Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
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Die Autoren möchten die Förderung durch die Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) und die Simon Hougners Family Foundation würdigen.

1. Vorbereitung von Puffern und Lösungen für die Zellkultivierung
<ol><li>Bereiten Sie Kollagen-Stammlösung durch Auflösen von 5 mg Kollagen IV aus menschlicher Plazenta in 50 ml PBS über Nacht bei 4 °C. Aliquot die Lagerlösung in 5 ml Portionen und lagern bei -20 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Fibronectin-Stammlösung durch Auflösen von 5 mg Fibronectin in 5 ml sterilem Wasser über Nacht. Bewahren Sie die Fibronectin-Bestände in Aliquots von 500 l bei -20 °C auf. Wenn Sie auftauen, fügen Sie PBS zu einem En...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

In dieser Studie haben wir eine Methode vorgestellt, um primäre Pericyten von Rinderhirnen zu isolieren. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Kultur dieses ansonsten nicht zugänglichen Zelltyps. Die später erhaltene Zellkultur war eine nahezu homogene Population von Pericyten, mit wenig oder gar keiner Kontamination mit Endothelzellen und Gliazellen auf Der Grundlage von Zellmorphologie und Proteinexpression12. Darüber hinaus haben wir eine einfache und einfache Methode zum Beladen der P...

Hirnkapillarpericyten bilden zusammen mit Endothelzellen und Astrozyten die NVU1,2,3. Die Endothelzellen, die die strukturelle Basis der Kapillaren bilden, bilden lange zylindrische Rohre mit einem Durchmesser von 5-8 m. Die Endothelzellen sind sporadisch mit Pericyten bedeckt und von Vorsprüngen von Astrozyten umgeben; die Astrozyten-Endfüße.
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die sich an den Hirnkapillaren befindet, ist der Hauptort für den Austausch von Nährstoffen, Gasen und Abfallprodukten zwischen Gehirn und Blut. Die BBB schützt auch das Gehirn vor endogene und exogene Neurotoxine und dient als Barriere für die Lieferung einer großen Anzahl von Wirkstoffverbindungen. Die Barrierefunktion ist ein Schwerpunktbereich und ein Hindernis für Pharmaunternehmen, die Medikamente des Zentralnervensystems (ZNS) entwickeln. Dies hat ein großes Interesse an der Untersuchung der Zellen der NVU in Kultur4geweckt. Hirnastrozyten und Endothelzellen wurden in einer Reihe von Studien kultiviert und charakterisiert, während die Studien und Protokolle für die Pericytkultur spärlich sind.
Zuvor veröffentlichte Protokolle haben die Erzeugung von hirnkapillaren Pericytenkulturen bis zu einem gewissen Grad beschrieben, mit einer Reihe von verschiedenen Ansätzen wie Immunpanning5, High- und Low-Glucose-Medien6, fluoreszierend-aktivierte Zellsortierung7, Gradient zentrifugation8, etc. Obwohl diese Methoden ausreichen, um Kulturen von Pericyten zu erhalten, sind einige zeitaufwändig, kostenteuer und die erhaltenen Pericyten sind aufgrund der Anzahl der Kulturpassagen, die die Pericyten dedifferenzieren können, möglicherweise nichtideal. Darüber hinaus ist das Potenzial kultivierter Pericyten in In-vitro-Signalisierungsstudien bisher ziemlich unerforscht.
