développement des réseaux corticaux

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recherche

Neurosciences

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcium péricyte cérébral et imagerie hémodynamique chez des souris transgéniques in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...