Name: culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies
Uploaded: 2020-05-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Yazarlar Beyin Bariyerleri ve İlaç Dağıtım Lundbeck Vakfı Araştırma girişimi (RIBBDD) ve Simon Hougners Aile Vakfı fon kabul etmek istiyorum.

1. Hücre culturing için tamponlar ve çözümlerhazırlanması
<ol><li>4 °C'de bir gecede 50 mL PBS'de insan plasentasından 5 mg kollajen IV eriterek kollajen stok çözeltisini hazırlayın. Aliquot stok çözeltisi 5 mL porsiyona ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Bir gecede 5 mL steril suda 5 mg fibronektin eriterek fibronektin stok çözeltisini hazırlayın. Fibronektin stoklarını -20 °C'de 500°L'lik aliquotlarda saklayın. Çözülürken, çalışma çözümünün hazırlanması için PBS'yi 50 mL'lik s...

<ol>
	<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+Developmental,+Physiological,+and+Pathological+Perspectives,+Problems,+and+Promises.">Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perivascular+Astroglial+Sheath+Provides+a+Complete+Covering+of+the+Brain+Microvessels:+An+Electron+Microscopic+3D+Reconstruction.">The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li><li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use.">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li><li>Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Pericytes+from+Rodent+Optic+Nerve+by+Immunopanning.">Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification,+and+Cultivation+of+Primary+Retinal+Microvascular+Pericytes:+A+Novel+Model+Using+Rats.">Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats.</a> Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).</li><li>Nayak, R. C., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+retinal+microvascular+pericytes:+isolation,+propagation,+and+identification.">Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification.</a> Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).</li><li>Nees, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+bulk+cultivation,+and+characterization+of+coronary+microvascular+pericytes:+the+second+most+frequent+myocardial+cell+type+in+vitro.">Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).</li><li>Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial/pericyte+interactions.">Endothelial/pericyte interactions.</a> Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).</li><li>Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Molecular+Biology.">Methods in Molecular Biology.</a> Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).</li><li>Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+signalling+in+the+nervous+system:+an+overview.">Purinergic signalling in the nervous system: an overview.</a> Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-induced+rises+in+cerebral+blood+flow+and+local+capillary+vasoconstriction+depend+on+conducted+vascular+responses+in+brain+capillaries.">Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries.</a> PNAS. , (2018).</li><li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+Outgrowth,+Propagation+and+Characterization+of+Human+Pericytes.">Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes.</a> Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).</li><li>Orlidge, A., Damore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+specific+effects+of+glycosaminoglycans+on+the+attachment+and+proliferation+of+vascular+wall+components.">Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components.</a> Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).</li><li>Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signaling+and+membrane+potential+in+descending+vasa+recta+pericytes+and+endothelia.">Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).</li><li>Bintig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+receptors+and+Ca2++signalling+in+the+human+blood-brain+barrier+endothelial+cell+line+hCMEC/D3.">Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3.</a> Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Kamouchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+pathways+in+rat+CNS+pericytes.">Calcium influx pathways in rat CNS pericytes.</a> Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+Causes+Retinal+Pericytes+to+Contract+In+vitro.">ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro.</a> Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).</li></ol>

Bu çalışmada, primer perisitleri büyükbaş beyinlerden izole etmek için bir yöntem sunduk. Açıklanan protokol, bu aksi takdirde erişilemeyen hücre tipi nin kültürüne izin verir. Daha sonra elde edilen hücre kültürü perisitlerin neredeyse homojen bir popülasyon, çok az veya hiç hücre morfolojisi ve protein ekspresyonuna dayalı glial hücreler ile kontaminasyon oldu12. Ayrıca, perisitleri ca2+görüntüleme için kalsiyum boyalarla doldurmak için basit ve basit bi...

