Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить финансирование из Лундбек Фонд исследовательской инициативы по мозга барьеров и доставки наркотиков (RIBBDD) и Саймон Hougners семьи фонда.

1. Подготовка буферов и решений для культивирования клеток
<ol><li>Приготовьте раствор коллагенового бульона, растворив 5 мг коллагена IV из человеческой плаценты в 50 мл PBS на ночь при 4 градусах Цельсия. Aliquot фондовый раствор в 5 мл порций и хранить при -20 градусов по Цельсию.</li>
	<li>Приготовьт...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

В этом исследовании мы представили метод изоляции первичных перицитов от крупного рогатого скота. Описанный протокол позволяет культуре этого иначе довольно недоступный тип ячейки. Впоследствии полученная культура клеток была почти однородной популяцией перицитов, практически без ?...

Мозг капиллярных перицитов, вместе с эндотелиальными клетками и астроцитами, составляют NVU1,2,3. Эндотелиальные клетки, которые составляют структурную основу капилляров, образуют длинные цилиндрические трубки диаметром 5-8 мкм. Эндотелиальные клетки время от времени покрываются перицитами и окружены выступами астроцитов; эндфит астроцитов.
Гемово-мозговой барьер (BBB), расположенный в капиллярах мозга, является основным местом для обмена питательными веществами, газами и отходами между мозгом и кровью. BBB также защищает мозг от эндогенных и экзогенных нейротоксинов и служит барьером для доставки большого количества лекарственных соединений. Барьерная функция является областью фокусировки, а также препятствием для фармацевтических компаний, разрабатывая лекарства центральной нервной системы (ЦНС). Это вызвало большой интерес к расследованию клеток NVU в культуре4. Астроциты мозга и эндотелиальные клетки были культурны и охарактеризованы в ряде исследований, в то время как исследования и протоколы перицитной культуры являются редкими.
Ранее опубликованные протоколы описали генерации мозга капиллярных перицитных культур в некоторой степени, используя целый ряд различных подходов, таких какиммунопаннинг 5, высокой и низкой глюкозы СМИ 6 , флуоресцентно-активированнойклетки сортировки 7, плотность градиент центрифугации8и т.д. Хотя эти методы кажутся достаточными для получения культур перицитов, некоторые из них относят много времени, стоят дорого и перициты, полученные не может быть идеальным из-за числа культуры проходы, которые могутде-дифференцироватьpericytes 9 . Кроме того, потенциал культурных перицитов в исследованиях в области сигнализации in vitro до сих пор довольно не изучен.
Нынешняя работа посвящена генерации перицитовых культур из изолированных капилляров мозга крупного рогатого скота и последующей установке для измерений и исследований изображений изменений внутриклеточного кальция, важного внутриклеточного второго посланника. Мы кратко описываем изоляцию капилляров от коркового серого вещества (для деталей см. Helms et al.10)и изоляцию и культуру перицитов в чистой монокультуре без загрязнения эндотелиальными или глиальными клетками. Затем мы предоставляем протокол для посева перицитов в 96-хорошо пластин и протоколы загрузки для кальция зонд Fura-2 AM. Наконец, мы показываем, как перициты могут быть использованы в конфокальных изображений в режиме реального времени в камерах микроскопной культуры и описываем протоколы для этого.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Перициты связаны с эндотелиальными клетками и астроцитическим эндфитом в структуре, известной как нервно-сосудистый блок (NVU). Функция перицита мозга капилляра не до конца известна. Перициты были предложены для участия в развитии капилляров, регулирование эндотелиальной герметичности барьера и трансцитоза деятельности, регулирование капиллярного тона и играть решающую роль в некоторых патологий мозга.
Перициты являются сложными для исследования в нетронутой мозга из-за трудностей в визуализации процессов в мозге parenchyma, а также близость к другим клеткам NVU. Настоящий протокол описывает метод изоляции и культуры первичных капиллярных перицитов мозга крупного рогатого скота и их следующее использование в исследованиях визуализации кальция, где могут быть исследованы эффекты агонистов, участвующих в сигнализации мозга и патологиях. Корковые капиллярные фрагменты могут прикрепляться к нижней части культуры колбы и, после 6 дней, эндотелиальные клетки и перициты выросли из капиллярных фрагментов. Эндотелиальные клетки удаляются нежной трипсинизацией и перициты культурируются в течение 5 дополнительных дней до прохода.
Изолированные перициты посеяны в 96-колодец культуры пластин и загружены с красителем индикатор кальция (Fura-2 ацетоксиметил (AM)), чтобы для измерения внутриклеточного уровня кальция в установке считыватель пластин. Кроме того, перициты сеяются на крышках и устанавливаются в клеточных камерах. После загрузки с индикатором кальция (Cal-520 AM), кальций живой визуализации может быть выполнена с помощью конфокаляновой микроскопии на возбуждение длины волны 488 нм и выбросов длины волны 510-520 нм.
Метод, описанный здесь, был использован для получения первых внутриклеточных измерений кальция от первичных перицитов капилляров мозга, демонстрируя, что перициты стимулируются через АТФ и способны заключить контракт в пробирке.

