Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne finansiering fra Lundbeck Foundation Research-initiativet on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) og Simon Hougners Family Foundation.

1. Utarbeidelse av buffere og løsninger for celle culturing
<ol><li>Forbered kollagen lagerløsning ved å oppløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS over natten ved 4 °C. Aliquot lagerløsningen i 5 ml porsjoner og lagre ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered fibronectin lageroppløsning ved å oppløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vann over natten. Oppbevar fibronectinbestandene i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Når du tiner, legg PBS til et endelig volum på 50 ml for å klargjøre arbeidsløsningen...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

I denne studien har vi presentert en metode for å isolere primære pericytter fra storfehjerner. Den beskrevne protokollen tillater kultur av denne ellers ganske utilgjengelig celletype. Den senere oppnådde cellekulturen var en nesten homogen populasjon av pericytter, med liten eller ingen forurensning med endotelceller og glialceller basert på cellemorfologi og proteinuttrykk12. Videre demonstrerte vi en enkel og grei metode for å laste pericytene med kalsiumfargestoffer for Ca2 +-...

Hjernekapillære pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, utgjør NVU1,2,3. Endotelcellene, som danner det strukturelle grunnlaget for kapillærene, danner lange sylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellene er sporadisk dekket med pericytter og omgitt av fremspring fra astrocytter; astrocyttendehennetten.
Blod-hjernebarrieren (BBB), som ligger ved hjernens kapillærer, er hovedstedet for utveksling av næringsstoffer, gasser og avfallsprodukter mellom hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mot endogene og eksogene nevrotoksiner og fungerer som en barriere for levering av et stort antall legemiddelforbindelser. Barrierefunksjonen er et fokusområde, samt et hinder, for legemiddelselskaper som utvikler sentralnervesystemet (CNS) medisiner. Dette har ansporet en stor interesse i å undersøke cellene i NVU i kultur4. Hjerneastrocytter og endotelceller har blitt dyrket og karakterisert i en rekke studier, mens studier og protokoller for perikyttkultur er sparsomme.
Tidligere publiserte protokoller har beskrevet generering av hjernekapillærpericyte kulturer til en viss grad, ved hjelp av en rekke forskjellige tilnærminger som immunopanning5,høy- og lav-glukose media6, fluorescerende-aktivert celle sortering7, tetthet gradient sentrifugering8, etc. Selv om disse metodene synes tilstrekkelig til å oppnå kulturer av pericytes, noen er tidkrevende, koster dyrt og pericytes oppnådd kan ikke være ideelt på grunn av antall kulturpassasjer som kan de-differensiere pericytes9. Videre har potensialet for kultiverte pericytter i in vitro signalstudier vært ganske uutforsket til nå.
Det nåværende arbeidet fokuserer på generering av pericytekulturer fra isolerte storfe hjernekapillærer og det påfølgende oppsettet for målinger og bildestudier av endringer i intracellulær kalsium, en viktig intracellulær andre budbringer. Vi beskriver kort isolasjonen av kapillærer fra kortikal grå materie (for detaljer se Helms et al.10) og isolasjon og kultur av pericytes i ren monokultur uten forurensning med endotel- eller glialceller. Vi gir deretter en protokoll for såing av pericytes i 96-brønnsplater og lasteprotokoller for kalsiumsonden Fura-2 AM. Til slutt viser vi hvordan pericytes kan brukes i sanntid confocal imaging i mikroskop kulturkamre og beskrive protokollene for dette.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytisk endfeet i en struktur kjent som den nevrovaskulære enheten (NVU). Hjernekapillær perikyttfunksjon er ikke fullt kjent. Pericytes har blitt foreslått å være involvert i kapillær utvikling, regulering av endotelbarriere tetthet og trancytose aktivitet, regulering av kapillær tone og å spille avgjørende roller i visse hjernepatologier.
Pericytes er utfordrende å undersøke i den intakte hjernen på grunn av vanskelighetene med å visualisere prosesser i hjernen parenchyma, samt nærhet til de andre cellene i NVU. Den nåværende protokollen beskriver en metode for isolasjon og kultur av primære storfe hjernekapillær pericytes og deres følgende bruk i kalsiumavbildningsstudier, hvor effekter av agonister involvert i hjernesignalering og patologier kan undersøkes. Kortikale kapillære fragmenter får lov til å feste seg til bunnen av kulturflasker, og etter 6 dager har endotelceller og pericytes vokst ut fra kapillære fragmenter. Endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering og pericytter dyrkes i 5 ekstra dager før passaging.
Isolerte pericytter er seeded i 96-brønns kulturplater og lastet med kalsiumindikatorfargestoff (Fura-2 acetoksymetyl (AM)) for å tillate målinger av intracellulære kalsiumnivåer i et plateleseroppsett. Alternativt er pericytes seeded på dekkglass og montert i cellekamre. Etter lasting med kalsiumindikatoren (Cal-520 AM), kan kalsium live-imaging utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved en eksitasjon bølgelengde på 488 nm og utslipp bølgelengde på 510-520 nm.
Metoden som er beskrevet her har blitt brukt til å oppnå de første intracellulære kalsiummålingene fra primære hjernekapillære perikytter, som viser at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til å trekke in vitro sammen.