Beyin kapiller perisitler, endotel hücreleri ve astrositler ile birlikte, NVU1,2,3oluşturmaktadır. Kılcal damarların yapısal temelini oluşturan endotel hücreleri, çapı 5-8 m olan uzun silindirik tüpler oluştururlar. Endotel hücreleri düzensiz perisitlerle kaplıdır ve astrositlerden gelen çıkıntılarla çevrilidir; astrosit endfeet.
Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin kılcal damarlarında bulunan, besin alışverişi için ana site, gazlar ve beyin ve kan arasında atık ürünler. BBB aynı zamanda endojen ve eksojen nörotoksinlerden beyni korur ve çok sayıda ilaç bileşiminin teslimi için bir engel görevi görehizmet eder. Bariyer fonksiyonu merkezi sinir sistemi (CNS) ilaçları geliştiren ilaç şirketleri için bir odak alanı, hem de bir engeldir. Bu kültür4NVU hücreleri soruşturma büyük bir ilgi mahmuzlu vardır. Beyin astrositleri ve endotel hücreleri bir dizi çalışmada kültürlenmiş ve karakterize edilmiş, perisit kültürü için çalışmalar ve protokoller seyrek tir.
Daha önce yayınlanan protokoller bir dereceye kadar beyin kılcal perisit kültürlerin nesil açıklanan, immünpanning gibi farklı yaklaşımlar bir dizi kullanarak5, yüksek- ve düşük glikoz medya6, floresan-aktive hücre sıralama7, yoğunluk gradyan santrifüj8, vb. Bu yöntemler perisit kültürlerini elde etmek için yeterli görünse de, bazıları zaman alıcı, pahalı ve elde edilen perisitler perisitleri farklılaştırabilen kültür pasajlarının sayısı nedeniyle ideal olmayabilir9. Ayrıca, in vitro sinyalizasyon çalışmalarında kültürlü perisitlerin potansiyeli şimdiye kadar keşfedilmemiştir.
Bu çalışma izole sığır beyin kılcal damarlarından perisit kültürlerin üretimi ve hücre içi kalsiyum değişiklikleri ölçümleri ve görüntüleme çalışmaları için sonraki kurulum üzerinde duruluyor, önemli bir hücre içi ikinci haberci. Kılcal damarların kortikal gri maddeden izolasyonunu kısaca anlatıyoruz (ayrıntılar için helms vd.10)ve perisitlerin izolasyonve kültürünü endotel veya glial hücrelerle kontaminasyon olmadan saf monokültürde tanımlıyoruz. Daha sonra 96-iyi plakalar ve kalsiyum probu Fura-2 için yükleme protokolleri perisit tohumlama için bir protokol sağlar. Son olarak, perisitlerin mikroskop kültür odalarında gerçek zamanlı konfokal görüntülemede nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz ve bunun protokollerini tanımlıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cal-520 AM</td>
			<td>AAT Bioquest</td>
			<td>21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Heraeus Multifuge 3SR+</td>
			<td>Standard large volume centrifuge for spinning down cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 510</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>FastRead</td>
			<td>102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip cell chamber</td>
			<td>Airekacells</td>
			<td>SC15022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5135</td>
			<td>Formerly known as Kolliphor EL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>471267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA/GE Healthcare</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22x22 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>631-0123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CK2</td>
			<td>Upright light microscope with phase contrast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>BMG LabTech</td>
			<td>NOVOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin G sodium/streptomycin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS3972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of brain capillary pericytes for cytosolic calcium measurements and calcium imaging studies

Perisitler nörovasküler birim (NVU) olarak bilinen bir yapıda endotel hücreleri ve astrositik endfeet ile ilişkilidir. Beyin kılcal perisit fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. Perisitlerin kapiller gelişim, endotel bariyer sıkışması ve transitez aktivitesinin düzenlenmesi, kapiller tonun düzenlenmesi ve bazı beyin patolojilerinde önemli rol oynamaları ile ilgili olduğu ileri sürülmüştür.
Perisitler beyin parankim süreçlerinde görme zorlukları nedeniyle bozulmamış beyinde araştırmak için zor, yanı sıra NVU diğer hücrelere yakın. Bu protokol, beyin sinyalizasyonu ve patolojilerinde yer alan agonistlerin etkilerinin araştırılabildiği kalsiyum görüntüleme çalışmalarında birincil sığır beyin kılcal damarlarının izolasyonu ve kültürü ve aşağıdaki kullanımları için bir yöntem tanımlamaktadır. Kortikal kılcal damar parçaları kültür şişelerinin altına takılmak için izin verilir ve, 6 gün sonra, endotel hücreleri ve perisitler kılcal parçalar dan dışarı büyüdü. Endotel hücreleri nazik tripsinizasyon ile çıkarılır ve perisitler passaging önce 5 gün daha kültürlenir.
İzole perisitler 96-iyi kültür plakaları içinde tohumlu ve kalsiyum indikatör boya ile yüklenir (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) bir plaka okuyucu kurulum hücre içi kalsiyum düzeylerinin ölçümleri için izin vermek için. Alternatif olarak, perisitler kapaklara tohumlanır ve hücre odalarına monte edilir. Kalsiyum indikatörü (Cal-520 AM) ile yüklendirin ardından, kalsiyum canlı görüntüleme 488 nm uyarma dalga boyunda ve 510-520 nm emisyon dalga boyunda konfokal mikroskopi ile yapılabilir.
Burada açıklanan yöntem, primer beyin kapiller perisitlerden ilk hücre içi kalsiyum ölçümlerini elde etmek için kullanılmıştır, perisitlerin ATP ile uyarıldığını ve in vitro olarak bulaşabildiğini göstermiştir.

