Name: on-site sampling and extraction of brain tumors for metabolomics and lipidomics analysis
Uploaded: 2020-05-31T15:00:00
Duration: 6 min 48 s
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这项研究得到了国家科学中心授予哈莫尼亚2015/18/M/ST4/00059的支持。作者要感谢德国达姆施塔特默克KGaA的一家企业，该公司提供了本作品中使用的SPME设备。默克的生命科学业务在美国和加拿大以米利波雷西格玛为经营范围。此外，作者要感谢赛默费舍尔科学访问Q-精确聚焦轨道rap质谱仪。
作者的贡献：JB：优化样品制备和LC-MS参数，SPME-LC-MS实验的性能，数据分析，统计分析和数据解释，以及与唇部部分相关的手稿制备;PZG：在医院大多数抽样的协调和性能，优化采样和样品制备参数，SPME-LC-MS实验的性能，数据分析，统计分析和数据解释，与代谢组学部分相关的手稿准备;MG – 协助优化样品制备、LC-MS 方法和与唇部部分相关的数据分析;KG：SPME采样的共同性能，优化采样和样品制备，SPME-LC-MS分析相关代谢组学部分;KC：在医院进行多项SPME采样，协助优化采样、样品制备和代谢组学部分数据分析;KJ：在医院进行多项SPME采样，协助进行唇膜分析;DP：执行外科手术，招募患者;JF：执行外科手术，招募患者;MH：外科手术的运行，临床部分的协调研究;BB：概念、项目协调监督和稿件准备、多次抽样表现

本文提出的研究得到了托鲁什尼古拉·哥白尼大学比德戈什茨大学医学大学生物伦理学委员会的批准（KB 628/2015）。请记住，应始终佩戴实验室外套和任何其他必需的人身安全设备，例如（但不限于）安全手套和眼镜。请勿接触固相微extraction （SPME） 探头的提取阶段。
1. 准备 SPME 设备
<ol><li>分别使用带混合模式和 C18 涂层的探头（纤维），用于代谢组学和唇部。收集两组样本，一组用于代谢组，另一组用于唇部。</li>
	<li>通过修剪 SPME 探头，将探头涂层调整到最佳长度。在目前的研究中，所选涂层长度为 7 mm。根据所研究的肿瘤的大小选择纤维的长度，确保整个吸附剂可以浸入肿瘤中（图1）。</li>
	<li>通过将探针的涂层浸泡在甲醇中，对探头的涂层进行加热：水 50：50 v/v 混合物在萃取程序之前至少 1 小时。将纤维运送到采样点（例如医院），在含有调理溶液的小瓶中。</li>
</ol>2. 样品收集程序
<ol><li>在SPME提取之前，请勿以任何方式清洗或预处理肿瘤。</li>
	<li>在肿瘤切除后尽快开始取样（在介绍的研究中为2分钟）。 注：根据给定设施的现场设置（研究人员工作现场与操作台的距离）调整时间，并在整个研究中保持恒定。最大限度地减少肿瘤切除和开始提取之间的时间对于捕获不稳定的代谢物至关重要，这些代谢物在血液循环从研究组织被切断后会降解。</li>
	<li>在室温下进行采样。或者，在进行萃取时将样品放在冰上。在这两种情况下，请为整个样本集保持相同的条件。</li>
	<li>从小瓶中拿出探针。</li>
	<li>使用液相色谱-质谱法 （LC/MS） 等级水将纤维浸入 LC/MS 级水中，洗涤纤维 5 s。在插入光纤之前，不要让吸附剂干燥，以确保数据具有良好的可重复性。</li>
	<li>将纤维尽可能远地插入脑肿瘤组织，确保整个提取阶段位于肿瘤内。 注：建议进行复制提取，以确定肿瘤的异质性质（图2）。建议每个样本进行三次复制。</li>
