Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere i finanziamenti dell'iniziativa di ricerca della Lundbeck Foundation sulle barriere cerebrali e la somministrazione di farmaci (RIBBDD) e della Simon Hougners Family Foundation.

1. Preparazione di tamponi e soluzioni per la coltivazione cellulare
<ol><li>Preparare la soluzione di stock di collagene sciogliendo 5 mg di collagene IV dalla placenta umana in 50 mL di PBS durante la notte a 4 °C. Aliquota la soluzione stock in porzioni da 5 mL e conservare a -20 °C.</li>
	<li>Preparare la soluzione di stock di fibronectina sciogliendo 5 mg di fibronectina in 5 mL di acqua sterile durante la notte. Conservare le scorte di fibronectina in aliquote di 500 μL a -20 °C. Durante lo scongelamento, a...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

In questo studio, abbiamo presentato un metodo per isolare i periciti primari dal cervello dei bovini. Il protocollo descritto consente impostazioni cultura di questo tipo di cella altrimenti piuttosto inaccessibile. La successiva coltura cellulare ottenuta era una popolazione quasi omogenea di periciti, con poca o nessuna contaminazione con cellule endoteliali e cellule gliali basate sulla morfologia cellulare e sull'espressione proteica12. Inoltre, abbiamo dimostrato un metodo semplice e diretto...

I periciti capillari cerebrali, insieme alle cellule endoteliali e agli astrociti, costituiscono l'NVU1,2,3. Le cellule endoteliali, che formano la base strutturale dei capillari, formano lunghi tubi cilindrici con un diametro di 5-8 μm. Le cellule endoteliali sono sporadicamente coperte di periciti e circondate da sporgenze da astrociti; l'endfeet astrocita.
La barriera ematico-encefalica (BBB), situata ai capillari cerebrali, è il sito principale per lo scambio di nutrienti, gas e prodotti di scarto tra il cervello e il sangue. La BBB protegge anche il cervello dalle neurotossine endogene ed esogene e funge da barriera per la consegna di un gran numero di composti farmacologici. La funzione barriera è un'area di interesse, oltre che un ostacolo, per le aziende farmaceutiche che sviluppano farmaci del sistema nervoso centrale (SNC). Ciò ha suscitato un grande interesse nello studio delle cellule dell'NVU nella coltura4. Gli astrociti cerebrali e le cellule endoteliali sono stati coltivati e caratterizzati in una serie di studi, mentre gli studi e i protocolli per la coltura dei periciti sono scarsi.
Protocolli pubblicati in precedenza hanno descritto in una certa misura la generazione di colture di periciti capillari cerebrali, utilizzando una serie di approcci diversi come l'immunopanning5,i mezzi ad alto e basso glucosio6,lo smistamento cellulare attivato fluorescente7,la centrifugazione del gradiente didensità 8,ecc. Sebbene questi metodi sembrino sufficienti per ottenere colture di periciti, alcuni richiedono molto tempo, costano caro e i periciti ottenuti potrebbero non essere ideali a causa del numero di passaggi di coltura che possono dis differenziare i periciti9. Inoltre, il potenziale dei periciti coltivati negli studi di segnalazione in vitro è stato finora abbastanza inesplorato.
Il presente lavoro si concentra sulla generazione di colture di periciti da capillari cerebrali bovini isolati e sulla successiva configurazione per misurazioni e studi di imaging dei cambiamenti nel calcio intracellulare, un importante secondo messaggero intracellulare. Descriviamo brevemente l'isolamento dei capillari dalla materia grigia corticale (per i dettagli vedi Helms et al.10) e l'isolamento e la coltura dei periciti in pura monocoltura senza contaminazione con cellule endoteliali o gliali. Forniamo quindi un protocollo per la semina di periciti in piastre da 96 porcili e protocolli di carico per la sonda di calcio Fura-2 AM. Infine, mostriamo come i periciti possono essere utilizzati nell'imaging confocale in tempo reale nelle camere di coltura del microscopio e descriviamo i protocolli per questo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