Sığır beyin kılcal damarları taze beyin dokusundan izole edildi ve Şekil 1 gün içinde kılcal tohumlama ve hücresel büyüme ve perisitlerin sonraki saflaştırma sını ortaya koy. Kılcal damarlar 1. 4 gün sonra hücresel büyüme son derece belirgindir(Şekil 1, gün 4a) ve endotel hücreleri açıklanan protokole göre nazik tripsinizasyon ile uzaklaştırılır. Kılcal damarların kal...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies at JoVE.com

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Beyin kılcal perisitler kan-beyin bariyer özellikleri ve kan akışının düzenlenmesinde önemli oyunculardır. Bu protokol, beyin kapiller perisitlerin nasıl izole edilebildiğini, kültürlü, hücre tipine göre karakterize ve floresan problarla hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunun araştırılması için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır.

Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Bu izole ve hücreler arası kalsiyum sinyal çalışması için birincil beyin perisitleri kültüriçin basit ve etkili bir yöntemdir. Elde edilen hücre kültürü perisitlerin neredeyse homojen bir popülasyonudur ve kalsiyum görüntüleme için perisitleri yüklemek kolaydır. Burada açıklanan yöntemler, perisit biyolojisi ve perisit in vitro hücre içi sinyalleme için güçlü araçlar ile alanında diğer araştırmacılar sağlamalıdır.37 derece santigrat su banyosunda kılcal bir şişe kılcal bir şişe eriterek başlayın. Kılcal damarlar çözüldükten sonra, 30 mililitre DMEM comp içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve 500 kez G.Then'de beş dakika santrifüj edin, tüpün ortasını çıkarın ve paleti 10 mililitre taze DMEM comp'da yeniden askıya alın. Süspansiyonu kaplanmış bir T-75 şişesine aktarın ve kılcal damarların %10 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir kuluçka makinesinde 4-6 saat dibe yapışmasını bekleyin.Kuluçkadan sonra, şişeyi hafif bir mikroskop altında inceleyin. Kılcal damar kesirleri artık şişenin altına eklenmelidir. Dördüncü gün kılcal damarları tohumladıktan sonra, yaklaşık %60-70 konca olduğundan emin olmak için mikroskop altında inceleyin.Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile hafifçe yıkayın. İki mililitre çözülmüş tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi kuvözde bir ila üç dakika bekletin, şişeyi sık sık dışarı alın ve hücre ayrıştırmasını mikroskopla gözlemleyin. Endotel hücreleri toparlamaya başladığında, onları ayırmak için yavaşça şişeye dokunun.Hücreler ayrıldığında, şişeye 10 mililitre DMEM comp ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Orta ile şişe birkaç kez flush, ve endotel hücre süspansiyon aspire, şimdi başka amaçlar için kullanılabilir. Şişeye 10 mililitre DMEM comp ekleyin ve perisitlerin hala mevcut olduğundan ve dibe bağlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskobu altında kontrol edin.Sonra, perisitle zenginleştirilmiş kültürün büyümesine izin vermek için şişeyi kuvöze geri koyun. Perisitleri kaplamalı 96 kuyulu plakalara tohumlamak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi ayırın. Aleti aspire edin, hücre peletini rahatsız etmemeye özen gösterin ve bir mililitre taze DMEM comp'da peleti yeniden askıya alın.Hücreleri bir sayma odası kullanarak sayın, sonra her kuyuya eklenmeli süspansiyon hacmini hesaplayın tohum 10, kuyu başına 000 hücreleri. Hücre süspansiyon ekleyin, sonra iyi başına 200 mikrolitre toplam hacmi elde etmek için hücrelere yeterli DMEM comp ekleyin. Perisitleri Fura-2 kalsiyum indikatörü boyaile yüklemeye hazır olduğunuzda, 96-iyi plakayı kuvözden hücrelerle alın ve ortayı kuyulardan aspire edin.Hücreleri iki kez tsay arabelleği ile yıkayın ve