	<li>将探头留在组织中 30 分钟（用定时器测量）。</li>
	<li>使用空白控件消除与样本肿瘤以外的来源产生的人工制品存在相关的错误来源。要获得空白控制，需要采用与上文所述相同的分析工作流程，但没有采样步骤（插入组织或任何其他样品/矩阵）。在数据处理步骤中，将从这些纤维中提取的分析物编译为"排除列表"，以排除来自溶剂或纤维制造的污染物产生的信号。建议至少使用 3 个空白副本。 注：要检查污染风险，必须对手套、桌子、仪器或任何其他可能构成污染风险的表面进行取样。在这种情况下，纤维制备、提取时间和脱吸协议与样品相同。</li>
	<li>进行萃取时，在提取后标记用于存储探针的小瓶。</li>
	<li>30分钟后，从脑肿瘤中去除纤维。</li>
	<li>将纤维浸入LC/MS级水中，以去除探头中残留的血液或细胞碎片，使最终提取物仅包含小分子，将纤维用水洗涤3s。不建议较长的洗涤步骤，因为它可能导致极性化合物的流失。</li>
	<li>通过用纤维的非涂层端从底部刺穿隔膜，将纤维固定在高性能液相色谱 （HPLC） 小瓶盖的片前隔膜中。</li>
	<li>将纤维固定在单独的 HPLC 小瓶中，并放在选定的运输容器中。</li>
	<li>对于专用于空白控件的光纤执行步骤 2.11-2.13。</li>
</ol>3. 运输和储存
注：有几种选项可用于将样品运送到实验室。建议使用充满干冰的液氮脱华或聚苯乙烯箱运输;或者，冰袋可用于即时和快速运输。
<ol><li>将装有纤维的小瓶放在运输容器中。</li>
	<li>实验室到达时，立即将带 SPME 纤维的小瓶放入 -80°C 或 -30°C 冷冻室。请勿在-30°C下储存纤维超过3年，或在-80°C下储存超过3年的纤维。</li>
</ol>4. 代谢组学分析的样本制备
注意：只有在收集了实验的所有样本后，才应执行此步骤。
<ol><li>在仪器分析之前，准备脱吸溶剂混合物：乙酰：水80：20 v/v。</li>
	<li>从冰柜中取出含有混合模式纤维的小瓶。使用这些进行代谢组学分析。</li>
	<li>标签小瓶用于脱吸。</li>
	<li>脱吸溶液的移液 300 μL（在步骤 4.1 中制备）放入放置在 2 mL 小瓶中的玻璃刀片中。</li>
	<li>将涂层完全浸入脱吸溶剂中，然后在转速为 1，200 rpm 时，在 1，200 rpm 转速下搅拌 120 分钟，从放置在单独刀片中的每个纤维执行脱吸。</li>
	<li>120 分钟后（一旦脱吸完成），用探头拆下盖。</li>
	<li>通过从样品集混合每个样品的 10 μL 等分来制备 QC 样品。样本集大小取决于实验设计。将所有样本分析为一批非常重要。</li>
	<li>用新瓶盖关闭小瓶。</li>
	<li>将小瓶放在液相色谱高分辨率质谱仪 （LC-HRMS） 的自动采样器 （4 °C） 中，然后移动到步骤 5。 注：随机化样本的注射顺序，包括控制空白。每 8-10 个样品后注入 QC 样品，以监测仪器的稳定性。</li>
</ol>5. 使用反相液相色谱和高分辨率质谱仪（RPLC-HRMS 分析）进行代谢组学分析
<ol><li>设置LC-HRMS分析和正电离模式的参数。 注：当前研究用阳性模式使用的参数如下：扫描范围：m/z 80-1000;分辨率 70 000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;向 C 陷阱注入时间：自动;喷雾电压：1.5 kV;S-镜头射频电平：55%;S 透镜电压：25 V;脱脂电压：15 V;毛细管温度：300°C;护套气体：40 a.u.;辅助气体： 15 a.u.;辅助燃气加热器温度：300°C。 这种色谱法改编自武科维奇等人。注射体积：10 μL。</li>
