Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
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저자는 뇌 장벽과 약물 전달에 룬드벡 재단 연구 이니셔티브에서 자금을 인정하고자 (RIBBDD) 사이먼 Hougners 가족 재단.

1. 세포 배양을 위한 완충제 및 솔루션 준비
<ol><li>4°C에서 하룻밤 사이에 50mL의 PBS에서 인간 태반으로부터 콜라겐 IV 5 mg을 용해시켜 콜라겐 스톡 솔루션을 준비한다. 주식 용액을 5mL 부분으로 알리쿼트하고 -20 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>하룻밤 동안 멸균 수의 5 mL에 섬유 네틴 5 mg을 용해하여 섬유 네틴 재고 용액을 준비합니다. -20°C에서 500 μL의 알리쿼트에 섬유네틴 주식을 저장합니다. 해동?...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

이 연구에서는, 우리는 소 두뇌에서 1 차적인 pericytes를 격리하는 방법을 제시했습니다. 설명된 프로토콜은 그렇지 않으면 접근할 수 없는 세포 유형의 배양을 허용합니다. 이후에 얻은 세포 배양은 세포 형태학 및 단백질발현(12)에기초한 내피 세포 및 신경교 세포를 가진 거의 또는 전혀 오염없이 거의 또는 전혀 오염되지 않은 pericytes의 거의 균질한 집단이었다. 또한, 우리는 의...

뇌 모세관 과다구는 내피 세포 및 성상 세포와 함께 NVU1,2,3을구성한다. 모세 혈관의 구조적 기초를 형성하는 내피 세포는 직경 5-8 μm의 긴 원통형 튜브를 형성합니다. 내피 세포는 산발적으로 pericytes로 덮여 있으며 성상세포에서 돌출로 둘러싸여 있습니다. 성상 세포 끝피트.
뇌 모세 혈관에 위치한 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 뇌와 혈액 사이의 영양소, 가스 및 폐기물의 교환을위한 주요 사이트입니다. BBB는 또한 내인성 및 외인성 신경 독소로부터 두뇌를 보호하고 많은 수의 약물 화합물의 납품을 위한 장벽 역할을 합니다. 장벽 기능은 중추 신경계 (CNS) 의약품을 개발하는 제약 회사를위한 초점 영역뿐만 아니라 장애물입니다. 이것은 문화4에서NVU의 세포를 조사하는 데 큰 관심을 불러 일으켰습니다. 뇌 성상세포와 내피 세포는 여러 연구에서 배양되고 특징지어지지만, 백혈구 배양을 위한 연구와 프로토콜은 희소합니다.
이전에 발표된 프로토콜은 면역파닝5,고혈당 및 저혈당 미디어6,형광 활성화 세포 분류7,밀도 그라데이션 원심 분리8등과 같은 다양한 접근법을 사용하여 어느 정도 뇌 모세관 백혈구 배양의 생성을 기술했다. 이러한 방법은 pericytes의 배양을 얻기에 충분해 보이지만, 일부는 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들고 얻은 pericytes는 pericytes9를구별할 수 있는 문화 구절의 수로 인해 이상적이지 않을 수 있습니다. 더욱이, 체외 신호 연구에서 배양 pericytes의 잠재력은 지금까지 상당히 미개척 되었습니다.
본 연구는 고립된 소 뇌 모세혈관으로부터의 회낭 배양 의 생성과 중요한 세포내 두 번째 메신저인 세포내 칼슘의 변화에 대한 측정 및 이미징 연구를 위한 후속 설정에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 피질 회색 물질에서 모세 혈관의 격리 (세부 사항은 Helms외. 10참조) 및 내피 또는 신경교 세포에 오염없이 순수한 단일 문화에서 pericytes의 격리 및 문화를 간단히 설명합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 회낭을 파종하고 칼슘 프로브 Fura-2 AM에 대한 적재 프로토콜을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 pericytes가 현미경 배양 챔버에 있는 실시간 공초점 화상 진찰에서 어떻게 이용될 수 있는지 보여주고 이것을 위한 프로토콜을 기술합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Pericytes는 신경 혈관 단위 (NVU)로 알려져 있는 구조물에 있는 내피 세포 및 성상체 끝피트와 연관됩니다. 뇌 모세관 회낭 기능은 완전히 알려져 있지 않다. Pericytes는 모세관 발달, 내피 장벽 압박감 및 trancytosis 활동의 규제, 모세관 톤의 조절 및 특정 뇌 병리에 중요한 역할을 하는 경우에 관여하기 위하여 건의되었습니다.
Pericytes는 뇌 빈맥의 과정을 시각화하는 데 어려움뿐만 아니라 NVU의 다른 세포와 가까운 근접성으로 인해 손상되지 않은 뇌에서 조사하기가 어렵습니다. 본 프로토콜은 1 차적인 소 두뇌 모세관 pericytes의 격리 그리고 문화를 위한 방법 및 두뇌 신호 및 병리학에 관련되었던 작용제의 효력이 조사될 수 있는 칼슘 화상 진찰 연구 결과에 있는 그들의 다음 사용을 기술합니다. 피질 모세관 단편은 배양 플라스크의 바닥에 부착할 수 있으며, 6일 후에 내피 세포와 회낭이 모세관 단편에서 자생하였다. 내피 세포는 부드러운 트립시화에 의해 제거되고 pericytes는 통과하기 전에 5 추가 일 동안 배양됩니다.
분리된 pericytes는 96웰 배양 판에서 씨를 뿌리고 칼슘 표시기 염료(Fura-2 아세톡시메틸(AM)로 적재되어 플레이트 판독기 설정에서 세포내 칼슘 수치를 측정할 수 있습니다. 또는, pericytes는 커버립에 시드되고 세포 챔버에 장착됩니다. 칼슘 표시기 (Cal-520 AM)로 적재 한 후, 칼슘 라이브 이미징은 488 nm의 내분 파장 및 510-520 nm의 방출 파장에서 공초점 현미경 검사를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법은 1차 뇌 모세관 pericytes로부터 최초의 세포내 칼슘 측정을 얻기 위해 사용되어 왔으며, 이는 pericytes가 ATP를 통해 자극되고 체외에서 수축할 수 있음을 보여줍니다.

