Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Los autores desean reconocer la financiación de la iniciativa de investigación de la Fundación Lundbeck sobre barreras cerebrales y entrega de drogas (RIBBDD) y la Fundación de la Familia Simon Hougners.

1. Preparación de tampones y soluciones para el cultivo celular
<ol><li>Preparar la solución de stock de colágeno disolviendo 5 mg de colágeno IV de la placenta humana en 50 ml de PBS durante la noche a 4 oC. Aliquot la solución de stock en porciones de 5 ml y almacenar a -20 oC.</li>
	<li>Preparar la solución de stock de fibronectina disolviendo 5 mg de fibronectina en 5 ml de agua estéril durante la noche. Conservar las existencias de fibronectina en alícuotas de 500 oL a -20 oC. Al descongelar, añadir PBS...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

En este estudio, hemos presentado un método para aislar pericitos primarios de cerebros bovinos. El protocolo descrito permite la referencia cultural de este tipo de celda bastante inaccesible. El cultivo celular obtenido posteriormente fue una población casi homogénea de pericitos, con poca o ninguna contaminación con células endoteliales y células gliales basadas en morfología celular y expresión proteica12. Además, demostramos un método simple y sencillo para cargar los pericitos con ...

Los pericitos capilares cerebrales, junto con las células endoteliales y los astrocitos, constituyen el NVU1,2,3. Las células endoteliales, que forman la base estructural de los capilares, forman largos tubos cilíndricos con un diámetro de 5-8 m. Las células endoteliales están esporádicamente cubiertas de pericitos y rodeadas de protuberancias de astrocitos; el final del astrocito.
La barrera hematoencefálica (BBB), situada en los capilares cerebrales, es el sitio principal para el intercambio de nutrientes, gases y productos de desecho entre el cerebro y la sangre. El BBB también protege el cerebro de las neurotoxinas endógenas y exógenas y sirve como una barrera para la entrega de un gran número de compuestos de drogas. La función de barrera es un área de enfoque, así como un obstáculo, para las compañías farmacéuticas que desarrollan medicamentos del sistema nervioso central (SNC). Esto ha suscitado un gran interés en investigar las células de la NVU en el cultivo4. Los astrocitos cerebrales y las células endoteliales se han cultivado y caracterizado en una serie de estudios, mientras que los estudios y protocolos para el cultivo de pericitos son escasos.
Los protocolos publicados anteriormente han descrito la generación de cultivos de pericito capilar cerebral hasta cierto punto, utilizando una gama de enfoques diferentes como inmunopanning5,medios de alta y baja glucosa6,clasificación celular activada por fluorescentes7, centrifugación de gradiente de densidad8,etc. Aunque estos métodos parecen suficientes para obtener cultivos de pericitos, algunos consumen mucho tiempo, son costosos y los pericitos obtenidos podrían no ser ideales debido al número de pasajes de cultivo que pueden des-diferenciar los pericitos9. Además, el potencial de los pericitos cultivados en estudios de señalización in vitro ha sido bastante inexplorado hasta ahora.
El presente trabajo se centra en la generación de cultivos de pericitos a partir de capilares cerebrales bovinos aislados y la posterior configuración para mediciones y estudios por imágenes de cambios en el calcio intracelular, un importante segundo mensajero intracelular. Describimos brevemente el aislamiento de capilares de materia gris cortical (para más detalles ver Helms et al.10) y el aislamiento y cultivo de pericitos en monocultivo puro sin contaminación con células endoteliales o gliales. A continuación, proporcionamos un protocolo para la siembra de pericitos en placas de 96 pozos y protocolos de carga para la sonda de calcio Fura-2 AM. Por último, mostramos cómo se pueden utilizar pericitos en imágenes confocales en tiempo real en cámaras de cultivo de microscopio y describimos los protocolos para ello.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Los pericitos se asocian con células endoteliales y endfeet astrocíticos en una estructura conocida como unidad neurovascular (NVU). La función del pericito capilar cerebral no se conoce completamente. Se ha sugerido que los pericitos participan en el desarrollo capilar, la regulación de la opresión de la barrera endotelial y la actividad de la transcitosa, la regulación del tono capilar y desempeñan un papel crucial en ciertas patologías cerebrales.
Los pericitos son difíciles de investigar en el cerebro intacto debido a las dificultades en la visualización de los procesos en el parénquima cerebral, así como la proximidad a las otras células de la NVU. El presente protocolo describe un método para el aislamiento y el cultivo de pericitos capilares primarios del cerebro bovino y su siguiente uso en estudios de imágenes de calcio, donde se pueden investigar los efectos de los agonistas involucrados en la señalización cerebral y las patologías. Se permite que los fragmentos capilares corticales se adhieran al fondo de los matraces de cultivo y, después de 6 días, las células endoteliales y los pericitos han crecido a partir de los fragmentos capilares. Las células endoteliales se eliminan mediante la trippsinación suave y los pericitos se cultivan durante 5 días adicionales antes de la transeúncia.
Los pericitos aislados se siembran en placas de cultivo de 96 pozos y se cargan con el tinte indicador de calcio (Fura-2 acetoximetil (AM)) para permitir mediciones de los niveles de calcio intracelular en una configuración del lector de placas. Alternativamente, los pericitos se siembran en los cubreobjetos y se montan en cámaras celulares. Después de la carga con el indicador de calcio (Cal-520 AM), las imágenes en vivo de calcio se pueden realizar utilizando microscopía confocal a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 510-520 nm.
El método descrito aquí se ha utilizado para obtener las primeras mediciones intracelulares de calcio de pericitos capilares primarios del cerebro, demostrando que los pericitos se estimulan a través de ATP y son capaces de contraerse in vitro.