her kuyuya 100 mikrolitre yükleme çözeltisi ekleyin. Fotoğraf beyazlatma önlemek için folyo ile plaka sarın ve oda sıcaklığında sallayarak 30 RPM ile 45 dakika kuluçka. Kuluçkadan sonra, yükleme tamponunu aspire edin ve hücreleri iki kez temizleme tamponuyla yıkayın.Arama arabelleği için 100 mikrolitre taze ekleyin ve hücreleri 30 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, plaka okuyucunun sıcaklığını 37 dereceye ayarlayın ve hücrelerle birlikte 96 kuyuluk plakayı örnek plaka konumuna aktarın, ardından reaktif plakası ile reaktif plakasını reaktif plaka pozisyonuna yerleştirin. Tüm kuyularda Fura-2 eşit yükleme sağlamak için hücrelerin yükleme ölçerek başlayın, sonra 340 ila 380 nanometre uyarma floresan dalga boyu ile ölçümleri gerçekleştirmek ve 510 nanometre emisyon dalga boyu.50 mikrolitre agonist ekleyin, saniyede 150 mikrolitre hızda, reaktif plakadan hücrelerle her kuyuya. Hücre odasına bir kapak kapağı tonuyla ve sızıntıları önlemek için sıkın. 500 mikrolitrelik son hacim için dmem comp ve her bir odaya hücre süspansiyonu hesaplanan hacmi ekleyin.Hücre odalarını 37 santigrat derecede ve %10 karbondioksitle altı gün veya konfluent olana kadar kuluçkaya yatırın. Hücreler bir araya geldikten sonra, hücre odalarını kuvözden alın ve ortamı aspire edin. Hücreleri iki kez tisme arabelleği ile yıkayın ve her odaya 500 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin, ardından 45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, yükleme tamponu aspire, ve test tampon ile iki kez hücreleri yıkayın, sonra her odaya taze test tampon 500 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında başka bir 30 dakika kuluçka, ester bölünmesi sağlamak için. Tamponu 500 mikrolitre taze arsay arabelleği ile değiştirin ve konfokal mikroskopta canlı görüntülemeye devam edin. Hücrelerin bozulmasını önlemek için hücre odasını mikroskopun sahnesine mümkün olduğunca hafifçe monte edin.Uyarma dalga boyunu 488 nanometre, emisyon 515 nanometre, beş saniyelik aralıklarla iki dakikalık sıralı görüntü edinimi ve 512 x12 x12 x12 y görüntü boyutuna ayarlayın. Hücre odasına 100 milimolar ATP 300 mikrolitre ekleyin ve görüntü edinimi başlatın. Bu protokol, perisitleri büyükbaş beyin kılcal damarlarından arındırmak için kullanılmıştır.Tohumlu kılcal damarlardan hücresel büyüme dokuz gün boyunca görüntülendi. Kılcal damarlar ilk gün şişeye tamamen bağlıydı ve ikinci gün endotel filizlenmesi görülebiliyordu. Dört gün sonra, hücresel büyüme belirgin oldu, ve endotel hücreleri tripsinizasyon yoluyla kaldırıldı.Kapiller kalıntıları tripsinizasyondan sonra mevcuttu, ancak sonraki günlerde şişeden kayboldu. Endotel tabakası nın çıkarılmasından sonra perisitlerin biraraya gelene kadar büyümesine izin verildi. Dokuzuncu günde perisitler yaklaşık %80 biraraya gelmiş ve adalar oluşturmuşlar.Fura-2 yüklü perisitlere ATP eklenmesi sitosolik kalsiyum düzeylerinde artışa yol açtı. Yanıt perisitlere ATP eklenmesinden hemen sonra oluştu ve ölçülen zaman dilimi içinde yavaş yavaş azaldı. Kalsiyum yanıtı da gerçek zamanlı konfokal görüntüleme ile ölçüldü.Bazal floresans ölçüldü, sonra ATP 64 saniyede eklendi ve güçlü bir hücre içi kalsiyum yanıtı belirgindi. Kısa bir süre sonra, hücrelerde sitosolik kalsiyum bölümlere ayrılmış ve hücre alanında bir azalma görülebilir. 300 saniye ile hücre alanı ağır bir şekilde azaldı ve floresan neredeyse taban çizgisi seviyelerine geriledi.Bu yöntem, perisitlerin ATP ile uyarıldığını ve in vitro olarak bulaşabildiğini gösteren primer beyin kapiller perisitlerinden ilk hücre içi kalsiyum ölçümlerini elde etmek için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...