Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
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Os autores desejam reconhecer o financiamento da iniciativa de Pesquisa da Fundação Lundbeck sobre Barreiras Cerebrais e Entrega de Drogas (RIBBDD) e da Fundação Da Família Simon Hougners.

1. Preparação de buffers e soluções para cultivo de células
<ol><li>Prepare a solução de estoque de colágeno dissolvendo 5 mg de colágeno IV da placenta humana em 50 mL de PBS durante a noite a 4 °C. Aliquot a solução de estoque em porções de 5 mL e armazene a -20 °C.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque de fibronectina dissolvendo 5 mg de fibronectina em 5 mL de água estéril durante a noite. Armazene os estoques de fibronectina em alíquotas de 500 μL a -20 °C. Ao descongelar, adicione PBS a u...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

Neste estudo, apresentamos um método para isolar pericítos primários de cérebros bovinos. O protocolo descrito permite a cultura desse tipo de célula bastante inacessível. A cultura celular posteriormente obtida foi uma população quase homogênea de pericítos, com pouca ou nenhuma contaminação com células endoteliais e células gliais baseadas na morfologia celular e expressão proteica12. Além disso, demonstramos um método simples e simples para carregar os pericítos com corantes d...

Pericytes capilares cerebrais, juntamente com células endoteliais e astrócitos, constituem a NVU1,2,3. As células endoteliais, que formam a base estrutural dos capilares, formam tubos cilíndricos longos com diâmetro de 5-8 μm. As células endoteliais são esporadicamente cobertas com pericitos e cercadas por saliências de astrócitos; o astrócito endfee.
A barreira hemencefálica (BBB), situada nos capilares cerebrais, é o principal local de troca de nutrientes, gases e resíduos entre o cérebro e o sangue. O BBB também protege o cérebro de neurotoxinas endógenas e exógenas e serve como uma barreira para a entrega de um grande número de compostos medicamentosos. A função barreira é uma área de foco, bem como um obstáculo, para as empresas farmacêuticas que desenvolvem medicamentos do Sistema Nervoso Central (SNC). Isso estimulou um grande interesse em investigar as células da NVU na cultura4. Astrócitos cerebrais e células endoteliais foram cultivados e caracterizados em uma série de estudos, enquanto os estudos e protocolos para a cultura pericíte são escassos.
Protocolos publicados anteriormente descreveram a geração de culturas de pericíte capilares cerebrais até certo ponto, usando uma gama de diferentes abordagens, como imunopanning5,mídia de alta e baixa glicose6,classificação celular ativada por fluorescentes7,centrifugação gradiente de densidade8,etc. Embora esses métodos pareçam suficientes para obter culturas de pericítos, alguns são demorados, custam caro e os pericítos obtidos podem não ser ideais devido ao número de passagens culturais que podem deseleg diferenciar os pericítes9. Além disso, o potencial de pericítos cultivados em estudos de sinalização in vitro tem sido bastante inexplorado até agora.
O presente trabalho se concentra na geração de culturas pericíte de capilares cerebrais bovinos isolados e na configuração subsequente para medições e estudos de imagem de alterações no cálcio intracelular, um importante mensageiro intracelular. Descrevemos brevemente o isolamento dos capilares da matéria cinzenta cortical (para detalhes ver Helms et al.10) e o isolamento e cultura de pericílitos em monocultura pura sem contaminação com células endoteliais ou gliais. Em seguida, fornecemos um protocolo para semeadura de pericítos em placas de 96 poços e protocolos de carregamento para a sonda de cálcio Fura-2 AM. Finalmente, mostramos como os pericítos podem ser usados em imagens confocal em tempo real em câmaras de cultura de microscópio e descrevemos os protocolos para isso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Os pericítos estão associados com células endoteliais e pés de extremidade astrócito em uma estrutura conhecida como unidade neurovascular (NVU). A função de pericyte capilar cerebral não é totalmente conhecida. Os pericítos têm sido sugeridos para estarem envolvidos no desenvolvimento capilar, regulação do aperto da barreira endotelial e da atividade de trancostose, regulação do tom capilar e para desempenhar papéis cruciais em certas patologias cerebrais.
Os pericítos são desafiadores para investigar no cérebro intacto devido às dificuldades em visualizar processos no parenchyma cerebral, bem como a proximidade com as outras células da NVU. O presente protocolo descreve um método de isolamento e cultura de pericytes capilares cerebrais bovinos primários e seu uso seguinte em estudos de imagem de cálcio, onde os efeitos de agonistas envolvidos na sinalização cerebral e patologias podem ser investigados. Fragmentos capilares corticais são permitidos a anexar-se ao fundo dos frascos de cultura e, após 6 dias, células endoteliais e pericítos cresceram a partir dos fragmentos capilares. As células endoteliais são removidas por trippsinização suave e os pericítos são cultivados por 5 dias adicionais antes da passagem.
Pericítos isolados são semeados em placas de cultura de 96 poços e carregados com o corante indicador de cálcio (Fura-2 acetoximethyl (AM)) para permitir medidas de níveis intracelulares de cálcio em uma configuração de leitor de placas. Alternativamente, os pericílitos são semeados em tampas e montados em câmaras de células. Após o carregamento com o indicador de cálcio (Cal-520 AM), a imagem viva de cálcio pode ser realizada usando microscopia confocal em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 510-520 nm.
O método descrito aqui tem sido usado para obter as primeiras medidas intracelulares de cálcio a partir de pericytes capilares cerebrais primários, demonstrando que os pericítos são estimulados via ATP e são capazes de contrair in vitro.