Los capilares cerebrales bovinos fueron aislados del tejido cerebral fresco y la Figura 1 presenta la siembra capilar y el crecimiento celular durante los días y la posterior purificación de pericitos. Los capilares están completamente unidos al matraz en el día 1 y el día 2 la brotación endotelial se ha hecho visible(Figura 1, día 2). Después de 4 días, el crecimiento celular es altamente distintivo...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Los pericitos capilares cerebrales son actores esenciales en la regulación de las propiedades de la barrera hematoencefálica y el flujo sanguíneo. Este protocolo describe cómo los pericitos capilares cerebrales pueden ser aislados, cultivados, caracterizados con respecto al tipo de célula y aplicados para investigaciones de señalización de calcio intracelular con sondas fluorescentes.

Cultivo de pericitos capilares cerebrales para mediciones de calcio citosólico y estudios de imágenes de calcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Este es un método simple y eficaz para aislar y cultivar pericitos cerebrales primarios para el estudio de la señalización intercelular de calcio. El cultivo celular obtenido es una población casi homogénea de pericitos, y es sencillo cargar los pericitos para la toma de imágenes de calcio. Los métodos descritos aquí deben proporcionar a otros investigadores en el campo herramientas sólidas para el estudio de la biología de pericitos, y señalización intracelular en pericitos in vitro.Comience descongelando un vial de capilares en un baño de agua celsius de 37 grados. Una vez que los capilares se hayan descongelado, transfiéralos a un tubo centrífugo con 30 mililitros de DMEM comp, y centrifugarlos durante cinco minutos a 500 veces G.Then, retirar el medio del tubo, y volver a suspender la paleta en 10 mililitros de DM compEM fresco. Transfiera la suspensión a un matraz T-75 recubierto, y permita que los capilares se adhieran al fondo durante cuatro a seis horas en una incubadora de 37 grados Cent grados centígrados suministrada con un 10% de dióxido de carbono.Después de la incubación, inspeccione el matraz bajo un microscopio de luz. Ahora las fracciones de capilares deben estar unidas a la parte inferior del matraz. En el cuarto día después de sembrar los capilares, inspeccione bajo el microscopio para asegurarse de que son aproximadamente 60 a 70%confluent.Aspirar el medio y lavar suavemente las células con PBS. Añadir dos mililitros de trippsina-EDTA descongelado, y dejar el matraz en la incubadora durante uno a tres minutos, sacar el matraz con frecuencia y observar el desprendimiento celular con el microscopio. Cuando las células endoteliales comiencen a redondear hacia arriba, toque suavemente el matraz para separarlos.Cuando las células se hayan desprendido, detenga la tripsinación añadiendo 10 mililitros de DMEM comp al matraz. Enjuague el matraz unas cuantas veces con el medio y aspire la suspensión de la célula endotelial, que ahora se puede utilizar para otros fines. Añadir 10 mililitros de DMEM comp al matraz, y comprobarlo bajo el microscopio de luz para asegurarse de que los pericitos todavía están presentes y unidos a la parte inferior.Luego, vuelva a colocar el matraz en la incubadora para permitir que el cultivo enriquecido con perito crezca. Para sembrar pericitos en placas recubiertas de 96 pozos, deséstelas como se describe en el manuscrito de texto. Aspirar el medio, teniendo cuidado de no molestar el pellet celular, y volver a suspender el pellet en un mililitro de comp DMEM fresco.Cuente las células usando una cámara de conteo, luego calcule el volumen de suspensión que se debe agregar a cada pozo para sembrar 10.000 células por pozo. Agregue la suspensión celular, luego agregue suficiente comp DMEM a las células para lograr un volumen total de 200 microlitros por pozo. Cuando esté listo para cargar los pericitos con el tinte indicador de calcio Fura-2 AM, tome la placa de 96 pozos con las células fuera de la incubadora, y aspire el medio de los pozos.Lave las células dos veces con el búfer de ensayo y agregue 100 microlitros de solución de carga a cada pozo. Envuelva la placa con papel de aluminio para evitar el blanqueo