I periciti sono associati alle cellule endoteliali e ai piedi finali astrocitici in una struttura nota come unità neurovascolare (NVU). La funzione del pericita capillare cerebrale non è completamente nota. I periciti sono stati suggeriti per essere coinvolti nello sviluppo capillare, nella regolazione della tenuta barriera endoteliale e nell'attività della trancytosis, nella regolazione del tono capillare e nel svolgere ruoli cruciali in alcune patologie cerebrali.
I periciti sono difficili da indagare nel cervello intatto a causa delle difficoltà nel visualizzare i processi nel parenchima cerebrale, così come la vicinanza alle altre cellule dell'NVU. Il presente protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura dei periciti capillari del cervello bovino primario e il loro successivo utilizzo negli studi di imaging del calcio, in cui possono essere studiati gli effetti degli agonisti coinvolti nella segnalazione cerebrale e nelle patologie. I frammenti capillari corticali sono autorizzati ad attaccarsi al fondo dei contenitori di coltura e, dopo 6 giorni, cellule endoteliali e periciti sono cresciuti dai frammenti capillari. Le cellule endoteliali vengono rimosse mediante tripsinazione delicata e i periciti vengono coltivati per altri 5 giorni prima della passaging.
I periciti isolati vengono seminati in piastre di coltura da 96 porcili e caricati con il colorante indicatore del calcio (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) per consentire misurazioni dei livelli di calcio intracellulare in una configurazione del lettore di lastre. In alternativa, i periciti vengono seminati su coverlips e montati in camere cellulari. Dopo il caricamento con l'indicatore del calcio (Cal-520 AM), l'imaging vivo di calcio può essere eseguito utilizzando la microscopia confocale a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 510-520 nm.
Il metodo qui descritto è stato utilizzato per ottenere le prime misurazioni intracellulari del calcio dai periciti capillari cerebrali primari, dimostrando che i periciti sono stimolati tramite ATP e sono in grado di contrarsi in vitro.

I capillari cerebrali bovini sono stati isolati dal tessuto cerebrale fresco e la figura 1 presenta la semina capillare e la crescita cellulare nel corso dei giorni e la successiva purificazione dei periciti. I capillari sono completamente attaccati al pallone al giorno 1 e il giorno 2 la germogliazione endoteliale è diventata visibile(Figura 1, giorno 2). Dopo 4 giorni, la crescita cellulare è altamente distintiva<strong class...

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Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

I periciti capillari cerebrali sono attori essenziali nella regolazione delle proprietà della barriera ematica-encefalica e del flusso sanguigno. Questo protocollo descrive come i periciti capillari cerebrali possono essere isolati, coltivati, caratterizzati rispetto al tipo di cellula e applicati per le indagini sulla segnalazione intracellulare del calcio con sonde fluorescenti.