Capilares cerebrais bovinos foram isolados do tecido cerebral fresco e a Figura 1 apresenta a semeadura capilar e o crescimento celular ao longo dos dias e posterior purificação de pericítos. Os capilares estão totalmente ligados ao frasco no primeiro dia e no dia 2 o broto endotelial tornou-se visível(Figura 1, dia 2). Após 4 dias, o crescimento celular é altamente distinto(Figura 1, dia 4a) ...

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Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes capilares cerebrais são atores essenciais na regulação das propriedades da barreira hemencefálica e do fluxo sanguíneo. Este protocolo descreve como pericytos capilares cerebrais podem ser isolados, cultivados, caracterizados em relação ao tipo celular e aplicados para investigações de sinalização intracelular de cálcio com sondas fluorescentes.

Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Este é um método simples e eficaz para isolar e culminar pericítos cerebrais primários para estudo de sinalização intercelular de cálcio. A cultura celular obtida é uma população quase homogênea de pericítos, e é simples carregar os pericílitos para imagem de cálcio. Os métodos descritos aqui devem fornecer a outros pesquisadores do campo ferramentas fortes para estudar biologia pericíte, e sinalização intracelular em pericílitos in vitro.Comece descongelando um frasco de capilares em um banho de água de 37 graus Celsius. Uma vez que os capilares tenham descongelado, transfira-os para um tubo de centrífugas com 30 mililitros de DMEM comp, e centrífugue-os por cinco minutos a 500 vezes G.Em seguida, remova o meio do tubo e suspenda novamente a paleta em 10 mililitros de DMEM comp fresco. Transfira a suspensão para um frasco T-75 revestido e permita que os capilares aderam ao fundo por quatro a seis horas em uma incubadora de 37 graus Celsius fornecida com dióxido de carbono de 10%.Após a incubação, inspecione o frasco sob um microscópio leve. Frações de capilares devem agora ser anexadas ao fundo do frasco. No quarto dia após a semeadura dos capilares, inspecione-os sob o microscópio para garantir que eles sejam aproximadamente 60 a 70% confluentes.Aspire o meio e lave suavemente as células com PBS. Adicione dois mililitros de trippsin-EDTA descongelados, e deixe o frasco na incubadora por um a três minutos, tirando o frasco com frequência, e observando o descolamento celular com o microscópio. Quando as células endoteliais começarem a arredondar, bata suavemente no frasco para desprezá-las.Quando as células se separarem, pare a trippsinização adicionando 10 mililitros de DMEM comp ao frasco. Lave o frasco algumas vezes com o meio, e aspire a suspensão da célula endotelial, que agora pode ser usada para outros fins. Adicione 10 mililitros de DMEM comp ao frasco e verifique-o sob o microscópio de luz para garantir que os pericítos ainda estejam presentes e ligados ao fundo.Então, coloque o frasco de volta na incubadora para permitir que a cultura enriquecida com pericítos cresça. Para semear pericítes em placas revestidas de 96 poços, desvinculá-los como descrito no manuscrito do texto. Aspire o meio, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e suspenda a pelota em um mililitro de DMEM comp fresco.Conte as células usando uma câmara de contagem, em seguida, calcule o volume de suspensão que deve ser adicionado a cada poço a sementes 10.000 células por poço. Adicione a suspensão celular e adicione DMEM comp suficiente às células para alcançar um volume total de 200 microliters por poço. Quando estiver pronto para carregar os pericítes com corante indicador de cálcio Fura-2 AM, retire a placa de 96 poços com as células da incubadora e aspire o meio dos poços.Lave as células duas vezes com tampão de ensaio e adicione 100 microliters de solução de carregamento a cada poço. Enrole a placa com papel alumínio para evitar branqueamento fotográfico e incuba-o por 45 minutos