	<li>设置LC-HRMS分析和负电离模式的参数。 注：当前研究中使用的负值模式参数：扫描范围：m/z 80-1000;分辨率 70 000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;向 C 陷阱注入时间：自动;喷雾电压：2.5 kV;S-镜头射频电平：55%;S 透镜电压：-25 V;脱脂电压：-15 V;毛细管温度： 256 °C 护套气体： 48 a.u;辅助气体： 11 a.u.;辅助燃气加热器温度：413°C。 这种色谱法是Vuckovic等人采用的。注射体积：10 μL。</li>
	<li>按照制造商的建议校准仪器。 注：在目前的研究中，仪器每48小时使用外部校准进行校准，结果质量精度为<2 ppm。</li>
	<li>单击操作仪器的软件中的 " 开始"按钮开始分析。</li>
	<li>分析完成后，将 RPLC 列替换为 HILIC 列，更改移动阶段并转到步骤 6。</li>
</ol>6. 使用亲水性相互作用液相色谱和高分辨率质谱仪的代谢组学分析（HILIC-HRMS分析）
<ol><li>设置LC-HRMS分析和正电离模式的参数。 注：当前研究用阳性模式使用的参数如下：扫描范围：m/z 80-1000;分辨率 70 000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;向 C 陷阱注入时间：自动;喷雾电压：1.5 kV;S-镜头射频电平：55%;S 透镜电压：25 V;脱脂电压：15 V;护套气体：60 a.u.;辅助气体： 40 a.u.;辅助燃气加热器温度：425°C;毛细管温度： 325 °C.色谱法改编自武科维奇等人。注射体积：10 μL。</li>
	<li>设置LC-HRMS分析和负电离模式的参数。 注：当前研究采用负模式的参数如下：扫描范围：m/z 80-1000;分辨率 70 000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;向 C 陷阱注入时间：自动;喷雾电压：1.3 kV;S-镜头射频电平：55%。;S 透镜电压：-25 V;脱脂电压：-15 V;毛细管温度： 263 °C;护套气体：60 a.u.;辅助气体：30 a.u.;辅助燃气加热器温度：425°C。 色谱法改编自武科维奇等人。注射体积：10 μL。</li>
	<li>按照制造商的建议校准仪器。 注：在目前的研究中，仪器每48小时使用外部校准进行校准，结果质量精度为<2 ppm。</li>
	<li>单击操作仪器的软件中的 " 开始"按钮开始分析。</li>
</ol>7. 唇膜分析的样品制备
注意：只有在收集了实验的所有样本后，才应执行此步骤。
<ol><li>在开始分析之前，准备脱吸溶剂混合物：异丙醇：甲醇50：50 v/v。</li>
	<li>从冰柜中取出含有用于唇膜分析的 C18 纤维的小瓶。</li>
	<li>标签小瓶用于脱吸。</li>
	<li>脱吸溶液的移液200μL（在步骤7.1中制备），以硅化玻璃刀片放置在2 mL小瓶中。 注：也可以使用非硅化刀片，但使用非硅化刀片可能会导致具有高 logP 的化合物的可重复性较差，因为此类化合物可能不特别附着在玻璃壁上。</li>
	<li>在单独的刀片中对每根纤维进行脱吸，将涂层完全浸入脱吸溶剂中，然后在转速为 1，200 rpm 时使用涡流搅拌 60 分钟。</li>
	<li>60 分钟后，当脱吸完成时，使用探头拆下盖。</li>
	<li>通过从样品集混合每个样品的 10 μL 等分来制备 QC 样品。样本集大小取决于实验设计。将所有样本分析为一批非常重要。</li>