Coltura di periciti capillari cerebrali per misurazioni citosoliche del calcio e studi di imaging del calcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Questo è un metodo semplice ed efficace per isolare e coltivare i periciti cerebrali primari per lo studio della segnalazione intercellulare del calcio. La coltura cellulare ottenuta è una popolazione quasi omogenea di periciti, ed è semplice caricare i periciti per l'imaging del calcio. I metodi qui descritti dovrebbero fornire ad altri ricercatori del settore strumenti forti per studiare la biologia dei periciti e la segnalazione intracellulare nei periciti in vitro.Inizia scongelando una fiala di capillari in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Una volta che i capillari si sono scongelati, trasferirli in un tubo di centrifuga con 30 millilitri di dmem comp e centrifugarli per cinque minuti a 500 volte G.Quindi, rimuovere il mezzo dal tubo e sospendere nuovamente la tavolozza in 10 millilitri di dmem comp fresco. Trasferire la sospensione in un pallone T-75 rivestito e consentire ai capillari di aderire al fondo per quattro o sei ore in un incubatore di 37 gradi Celsius fornito con 10% di anidride carbonica.Dopo l'incubazione, ispezionare il pallone al microscopio leggero. Le frazioni di capillari dovrebbero ora essere attaccate al fondo del pallone. Il quarto giorno dopo la semina dei capillari, ispezionarli al microscopio per assicurarsi che siano circa il 60-70% confluenti.Aspirare il mezzo e lavare delicatamente le cellule con PBS. Aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA scongelata e lasciare il pallone nell'incubatrice per uno o tre minuti, estraendo frequentemente il pallone e osservando il distacco cellulare con il microscopio. Quando le cellule endoteliali iniziano a arrotondare per l'alto, toccare delicatamente il pallone per staccarle.Quando le cellule si sono staccate, interrompere la tripsinizzazione aggiungendo 10 millilitri di dmem comp al pallone. Sciacquare il pallone alcune volte con il mezzo e aspirare la sospensione cellulare endoteliale, che ora può essere utilizzata per altri scopi. Aggiungere 10 millilitri di dmem comp al pallone e controllarlo al microscopio luminoso per assicurarsi che i periciti siano ancora presenti e attaccati al fondo.Quindi, rimetti il pallone nell'incubatrice per consentire alla cultura arricchita di periciti di crescere. Per seminare i periciti in lastre rivestite da 96 pozzi, staccarli come descritto nel manoscritto testuale. Aspirare il mezzo, facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare, e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di dmem comp fresco.Contare le celle utilizzando una camera di conteggio, quindi calcolare il volume di sospensione che deve essere aggiunto a ciascun pozzo per seminare 10.000 cellule per pozzo. Aggiungere la sospensione cellulare, quindi aggiungere abbastanza composizione DMEM alle celle per ottenere un volume totale di 200 microlitri per pozzo. Quando sei pronto a caricare i periciti con il colorante indicatore di calcio Fura-2 AM, prendi la piastra da 96 po 'con le cellule fuori dall'incubatrice e aspira il mezzo dai pozzi.Lavare le cellule due volte con tampone di dosaggio e aggiungere 100 microlitri di soluzione di carico ad ogni pozzo. Avvolgere il piatto con tinfoil per evitare lo sbiancamento fotografico e incubarlo per 45 minuti con 30 giri/min che tremano a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aspirare il tampone di carico e lavare le cellule con il tampone di dosaggio due volte.Aggiungere 100 microlitri di fresco al tampone di dosaggio e lasciare che le cellule incubano per 30 minuti. Dopo l'incubazione, impostare la temperatura del lettore di piastre a 37 gradi Celsius e trasferire la piastra da 96 po 'con le celle nella posizione della piastra del campione, quindi posizionare la piastra del reagente con agonista nella posizione della piastra del reagente. Iniziare misurando il carico delle cellule per garantire lo stesso carico di Fura-2 AM in tutti i pozzi, quindi eseguire le misurazioni con lunghezza d'onda di fluorescenza di eccitazione a 340-380 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 510 nanometri.Aggiungere 50 microlitri di agonista, ad una velocità di 150 microlitri al secondo, dalla piastra del reagente a ogni pozzo con le cellule. Montare un coperchio scivolare nella camera cellulare e stringerlo per evitare perdite. Aggiungere dmem comp e il volume calcolato di sospensione cellulare in ogni camera, per un volume finale di 500 microlitri.Incubare le camere cellulari a 37 gradi Celsius e 10% di anidride carbonica per sei giorni o fino a quando non sono confluenti. Una volta che le cellule sono confluenti, togliere le camere cellulari dall'incubatrice e aspirare il mezzo. Lavare le cellule due volte con tampone di dosaggio e aggiungere 500 microlitri di tampone di carico a ogni camera, quindi incubarle a temperatura ambiente per 45 minuti.Dopo l'incubazione, aspirare il tampone di carico e lavare le cellule due volte con tampone di dosaggio, quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di dosaggio fresco a ogni camera e incubarli per altri 30 minuti a temperatura ambiente, per consentire la scissione dell'estere AM. Sostituire il buffer con 500 microlitri di tampone di dosaggio fresco e procedere con l'imaging dal vivo al microscopio confocale. Montare la camera cellulare sul palco del microscopio nel modo più delicato possibile per evitare disturbi delle cellule.Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nanometri, l'emissione a 515 nanometri, l'acquisizione sequenziale di immagini di due minuti con intervalli di cinque secondi e una dimensione dell'immagine x, y di 512 x 512 pixel. Aggiungere 300 microlitri di ATP da 100 millimolari alla camera cellulare e avviare l'acquisizione di immagini. Questo protocollo è stato utilizzato per purificare i periciti dai capillari cerebrali bovini.La crescita cellulare dai capillari seminati è stata immagine nel corso di nove giorni. I capillari erano completamente attaccati al pallone al primo giorno, e al secondo giorno, la germinazione endoteliale era visibile. Dopo quattro giorni, la crescita cellulare era distintiva e le cellule endoteliali venivano rimosse attraverso la trippsinizzazione.I resti dei capillari erano presenti dopo la tripinazione, ma scomparvero dal pallone nei giorni successivi. Dopo la rimozione dello strato endoteliale, ai periciti fu permesso di crescere fino alla confluenza. Il nono giorno, i periciti raggiunsero circa l'80% di confluenza e formarono isole.L'aggiunta di ATP ai periciti carichi di Fura-2 ha comportato un aumento dei livelli di calcio citosolico. La risposta si è verificata immediatamente dopo l'aggiunta di ATP ai periciti e è diminuita lentamente nel periodo di tempo misurato. La risposta al calcio è stata misurata anche con l'imaging confocale in tempo reale.È stata misurata la fluorescenza di base, poi l'ATP è stato aggiunto a 64 secondi e una forte risposta intracellulare al calcio è stata evidente. Poco dopo, il calcio citosolico compartimentato nelle cellule, e una riduzione dell'area cellulare era visibile. Di 300 secondi, l'area cellulare si ridusse pesantemente, e la fluorescenza declinò quasi ai livelli di base.Questo metodo è stato utilizzato per ottenere le prime misurazioni del calcio intracellulare dai periciti capillari cerebrali primari, dimostrando che i periciti sono stimolati tramite ATP e sono in grado di contrarsi in vitro.

Research

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcio dei periciti cerebrali e imaging emodinamico nei topi transgenici in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...