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Erzeugung von Pericytkulturen aus isolierten Rinderhirnkapillaren und die anschließende Einrichtung von Messungen und bildgebenden Studien von Veränderungen des intrazellulären Kalziums, einem wichtigen intrazellulären zweiten Botenstoff. Wir beschreiben kurz die Isolierung von Kapillaren von kortikaler Graumaterie (Details siehe Helms et al.10) und die Isolation und Kultur von Pericyten in reiner Monokultur ohne Kontamination mit endothelialen oder glialen Zellen. Wir liefern dann ein Protokoll für die Aussaat von Pericyten in 96-Well-Platten und Ladeprotokolle für die Kalziumsonde Fura-2 AM. Schließlich zeigen wir, wie Pericyte in Echtzeit konfokale Bildgebung in Mikroskopkulturkammern verwendet werden können und beschreiben die Protokolle dafür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Pericyte werden mit Endothelzellen und astrozytischen Endfüßen in einer Struktur assoziiert, die als neurovaskuläre Einheit (NVU) bekannt ist. Gehirn Kapillarperizytenfunktion ist nicht vollständig bekannt. Pericyten wurden vorgeschlagen, an der Kapillarentwicklung, der Regulierung der Endothelbarrieredichtheit und Tranzytoseaktivität, der Regulierung des Kapillartons beteiligt zu sein und bei bestimmten Hirnpathologien eine entscheidende Rolle zu spielen.
Perizyten sind eine Herausforderung, im intakten Gehirn aufgrund der Schwierigkeiten bei der Visualisierung von Prozessen im Gehirn Parenchym zu untersuchen, sowie die Nähe zu den anderen Zellen der NVU. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultur von primären Rinderhirnkapillarperizyten und deren anschließende Verwendung in Kalzium-Bildgebungsstudien, bei denen Die Wirkung von Agonisten, die an der Signalisierung des Gehirns und Pathologien beteiligt sind, untersucht werden kann. Kortikale Kapillarfragmente dürfen sich an den Boden von Kulturkolben anheften und nach 6 Tagen sind Endothelzellen und Pericyten aus den Kapillarfragmenten herausgewachsen. Die Endothelzellen werden durch sanfte Trypsinisierung entfernt und Pericyten werden für 5 weitere Tage vor dem Passieren kultiviert.
Isolierte Pericyte werden in 96-Well-Kulturplatten gesät und mit dem Calciumindikatorfarbstoff (Fura-2 Acetoxymethyl (AM)) beladen, um Messungen des intrazellulären Kalziumspiegels in einem Plattenleser-Setup zu ermöglichen. Alternativ werden Pericyte auf Coverlips gesät und in Zellkammern montiert. Nach der Belastung mit dem Kalziumindikator (Cal-520 AM) kann die Calcium-Live-Imaging mittels konfokaler Mikroskopie bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 510-520 nm durchgeführt werden.
Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um die ersten intrazellulären Kalziummessungen aus primären Hirnkapillarperizyten zu erhalten, die zeigen, dass Pericyte über ATP stimuliert werden und sich in vitro zusammenziehen können.