	<li>用新瓶盖关闭小瓶。</li>
	<li>将小瓶放在液相色谱高分辨率质谱仪 （LC-HRMS） 的自动采样器 （4 °C） 中，然后移动到步骤 8。</li>
</ol>8. 使用反相液相色谱和高分辨率质谱法（RPLC-HRMS 分析）进行利皮多米分析
<ol><li>设置LC-HRMS分析和正电离模式的参数。 注：当前研究用的正离子模式参数如下：扫描范围：m/z 100-1000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;向 C 陷阱注入时间：自动;喷雾电压：3.5 kV，S-透镜射频电平：55%;S 透镜电压：25 V;脱脂电压：15 V;毛细管温度 275 °C;护套气体：30 a.u.;辅助气体：上午10点;备用气体： 2 a.u.;探头加热器温度 300 °C。使用的LC参数为：A阶段：甲醇：水，40：60，10m氨基醋酸铵和1mM醋酸;B阶段：异丙醇：甲醇，90：10，10m氨酸铵和1mM醋酸;梯度：0分钟=20%B;1.0 分钟 = 20% B;1.5 分钟 = 50% B;7.5 分钟 = 70% B;13.0 分钟 = 95% B;17.0 分钟 = 95% B;17.1 分钟 = 95.5 % B;23.0 分钟 = 停止;C18 柱，3.5 μm，2.1 毫米 x 75 毫米;流量：0.2 mL/min;烤箱温度： 55 °C;注射量：10 μL。</li>
	<li>设置LC-HRMS分析和负电离模式的参数。 注：当前研究中使用的参数如下：负离子模式的HRMS参数：扫描范围：m/z 100-1000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;向 C 陷阱注入时间：自动;喷雾电压：3.5 kV，S-透镜射频电平：55%;S 透镜电压：-25 V;脱脂电压：-15 V;毛细管温度 275 °C;护套气体：30 a.u;辅助气体：上午10点;备用气体：2 a.u;探头加热器温度 300 °C。 色谱法：与8.1中相同。</li>
	<li>按照制造商的建议校准仪器。 注：在目前的研究中，仪器每48小时使用外部校准进行校准，结果质量精度为<2 ppm。</li>
	<li>单击操作仪器的软件中的 " 开始"按钮开始分析。</li>
	<li>分析完成后，将 RPLC 列替换为 HILIC 列，更改移动阶段并转到步骤 9。</li>
</ol>9. 使用亲水性相互作用液相色谱和高分辨率质谱仪的利皮多米分析（HILIC-HRMS 分析）
<ol><li>设置LC-HRMS分析和正电离模式的参数。 注：当前研究用的正离子模式参数如下：扫描范围：m/z 100-1000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;喷雾电压：1.5 kV;S-镜头射频电平：55%;S 透镜电压：25 V;脱脂电压：15 V;毛细管温度 325 °C;护套气体：60 a.u.;辅助气体：30 a.u.;备用气体： 2 a.u.;探头加热器温度320°CLC参数采用：A阶段：水中5mM醋酸铵;阶段B：乙酰三叶酸;梯度：0~2分钟=4%B;15.0 = 20% B;15.1 = 4% B， 21.0 分钟 = 停止;3 μm 100 mm x 2.1 毫米柱;流量： 0.4 mL/min;烤箱温度：40°C;注射量：10 μL。</li>