Storfe hjernekapillærer ble isolert fra friskt hjernevev og figur 1 presenterer kapillær såing og cellulær utvekst over dager og påfølgende rensing av pericytes. Kapillærene er helt festet til kolben på dag 1, og på dag 2 har endotelspirering blitt synlig (figur 1, dag 2). Etter 4 dager er cellulær utvekst svært særegen (figur 1, dag 4a) og endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering s...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Hjernekapillære pericytes er essensielle aktører i reguleringen av blod-hjerne barriere egenskaper og blodstrøm. Denne protokollen beskriver hvordan hjernekapillære pericytes kan isoleres, kultiveres, karakteriseres med hensyn til celletype og brukes til undersøkelser av intracellulær kalsiumsignalering med fluorescerende sonder.

Kultur av hjernekapillære pericytter for cytosoliske kalsiummålinger og kalsiumavbildningsstudier

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Dette er en enkel og effektiv metode for å isolere og kultivere primære hjernepericytes for studier av intercellulær kalsiumsignalering. Den oppnådde cellekulturen er en nesten homogen populasjon av pericytes, og det er enkelt å laste pericytene for kalsiumavbildning. Metodene som er beskrevet her bør gi andre forskere på feltet sterke verktøy for å studere perikyttbiologi, og intracellulær signalering i pericytes in vitro.Begynn med å tine ett hetteglass med kapillærer i et 37 graders Celsius vannbad. Når kapillærene har tint, overføre dem til en sentrifuge rør med 30 milliliter DMEM comp, og sentrifuge dem i fem minutter på 500 ganger G.Deretter fjerne mediet fra røret, og re-suspendere paletten i 10 milliliter av fersk DMEM comp. Overfør suspensjonen til en belagt T-75 kolbe, og la kapillærene holde seg til bunnen i fire til seks timer i en 37 grader Celsius inkubator levert med 10% karbondioksid.Etter inkubasjonen, inspiser kolben under et lett mikroskop. Fraksjoner av kapillærer skal nå festes til bunnen av kolben. På dag fire etter såing av kapillærene, inspiser dem under mikroskopet for å sikre at de er ca. 60 til 70 % samløpet.Aspirer mediet, og vask forsiktig cellene med PBS. Tilsett to milliliter tint trypsin-EDTA, og la kolben stå i inkubatoren i ett til tre minutter, ta ut kolben ofte og observere celleavløsning med mikroskopet. Når endotelcellene begynner å runde opp, trykker du forsiktig på kolben for å løsne dem.Når cellene har løsnet, stopp trypsinisering ved å legge til 10 milliliter DMEM comp til kolben. Skyll kolben et par ganger med mediet, og aspirer endotelcellefjæringen, som nå kan brukes til andre formål. Tilsett 10 milliliter DMEM comp i kolben, og kontroller det under det lette mikroskopet for å sikre at pericytene fortsatt er tilstede og festet til bunnen.Deretter legger du kolben tilbake i inkubatoren for å la den pericyteberikede kulturen vokse. For å så pericytes i belagte 96-brønnsplater, løsne dem som beskrevet i tekstmanuskriptet. Aspirer mediet, ta vare på ikke å forstyrre cellepellet, Og re-suspendere pellet i en milliliter fersk DMEM comp.Tell cellene ved hjelp av et tellekammer, og beregn deretter volumet av suspensjon som skal legges til hver brønn til frø 10.000 celler per brønn. Legg til cellesuspensjonen, og legg deretter til nok DMEM comp til cellene for å oppnå et totalt volum på 200 mikroliter per brønn. Når du er klar til å laste pericytene med Fura-2 AM kalsiumindikatorfargestoff, ta 96-brønnplaten med cellene ut av inkubatoren, og aspirer mediet fra brønnene.Vask cellene to ganger med analysebuffer, og tilsett 100 mikroliter med lasteløsning til hver brønn. Pakk platen med tinfoil for å unngå bleking av bilder, og inkuber den i 45 minutter med 30 RPM risting ved romtemperatur. Etter inkubasjonen, aspirer lastebufferen, og vask cellene med analysebufferen to ganger.Tilsett 100 mikroliter frisk til analysebuffer, og la cellene inkubere i 30 minutter. Etter inkubasjonen setter du temperaturen på plateleseren til 37 grader Celsius, og overfører 96-brønnplaten med celler til prøveplateposisjonen, og plasser deretter reagensplaten med agonist ved