소 뇌 모세 혈관신선한 두뇌 조직에서 격리 되었고 도 1 모세 혈관 종자 및 세포 배분 및 백혈구의 후속 정화를 선물. 모세혈관은 1일째에 플라스크에 완전히 부착되어 있으며, 2일째내피발아가 눈에 띄게되었다(도 1,2일). 4일 후, 세포 외성장은 매우 특이하며(도1,일 4a) 내피 세포는 기술된 프로토콜에 따라...

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Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

뇌 모세관 pericytes는 혈액-뇌 장벽 속성 및 혈류의 조절에 필수적인 선수. 이 프로토콜은 뇌 모세관 pericytes가 세포 유형에 대하여 특징지어지고 형광 프로브를 가진 세포내 칼슘 신호의 조사를 위해 적용되는 방법을 설명합니다.

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

이것은 세포 간 칼슘 신호의 연구를 위한 1 차적인 두뇌 pericytes를 격리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 방법입니다. 얻은 세포 배양은 pericytes의 거의 균질한 인구이고, 칼슘 화상 진찰을 위한 pericytes를 로드하는 것은 간단합니다. 여기에 설명된 방법은 pericyte 생물학을 공부하기 위한 강한 공구를 필드에 있는 그밖 연구원을 제공해야 합니다, 그리고 체외에 있는 pericytes에 있는 세포내 신호.37도 의 수조에서 모세 혈관 의 유리병을 해동하여 시작합니다. 모세혈관이 해동되면 DMEM 콤프 30밀리리터가 있는 원심분리기로 옮기고, 500회 G.Then에서 5분간 원심분리하고, 튜브에서 배지를 제거하고, 신선한 DMEM 컴포지션10밀리리터에서 팔레트를 다시 일시 중단합니다. 서스펜션을 코팅된 T-75 플라스크로 옮기고, 모세혈관이 10%의 이산화탄소를 공급하는 섭씨 37도에서 4~6시간 동안 바닥에 부착할 수 있도록 한다.인큐베이션 후, 가벼운 현미경으로 플라스크를 검사합니다. 모세혈관의 분수는 이제 플라스크 의 바닥에 부착되어야 합니다. 모세 혈관을 시드 한 후 4 일째에 현미경으로 검사하여 약 60 ~ 70 %의 컨할 수 있는지 확인하십시오.매체를 흡인하고 PBS로 셀을 부드럽게 씻으십시오. 해동 트립신-EDTA의 2 밀리리터를 추가하고, 1~ 3분 동안 인큐베이터에 플라스크를 두고 플라스크를 자주 꺼내 현미경으로 세포 분리를 관찰합니다. 내피 세포가 반올림하기 시작하면 플라스크를 부드럽게 눌러 분리합니다.세포가 분리되면 플라스크에 DMEM 컴프 10 밀리리터를 추가하여 트립시화를 중지하십시오. 플라스크를 배지로 몇 번 플러시하고, 현재 다른 목적을 위해 사용될 수 있는 내피 세포 현탁액을 흡인한다. 플라스크에 DMEM 컴포지션 10밀리리터를 추가하고, 백혈구가 여전히 존재하고 바닥에 부착되어 있는지 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 확인하십시오.그런 다음 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 백혈구가 풍부한 문화가 성장할 수 있도록 합니다. 옷자위가 코팅된 96웰 플레이트에 씨앗을 뿌리려면 텍스트 원고에 설명된 대로 분리합니다. 매체를 흡인시키고, 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고, 신선한 DMEM 컴포지션의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단한다.카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계산한 다음 각 웰에 잘 첨가해야 하는 현탁액의 부피를 잘 10, 000 세포에 계산합니다. 셀 서스펜션을 추가한 다음 세포에 충분한 DMEM 콤프를 추가하여 우물당 200 마이크로리터의 총 부피를 달성합니다. 