	<li>设置LC-HRMS分析和负电离模式的参数。 注：当前研究在负离子模式下使用的参数如下：扫描范围：m/z 80-1000;使用AGC（1，000，000离子）进行采集;喷雾电压：1.5 kV，S-镜头RF电平：55%;S 透镜电压：-25 V;脱脂电压：-15 V;毛细管温度 320 °C;护套气体：50 a.u.;辅助气体： 21 a.u.;备用气体： 3 a.u.;探头加热器温度 320°C。 色谱方法与 9.1 中描述的方法相同。</li>
	<li>按照制造商的建议校准仪器。 注：在目前的研究中，仪器每48小时使用外部校准进行校准，结果质量精度为<2 ppm。</li>
	<li>单击操作仪器的软件中的 " 开始"按钮开始分析。</li>
</ol>10. 数据处理和统计分析
<ol><li>使用与原始数据文件格式兼容的软件处理数据。</li>
	<li>使用处理的数据执行统计分析。 注：检验类型取决于研究的科学假设和设计。在目前的研究中，使用了主要成分分析、部分-最少方-区分分析和双向方差分析。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

非目标代谢组学和唇部学片通常用于专注于识别肿瘤生物标志物的研究。然而，在大多数情况下，研究人员寻找可用于筛查疾病的化合物。因此，首选的生物样本是血液或尿液，因为他们相对容易获得。对肿瘤组织的分析主要是为了了解疾病背后的机位，描述不同肿瘤类型等。很少进行肿瘤生物标志物的现场分析，因为此类应用需要大量样品制备。另外，基于对组织特征进行实时分析而不预先选择特定生物标志物的策略正在引起医学界的注意。本文提供的解决方案通过揭示可通过此类方法获得的信息类型，为现场组织处理提供了另一个视角。
采样、样品制备和提取相结合使SPME成为现场分析非常有用的工具。此外，在取样过程中缺乏组织消耗，因此，可以进一步使用相同的样品进行生物标志物分析和常规测试（基因分型、组织学分析），从而为标准测试结果增加新的信息。取样装置设计非常简单，操作简单，无需特殊训练才能进行提取。然而，要获得可靠的结果，需要的不仅仅是对设备的正确处理。要正确执行实验，需要了解提取过程、样本的性质，并注意可能影响数据的潜在错误。
重要的是要考虑癌组织10的异质性;采样肿瘤可能包含发生坏死、钙化和缺氧的部分，这些过程将反映在所达到的代谢和脂质中，从而影响结果。因此，建议通过将几种纤维插入癌组织的不同部位进行空间分辨率采样，或者使用较长的涂层穿透整个肿瘤，以获得肿瘤的平均值。如果采用空间分辨率采样方法，纤维可以全部脱吸成一种脱吸溶剂;这不仅允许获得肿瘤的整体信息，而且增加分析的敏感性。或者，将单个纤维分离到单独的小瓶中，可以研究找出脑肿瘤的内部多样性，脑肿瘤由癌细胞组成，外侧区域是健康组织的边界。肿瘤的更深层部分通常更损坏与癌症相关的过程11。但是，调查人员必须记住，此选项会损害方法灵敏度和可检测化合物的总数。在目前的工作中，使用了7毫米涂层;这个长度被认为是最佳的肿瘤的大小包括在研究中。涂层穿透肿瘤，因此提供非特殊分辨率，但整个样品的平均数据。无论选择什么协议，在整个研究过程中必须遵循相同的协议，包括用于单独采样的纤维数量、涂层长度、提取时间以及本工作中描述的所有其他因素。
控制分析的质量非常重要。应准备池性质量控制（参见协议中的步骤 4.7 和 7.7），用于在整个样品批处理运行期间监控仪器稳定性。空白控制装置（参见步骤 2.8）可稍后用于准备"排除清单"，以消除来自溶剂或纤维制造的污染物信号。在特殊情况下（如存在污染风险）时，有必要对手套、桌子、仪器或任何其他可能构成污染风险的表面进行取样。在这种情况下，纤维制备、提取时间和脱吸协议与样品相同。