Капилляры мозга крупного рогатого скота были выделены из свежей ткани мозга и рисунок 1 представляет капиллярного посева и клеточного роста в течение нескольких дней и последующей очистки перицитов. Капилляры полностью прикреплены к колбе на 1 день и ?...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Мозг капиллярных перицитов являются важными игроками в регуляции гемово-мозгового барьера свойства и кровотока. Этот протокол описывает, как перициты мозга могут быть изолированы, культурны, характеризуются по отношению к типу клеток и применяются для исследований внутриклеточного кальция сигнализации с флуоресцентными зондами.

Культура перицитов мозга для цитозолических измерений кальция и исследований по визуализации кальция

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Это простой и эффективный метод изоляции и культивирования первичных перицитов мозга для изучения межклеточной сигнализации кальция. Полученная культура клеток является почти однородной популяцией перицитов, и ее просто загрузить перициты для визуализации кальция. Методы, описанные здесь, должны предоставить другим исследователям в этой области сильные инструменты для изучения перицитовой биологии и внутриклеточной сигнализации в перицитах in vitro.Начните с оттаивания одного флакона капилляров в водяной бане 37 градусов по Цельсию. После того, как капилляры оттаяли, перенесите их в центрифугу трубку с 30 миллилитров DMEM comp, и центрифуга их в течение пяти минут при 500 раз G.Then, удалить среду из трубки, и повторно приостановить палитру в 10 миллилитров свежего DMEM комп. Перенесите подвеску в фляг с покрытием Т-75 и позвольте капиллярам прилипать к дну в течение четырех-шести часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, снабженному 10%-ным углекислым газом.После инкубации осмотрите колбу под световым микроскопом. Фракции капилляров теперь должны быть прикреплены к нижней части колбы. На четвертый день после посева капилляров, осмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться, что они примерно от 60 до 70% стечения.Аспирировать среды, и аккуратно мыть клетки с PBS. Добавьте два миллилитров разморожевания трипсина-ЭДТА и оставьте колбу в инкубаторе на одну-три минуты, часто вынося колбу и наблюдая за отслоением клеток с помощью микроскопа. Когда эндотелиальные клетки начинают округляться, осторожно коснитесь колбы, чтобы отсоединить их.Когда клетки отсоединились, прекратите трипсинизацию, добавив в колбу 10 миллилитров комп DMEM. Промыть колбу несколько раз со средой, и аспирировать эндотелиальной клеточной подвески, которые теперь могут быть использованы для других целей. Добавьте 10 миллилитров DMEM comp в колбу и проверьте его под световым микроскопом, чтобы убедиться, что перициты все еще присутствуют и прикреплены к дну.Затем поместите колбу обратно в инкубатор, чтобы перицит-обогащенной культуры расти. Чтобы семени перицитов в покрытие 96-хорошо пластин, отделить их, как описано в рукописи текста. Аспирировать среды, заботясь, чтобы не беспокоить гранулы клетки, и повторно приостановить гранулы в один миллилитр свежего DMEM комп.Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры, а затем вычислите объем суспензии, который должен быть добавлен в каждую колодец, чтобы посеять 10 000 клеток на колодец. Добавить подвеску клетки, а затем добавить достаточно DMEM комп к клеткам для достижения общего объема 200 микролитров на колодец. Когда готовы загрузить перициты с Fura-2 AM кальций индикатор красителя, принять 96-хорошо пластины с клетками из инкубатора, и аспирировать среды из колодцев.Вымойте клетки дважды с помощью буфера анализа и добавьте 100 микролитров погрузочного раствора в каждую колодец. Оберните пластину фольгой, чтобы избежать отбеливания фото, и инкубировать его в течение 45 минут с 30 об / мин встряхивания при комнатной температуре. После инкубации, аспирировать буфер загрузки, и мыть клетки с помощью буфера анализа в два раза.