후라-2 AM 칼슘 표시기 염료로 pericytes를 로드할 준비가 되면, 인큐베이터에서 세포를 사용하여 96웰 플레이트를 꺼내 우물에서 배지를 흡인하십시오.분석 버퍼로 셀을 두 번 세척하고 각 웰에 100 마이크로 리터의 적재 용액을 추가합니다. 사진 표백을 피하기 위해 tinfoil로 접시를 감싸고 실온에서 30 RPM이 흔들리면서 45 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 적재 버퍼를 흡인하고, 분석 버퍼로 셀을 두 번 세척한다.분석 버퍼에 신선한 100 마이크로 리터를 추가하고 30 분 동안 배양하기 위해 세포를 둡니다. 인큐베이션 후 플레이트 판독기의 온도를 섭씨 37도로 설정하고, 세포와 함께 96웰 플레이트를 샘플 플레이트 위치로 옮춘 다음 시약 판 위치에 고약성으로 시약 플레이트를 배치합니다. 모든 우물에서 Fura-2 AM의 동등한 하중을 보장하기 위해 세포의 하중을 측정한 다음 340 ~380 나노미터의 발산 형광 파장 및 510 나노미터에서 방출 파장을 사용하여 측정을 수행하십시오.시약 플레이트에서 세포와 잘 각 잘에 초당 150 마이크로 리터의 속도로, 고뇌의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 커버를 셀 챔버에 넣고 누수를 피하기 위해 덮을 수 있습니다. DMEM 컴포지션과 계산된 셀 현탁액을 각 챔버에 추가하여 500 마이크로리터의 최종 부피를 위해 추가합니다.세포실을 섭씨 37도, 이산화탄소 10%에서 6일 간 또는 컨할 때까지 배양합니다. 세포가 컨실루션되면 세포 챔버를 인큐베이터에서 꺼내 배지를 흡인하십시오. 분석 버퍼로 셀을 두 번 세척하고 각 챔버에 500 마이크로 리터의 적재 버퍼를 추가 한 다음 실온에서 45 분 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, 적재 버퍼를 흡습하고, 분석 버퍼로 세포를 두 번 세척한 다음, 각 챔버에 500 마이크로리터의 신선한 분석 버퍼를 추가하고 AM 에스테르의 분열을 허용하기 위해 실온에서 또 다른 30 분 동안 배양합니다. 버퍼를 500 마이크로리터의 신선한 분석 버퍼로 대체하고 공초점 현미경으로 라이브 이미징을 진행합니다. 세포의 교란을 피하기 위해 현미경의 단계에 세포 챔버를 가능한 한 부드럽게 마운트하십시오.488 나노미터에서 발산 파장을 설정하고, 515 나노미터에서 방출하고, 5초 간격으로 2분 순차적 이미지 수집, x, y 이미지 크기 512 x 512 픽셀을 설정합니다. 셀 챔버에 100 밀리머 ATP의 300 마이크로 리터를 추가하고 이미지 수집을 시작합니다. 이 프로토콜은 소 뇌 모세 혈관에서 pericytes를 정화하는 데 사용되었다.종자 모세 혈관에서 세포 밖으로 성장 9 일 동안 이미지되었다. 모세혈관은 첫날 플라스크에 완전히 부착되었고, 둘째 날부터 내피 발아가 보였다. 4 일 후, 세포 아웃 성장 특유의, 그리고 내 피 세포를 트립시화를 통해 제거 되었다.모세혈관의 잔해는 트립시화 후 존재했지만, 다음 날 플라스크에서 사라졌다. 내피층을 제거한 후, 회칙은 수렴성까지 자랄 수 있었다. 9일째에는 약 80%의 수렴률을 기록하며 섬을 형성했다.후라-2 하중 pericytes에 ATP를 첨가하면 세포칼슘 수치가 증가했습니다. 응답은 PERICYtes에 ATP를 첨가한 직후 발생했으며 측정된 기간 동안 천천히 감소했습니다. 칼슘 반응은 또한 실시간 공초점 화상 진찰로 측정되었습니다.기준형 형광을 측정한 다음 ATP가 64초에 추가되었고, 세포내 칼슘 반응이 뚜렷하게 나타났다. 얼마 지나지 않아 세포에서 구획화된 세포균칼슘이 보였고, 세포 영역의 감소가 보였다. 300초까지 세포 영역이 크게 감소했고 형광은 기준선 수준으로 거의 감소했습니다.이 방법은 1 차뇌 모세관 pericytes에서 첫 번째 세포 내 칼슘 측정을 얻기 위해 사용되어, pericytes가 ATP를 통해 자극되고, 체외에서 계약할 수 있다는 것을 보여줍니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...