fotográfico, e incubarlo durante 45 minutos con 30 RPM de agitación a temperatura ambiente. Después de la incubación, aspirar el tampón de carga y lavar las células con el tampón de ensayo dos veces.Agregue 100 microlitros de tampón fresco al ensayo, y deje que las células se incuban durante 30 minutos. Después de la incubación, ajuste la temperatura del lector de placas a 37 grados Celsius, y transfiera la placa de 96 pocillos con las células a la posición de la placa de muestra, luego coloque la placa de reactivo con agonista en la posición de la placa de reactivo. Comience midiendo la carga de las células para asegurar la carga igual de Fura-2 AM en todos los pomos, luego realice las mediciones con longitud de onda de fluorescencia de excitación a 340 a 380 nanómetros, y la longitud de onda de emisión a 510 nanómetros.Añadir 50 microlitros de agonista, a una velocidad de 150 microlitros por segundo, desde la placa de reactivo a cada pozo con células. Monte un resbalón de cubierta en la cámara de la celda y apriételo para evitar fugas. Agregue DMEM comp y el volumen calculado de suspensión celular en cada cámara, para un volumen final de 500 microlitros.Incubar las cámaras celulares a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono durante seis días, o hasta que sean confluentes. Una vez que las células son confluentes, saque las cámaras celulares de la incubadora y aspire el medio. Lave las células dos veces con el tampón de ensayo, y agregue 500 microlitros de tampón de carga a cada cámara, luego incubarlas a temperatura ambiente durante 45 minutos.Después de la incubación, aspirar el tampón de carga, y lavar las células dos veces con tampón de ensayo, luego añadir 500 microlitros de tampón de ensayo fresco a cada cámara e incubarlas durante otros 30 minutos a temperatura ambiente, para permitir la escisión del éster AM. Sustituya el tampón por 500 microlitros de tampón de ensayo fresco y proceda con imágenes en vivo a un microscopio confocal. Monte la cámara celular en el escenario del microscopio tan suavemente como sea posible para evitar la alteración de las células.Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros, emisión a 515 nanómetros, adquisición de imagen secuencial de dos minutos con intervalos de cinco segundos y un tamaño de imagen x, y de 512 por 512 píxeles. Agregue 300 microlitros de 100 ATP milimorímes a la cámara celular e inicie la adquisición de imágenes. Este protocolo se utilizó para purificar pericitos de capilares cerebrales bovinos.El crecimiento celular de los capilares de semillas se hizo una imagen en el transcurso de nueve días. Los capilares estaban completamente unidos al matraz en el primer día, y para el segundo día, la brotación endotelial era visible. Después de cuatro días, el crecimiento celular fue distintivo, y las células endoteliales fueron eliminadas a través de la tripsina.Los restos de los capilares estaban presentes después de la tripsinación, pero desaparecieron del matraz en los días siguientes. Después de la eliminación de la capa endotelial, se permitió que los pericitos crecieran hasta la confluencia. En el día nueve, los pericitos alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia, y formaron islas.La adición de ATP a los pericitos cargados Fura-2 dio lugar a un aumento en los niveles de calcio citosólico. La respuesta se produjo inmediatamente después de la adición de ATP a los pericitos, y disminuyó lentamente durante el período de tiempo medido. La respuesta al calcio también se midió con imágenes confocales en tiempo real.Se midió la fluorescencia basal, luego se agregó ATP a 64 segundos, y una fuerte respuesta intracelular de calcio fue evidente. Poco después, el calcio citosólico compartimentado en las células, y una reducción en el área celular fue visible. En 300 segundos, el área celular se redujo en gran medida, y la fluorescencia disminuyó casi a los niveles basales.Este método se ha utilizado para obtener las primeras mediciones de calcio intracelular de pericitos capilares primarios del cerebro, demostrando que los pericitos se estimulan a través de ATP, y son capaces de contraer in vitro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...