Rinderhirnkapillaren wurden aus frischem Hirngewebe isoliert und Abbildung 1 stellt die Kapillarensaat und das zelluläre Auswachsen über Tage und die anschließende Reinigung von Pericyten dar. Die Kapillaren sind an Tag 1 vollständig am Kolben befestigt und am Tag 2 ist die Endothelsprossen sichtbar geworden (Abbildung 1, Tag 2). Nach 4 Tagen ist das zelluläre Auswachsen sehr markant(Abbildung 1...

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Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Gehirn Kapillarpericyten sind wesentliche Akteure bei der Regulierung der Blut - Hirn-Schranke Eigenschaften und Blutfluss. Dieses Protokoll beschreibt, wie Kapillarperizyten des Gehirns isoliert, kultiviert, in Bezug auf den Zelltyp charakterisiert und für Untersuchungen der intrazellulären Calciumsignalisierung mit fluoreszierenden Sonden angewendet werden können.

Kultur der Hirnkapillarpericyten für zytosolische Kalziummessungen und Calcium-Imaging-Studien

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Dies ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären Gehirnperizyten zur Untersuchung der interzellulären Kalziumsignalisierung. Die erhaltene Zellkultur ist eine fast homogene Population von Pericyten, und es ist einfach, die Pericyte für die Kalzium-Bildgebung zu laden. Die hier beschriebenen Methoden sollten anderen Forschern auf diesem Gebiet starke Werkzeuge für die Untersuchung der Pericytbiologie und die intrazelluläre Signalisierung in Pericyten in vitro zur Verfügung stellen.Beginnen Sie mit dem Auftauen einer Durchstechflasche mit Kapillaren in einem 37 Grad Celsius Wasserbad. Sobald die Kapillaren aufgetaut sind, übertragen Sie sie in ein Zentrifugenrohr mit 30 Milliliter DMEM comp, und zentrifugieren Sie sie für fünf Minuten bei 500 mal G.Dann entfernen Sie das Medium aus dem Rohr, und setzen Sie die Palette in 10 Milliliter frische DMEM comp wieder auf. Übertragen Sie die Suspension auf einen beschichteten T-75-Kolben und lassen Sie die Kapillaren vier bis sechs Stunden lang in einem 37 Grad Celsius-Inkubator mit 10 % Kohlendioxid am Boden haften.Nach der Inkubation den Kolben unter einem Lichtmikroskop inspizieren. An der Unterseite des Kolbens sollten nun Kapillarfraktionen befestigt werden. Am vierten Tag nach dem Aussaat der Kapillaren, inspizieren Sie sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie etwa 60 bis 70% konfluent sind.Das Medium ansaugen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen. Fügen Sie zwei Milliliter aufgetauttrypsin-EDTA hinzu und lassen Sie den Kolben für ein bis drei Minuten im Inkubator, nehmen Sie den Kolben häufig heraus und beobachten Sie die Zellablösung mit dem Mikroskop. Wenn die Endothelzellen beginnen, sich aufzurunden, tippen Sie vorsichtig auf den Kolben, um sie zu lösen.Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie dem Kolben 10 Milliliter DMEM comp hinzufügen. Spülen Sie den Kolben ein paar Mal mit dem Medium, und aspirieren Sie die Endothelzellsuspension, die jetzt für andere Zwecke verwendet werden kann. Fügen Sie 10 Milliliter DMEM comp in den Kolben, und überprüfen Sie es unter dem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Pericyten noch vorhanden sind und am Boden befestigt sind.Dann legen Sie den Kolben zurück in den Brutkasten, damit die pericyte-angereicherte Kultur wachsen kann. Um Pericyten in beschichtete 96-Well-Platten zu säen, lösen Sie sie, wie im Textmanuskript beschrieben. Aspirieren Sie das Medium, achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören, Und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischer DMEM comp wieder auf.Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und berechnen Sie dann das Suspensionsvolumen, das jedem Brunnen zueinemmuss, um 10 000 Zellen pro Bohrkörper auszusäen. Fügen Sie die Zellsuspension hinzu, und fügen Sie dann genügend DMEM comp zu den Zellen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 Mikroliter pro Brunnen zu erreichen. Wenn Sie bereit sind, die Pericyten mit Fura-2 AM Calciumindikatorfarbstoff zu laden, nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium aus den Brunnen.Waschen Sie die Zellen zweimal mit Assay-Puffer, und fügen Sie 100 Mikroliter Ladelösung zu jedem Brunnen. Wickeln Sie die Platte mit Tinfoil, um Fotobleichungen zu vermeiden, und inkubieren Sie sie für 45 Minuten mit 30 Umdrehungen bei Raumtemperatur schütteln. Nach der Inkubation den Ladepuffer ansaugen und die Zellen zweimal mit dem Assaypuffer waschen.Fügen Sie 100 Mikroliter frisch in den Testpuffer und lassen Sie die Zellen für 30 Minuten brüten. Stellen Sie nach der Inkubation die Temperatur des Plattenlesers auf 37 Grad Celsius ein und übertragen Sie die 96-Well-Platte mit Zellen in die Probenplattenposition, und legen Sie dann die Reagenzplatte mit Agonist an die Reagenzplattenposition. Beginnen Sie mit der Messung der Belastung der Zellen, um eine gleichmäßige Belastung von Fura-2 AM in allen Brunnen zu gewährleisten, und führen Sie dann die Messungen mit einer Anregungsfluoreszenzwellenlänge von 340 bis 380 Nanometern und der Emissionswellenlänge bei 510 Nanometern durch.Fügen Sie 50 Mikroliter Agonist, mit einer Geschwindigkeit von 150 Mikroliter pro Sekunde, von der Reagenzplatte zu jedem Brunnen mit Zellen. Montieren Sie einen Deckelrutsch in die Zellkammer und ziehen Sie ihn fest, um Leckagen zu vermeiden. Fügen Sie DMEM comp und das berechnete Volumen der Zellsuspension in jede Kammer, für ein Endvolumen von 500 Mikroliter.Inkubieren Sie die Zellkammern bei 37 Grad Celsius und 10% Kohlendioxid für sechs Tage, oder bis konfluent. Sobald die Zellen konfluent sind, nehmen Sie die Zellkammern aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Assay-Puffer, und fügen Sie 500 Mikroliter Ladepuffer zu jeder Kammer, dann inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 45 Minuten.Nach der Inkubation den Ladepuffer ansaugen und die Zellen zweimal mit Assaypuffer waschen, dann 500 Mikroliter frischen Assaypuffer in jede Kammer geben und sie weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um eine Spaltung des AM-Esters zu ermöglichen. Ersetzen Sie den Puffer durch 500 Mikroliter frischen Assaypuffer, und fahren Sie mit der Live-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop fort. Montieren Sie die Zellkammer auf der Bühne des Mikroskops so schonend wie möglich, um Störungen der Zellen zu vermeiden.Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 488 Nanometer, die Emission auf 515 Nanometer, die zweiminütige sequenzielle Bildaufnahme mit fünf Sekundenintervallen und eine x,y Bildgröße von 512 x 512 Pixeln ein. Fügen Sie 300 Mikroliter 100 Millimolar ATP in die Zellkammer und initiieren Sie die Bildaufnahme. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Pericyten von Rinderhirnkapillaren zu reinigen.Das zelluläre Auswachsen aus den gesäten Kapillaren wurde im Laufe von neun Tagen abgebildet. Die Kapillaren waren am ersten Tag vollständig an der Flasche befestigt, und am zweiten Tag war endotheliale Keimung sichtbar. Nach vier Tagen war das zelluläre Auswachsen unverwechselbar, und die Endothelzellen wurden durch Trypsinisierung entfernt.Reste der Kapillaren waren nach der Trypsinisierung vorhanden, verschwanden aber in den folgenden Tagen aus dem Kolben. Nach dem Entfernen der Endothelschicht durften die Pericyten bis zur Zusammenflusswachsen. Am neunten Tag erreichten die Pericyten etwa 80% der Konfluenz und bildeten Inseln.Die Zugabe von ATP zu den Fura-2-belasteten Pericyten führte zu einem Anstieg des zytosolischen Kalziumspiegels. Die Reaktion trat unmittelbar nach Zugabe von ATP zu den Pericyten auf und ging über den gemessenen Zeitraum langsam zurück. Die Kalzium-Antwort wurde auch mit konfokaler Echtzeit-Bildgebung gemessen.Die Grundfluoreszenz wurde gemessen, dann wurde ATP bei 64 Sekunden zugegeben, und eine starke intrazelluläre Kalziumreaktion war offensichtlich. Bald darauf wurde das zytosolische Kalzium in den Zellen unterteilt, und eine Verringerung des Zellbereichs war sichtbar. Um 300 Sekunden reduzierte sich die Zellfläche stark, und die Fluoreszenz sank fast auf das Ausgangsniveau.Diese Methode wurde verwendet, um die ersten intrazellulären Kalziummessungen aus primären Hirnkapillarpericyten zu erhalten, was zeigt, dass Pericyte über ATP stimuliert werden und sich in vitro zusammenziehen können.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...