com 30 RPM tremendo à temperatura ambiente. Após a incubação, aspire o tampão de carga e lave as células com o tampão de ensaio duas vezes.Adicione 100 microliters frescos ao tampão de ensaio, e deixe as células incubarem por 30 minutos. Após a incubação, ajuste a temperatura do leitor de placas para 37 graus Celsius e transfira a placa de 96 poços com células para a posição da placa de amostra, em seguida, coloque a placa de reagente com agonista na posição da placa de reagente. Comece medindo o carregamento das células para garantir o carregamento igual de Fura-2 AM em todos os poços, em seguida, realize as medições com comprimento de onda de fluorescência excitação em 340 a 380 nanômetros, e o comprimento de onda de emissão em 510 nanômetros.Adicione 50 microliters de agonista, a uma velocidade de 150 microliters por segundo, desde a placa de reagente até cada poço com células. Coloque uma tampa na câmara da cela e aperte-a para evitar vazamentos. Adicione o DMEM comp e o volume calculado de suspensão celular em cada câmara, para um volume final de 500 microliters.Incubar as câmaras celulares a 37 graus Celsius e 10% dióxido de carbono por seis dias, ou até confluente. Uma vez que as células são confluentes, tire as câmaras celulares da incubadora e aspire o meio. Lave as células duas vezes com tampão de ensaio e adicione 500 microliters de tampão de carga a cada câmara e, em seguida, incuba-as à temperatura ambiente por 45 minutos.Após a incubação, aspire o tampão de carga e lave as células duas vezes com tampão de ensaio, em seguida, adicione 500 microliters de tampão de ensaio fresco em cada câmara e incuba-as por mais 30 minutos à temperatura ambiente, para permitir o decote do éster AM. Substitua o buffer por 500 microlitros de tampão de ensaio fresco e prossiga com imagens ao vivo em um microscópio confocal. Monte a câmara celular no palco do microscópio o mais suavemente possível para evitar a perturbação das células.Ajuste o comprimento de onda de excitação em 488 nanômetros, emissão em 515 nanômetros, aquisição de imagem sequencial de dois minutos com cinco intervalos de segundo, e um tamanho de imagem x, y de 512 por 512 pixels. Adicione 300 microliters de 100 mililitros ATP à câmara celular e inicie a aquisição de imagens. Este protocolo foi usado para purificar pericílitos de capilares cerebrais bovinos.O crescimento celular dos capilares semeados foi imageado ao longo de nove dias. Os capilares estavam totalmente ligados ao frasco no primeiro dia, e no segundo dia, o broto endotelial era visível. Após quatro dias, a expansão celular foi distinta, e as células endoteliais foram removidas através da trippsinização.Remanescentes dos capilares estavam presentes após a trippsinização, mas desapareceram do frasco nos dias seguintes. Após a remoção da camada endotelial, os pericítos foram autorizados a crescer até a confluência. No nono dia, os pericílitos atingiram aproximadamente 80% de confluência, e formaram ilhas.A adição de ATP aos pericytes carregados fura-2 resultou em um aumento nos níveis de cálcio citosósico. A resposta ocorreu imediatamente após a adição de ATP aos pericytes, e diminuiu lentamente durante o período de tempo medido. A resposta ao cálcio também foi medida com imagens confocal em tempo real.A fluorescência da linha de base foi medida, então a ATP foi adicionada em 64 segundos, e uma forte resposta intracelular de cálcio foi evidente. Logo depois, o cálcio citosomico compartimentalizado nas células, e uma redução na área celular era visível. Em 300 segundos, a área celular reduziu fortemente, e a fluorescência diminuiu quase para os níveis de linha de base.Este método tem sido usado para obter as primeiras medidas intracelulares de cálcio a partir de pericytes capilares cerebrais primários, demonstrando que os pericítos são estimulados via ATP, e são capazes de contrair in vitro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...