reagensplateposisjonen. Start med å måle lasting av cellene for å sikre lik lasting av Fura-2 AM i alle brønner, og utfør deretter målingene med eksitasjonsfluorescensbølgelengde på 340 til 380 nanometer, og utslippsbølgelengden på 510 nanometer.Tilsett 50 mikroliter agonist, med en hastighet på 150 mikroliter per sekund, fra reagensplaten til hver brønn med celler. Monter et deksel som glir inn i cellekammeret, og stram det for å unngå lekkasjer. Legg DMEM comp og beregnet volum av celle suspensjon i hvert kammer, for et endelig volum på 500 mikroliter.Inkuber cellekamrene ved 37 grader Celsius og 10% karbondioksid i seks dager, eller til samløpet. Når cellene er samløpet, ta cellekamrene ut av inkubatoren, og aspirer mediet. Vask cellene to ganger med analysebuffer, og tilsett 500 mikroliter med lastbuffer til hvert kammer, og inkuber dem deretter ved romtemperatur i 45 minutter.Etter inkubasjonen, aspirer lastebufferen, og vask cellene to ganger med analysebuffer, og legg deretter til 500 mikroliter med fersk analysebuffer til hvert kammer og inkuber dem i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur, for å tillate spaltning av AM-esteren. Bytt bufferen med 500 mikroliter frisk analysebuffer, og fortsett med levende bildebehandling ved et konfokalt mikroskop. Monter cellekammeret på mikroskopets stadium så forsiktig som mulig for å unngå forstyrrelser av cellene.Sett eksitasjonsbølgelengden på 488 nanometer, utslipp på 515 nanometer, to minutters sekvensiell bildeoppkjøp med fem sekunders intervaller og en x, y bildestørrelse på 512 x 512 piksler. Legg til 300 mikroliter på 100 millimolar ATP til cellekammeret, og initier bildeoppkjøp. Denne protokollen ble brukt til å rense pericytes fra storfe hjernekapillærer.Cellulær utvekst fra de seedede kapillærene ble avbildet i løpet av ni dager. Kapillærene var fullt festet til kolben på dag én, og ved dag to var endotelspirering synlig. Etter fire dager var den cellulære utveksten særegen, og endotelcellene ble fjernet via trypsinisering.Rester av kapillærene var tilstede etter trypsiniseringen, men forsvant fra kolben i de følgende dagene. Etter fjerning av endotellaget fikk pericyttene lov til å vokse til samløpet. På dag ni nådde pericytene ca 80% samløpet, og dannet øyer.Tilsetning av ATP til Fura-2 lastet pericytes resulterte i en økning i cytosoliske kalsiumnivåer. Responsen skjedde umiddelbart etter tilsetning av ATP til pericytene, og falt sakte over den målte tidsperioden. Kalsiumresponsen ble også målt med konfokal avbildning i sanntid.Baseline fluorescens ble målt, deretter ble ATP lagt til på 64 sekunder, og en sterk intracellulær kalsiumrespons var tydelig. Kort tid etter ble det cytosoliske kalsiumet compartmentalized i cellene, og en reduksjon i celleområdet var synlig. Med 300 sekunder reduserte celleområdet kraftig, og fluorescensen falt nesten til baselinenivåer.Denne metoden har blitt brukt til å oppnå de første intracellulære kalsiummålingene fra primære hjernekapillære pericytter, som viser at pericytter stimuleres via ATP, og er i stand til å trekke in vitro sammen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Funksjonell Kalsium Imaging in Developing kortikal Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Utarbeidelse av Akutt subventricular sone Slices for kalsium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablasjon av Neuronal innbyggere med en to-fotonet Laser og sin vurdering ved hjelp av kalsium Imaging og atferdsmessige opptak i sebrafisk larver

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalsium Imaging for å visualisere hjernen Svar å endokrine signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjernen pericyte kalsium og hemodynamisk avbildning i transgene mus i Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotoksisk viral injeksjon og gradient-indeks linse implantasjon for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellulær avbildning av nevronal kalsiumhåndtering in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Kalsiumavbildning i mus Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...