Добавьте 100 микролитров свежего, чтобы проецировать буфер, и оставьте клетки инкубировать в течение 30 минут. После инкубации установите температуру считывателя пластины до 37 градусов по Цельсию и перенесите 96-хорошую пластину с клетками в положение образца пластины, затем поместите реагентную пластину с агонистом в положение реагентной пластины. Начните с измерения нагрузки клеток для обеспечения равной нагрузки Fura-2 AM во всех скважинах, затем выполните измерения с возбуждением флуоресценции длины волны на 340-380 нанометров, а длина волны выбросов на 510 нанометров.Добавьте 50 микролитров агониста со скоростью 150 микролитров в секунду, от реагентной пластины до каждой хорошо с клетками. Накройте крышку скольжения в камеру клетки, и затянуть его, чтобы избежать утечек. Добавьте DMEM comp и рассчитанный объем подвески ячейки в каждую камеру, для конечного объема в 500 микролитров.Инкубировать клеточные камеры при 37 градусах по Цельсию и 10%углекислого газа в течение шести дней, или до слияния. После того, как клетки стекут, возьмите камеры клеток из инкубатора, и аспирировать среды. Вымойте клетки дважды с помощью буфера анализа и добавьте 500 микролитров буфера загрузки в каждую камеру, затем инкубировать их при комнатной температуре в течение 45 минут.После инкубации, аспирировать погрузочный буфер, и мыть клетки дважды с помощью буфера анализа, а затем добавить 500 микролитров свежего буфера анализа в каждой камере и инкубировать их еще 30 минут при комнатной температуре, чтобы расщепление АМ-эстер. Замените буфер 500 микролитров буфера свежего анализа и прополкайте живую визуализацию в конфокальцаторе. Намонтировать камеру клетки на стадии микроскопа как можно мягче, чтобы избежать нарушения клеток.Установите длину волны возбуждения на 488 нанометров, выброс на 515 нанометров, двухминутное последовательное получение изображения с пятью секундными интервалами и размер изображения 512 на 512 пикселей. Добавьте 300 микролитров 100 миллимолярной АТФ в камеру клетки и инициируют получение изображения. Этот протокол был использован для очистки перицитов от капилляров мозга крупного рогатого скота.Сотовый результат из семенных капилляров был изображен в течение девяти дней. Капилляры были полностью прикреплены к колбе в первый день, и на второй день, эндотелиальный прорастания было видно. Через четыре дня клеточный нарой был отличительным, и эндотелиальные клетки были удалены с помощью трипсинизации.Остатки капилляров присутствовали после трипсинизации, но исчезли из колбы в последующие дни. После удаления эндотелиального слоя перицитам разрешалось расти до слияния. На девятый день перициты достигли примерно 80% слияния, и образовались острова.Добавление АТФ в загруженные перициты Фура-2 привело к повышению уровня цитозоля кальция. Реакция произошла сразу же после добавления АТФ к перицитам и медленно снижалась в течение измеренного периода времени. Реакция кальция также измерялась с помощью конфокальных изображений в режиме реального времени.Базовая флуоресценция была измерена, затем АТФ был добавлен на 64 секунд, и сильная внутриклеточная реакция кальция была очевидна. Вскоре после этого в клетках был виден цитозолированный кальций, и было видно уменьшение площади клеток. К 300 секундам площадь клетки сильно уменьшилась, а флуоресценция снизилась почти до базовых уровней.Этот метод был использован для получения первых внутриклеточных измерений кальция из первичных перицитов мозга, демонстрируя, что перициты стимулируются через АТФ, и способны контракт в пробирке.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Функциональной визуализации кальция в развивающихся Корковая сетей

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Одновременное электрофизиологические записи и Кальций изображений супрахиазматического ядра нейронов

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Аблация нейрональных населения с помощью двух Фотон лазера и его оценки с использованием изображений кальция и поведенческих запись в Zebrafish личинки

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для глубокой визуализации кальция in vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Визуализация кальция в Верхнем колликулусе мышей

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...