代谢和脂肪分析完全集中在出现在生物体或生物体的特定成分（如特定器官、组织、液体、细胞等）的小分子（小于1，500达） 上。代谢和脂肪学提供了在体内发生的生化变化的快照，在癌症的情况下，它们集成了与肿瘤的基因组、组织学和恶性肿瘤有关的信息。这些医学科学在生理学和表型之间创造了一种联系，因为代谢物在生化阶梯中高于蛋白质或基因12。通过了解癌肿瘤的代谢和脂质，我们更接近于发现所有医学科学中的表型，因为这些研究分支提供了更深入的知识，了解分子的动态变化，作为生物体对各种刺激的反应。如本工作介绍，在一次抽样中获得的数据与癌症组织学、恶性程度相对应，反映了基因组层面发生的变化。在胶质瘤中，作为本研究中感兴趣的癌症类型，隐藏在基因组中的信息尤为重要，因为基于基因测试结果开发了个性化治疗。特定的突变是化疗或放射治疗结果的预后标记。如此处所证明，使用建议的策略可以选择反映给定突变的生物标志物。突变标记，以及其他描述符类型，如那些指示肿瘤恶性程度也可用于支持常规诊断方法。
使用固相微外包纤维进行活体化学活检是该方法在术中诊断中应用的第一步。在获得适当道德委员会许可之前，该方法可以很容易地用于体内采样。在这种情况下，必须按照进行取样的医院的接受灭菌程序，即高压灭菌或环氧乙烷灭菌，对SPME装置进行灭菌。预调节和灭菌纤维必须保存在标有灭菌期日期的密封包装中。需要注意的是，不应使用表面活性剂清洁纤维。这种过程可能导致吸附剂组合物发生非特异性变化，从而影响分析物的提取。在本文所述的研究中，使用了30分钟的提取期，但其他报告证实，较短的时间可以在体内研究13产生令人满意的结果。 Huq等人表明，分析物平衡时间在组织中作为一个复杂的基质，比在简单基质14中更快。然而，由于在平衡前条件下提取更多的分析物，在较短的提取期内，获得的结果的可重复性可能会受到影响;因此，必须实施精确的时间控制。
作为这项工作的一部分，这两个奥米学科学都作为生物标志物发现工具具有极佳的潜力。一旦选择生物标志物或建立化学计量模型，就可以开发和实施基于通过适用于现场调查的方法（如本工作中描述的SPME方法）确定目标代谢物的医疗诊断，作为常规诊断的一部分。
本手稿中提出的方案描述了如何使用固体相微extraction对癌症组织进行非目标代谢和唇部分析，以筛选潜在的生物标志物。它旨在提取具有代表性的化合物，分化肿瘤，并识别具有给定癌症特征的歧视性化合物，即潜在的生物标志物。本文中描述的 SPME 非目标分析代表了快速术中诊断发展的起点，在该诊断中，无需筛选样品中所有化合物即可确定选定的化合物面板。为了快速诊断结果，用于现场提取的 SPME 探头可以直接与医院设施中的分析仪器耦合。简单的提取与最小的样品制备，然后色谱分析将显著缩短总时间从小时到几分钟，如已经描述的药物监测15。

磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）是用于脑损伤实时分析的主要方法。脑肿瘤分化通常基于组织病理学与额外的染色和先进的免疫组织化学技术。根据世界卫生组织（WHO）2016年发布的中枢脑肿瘤最新指南，基因测试对于这些肿瘤的分化和分类至关重要。肿瘤的分化和分类使医生能够选择最有效的治疗特定类型的肿瘤，从而延长患者的预期寿命。不幸的是，尽管有这种先进的方法，以帮助医生选择最佳治疗他们的病人，诊断为胶质母细胞瘤（IV级胶质瘤）的患者的预期寿命只有约15-16个月2。即使该成像和组织学方法作为诊断工具的复杂和准确性提高，仍然非常需要新技术，能够提供补充信息，以帮助医生在治疗过程中作出决定。在过去的几年里，提出了几种基于质谱法的新方法，用于癌症3，4的术中分析。固相微extraction（SPME）作为一种快速现场分析工具，其潜力已在各种研究中得到证明。目前的手稿展示了该方法的临床应用之一，即人类脑肿瘤的无目标代谢组学和唇部。非目标调查是发现潜在生物标志物的重要起点。一旦建立，这种生物标志物，然后可以用作诊断参考，以区分肿瘤使用相同的技术耦合现场仪器。
SPME 是一种基于平衡的样品制备技术，利用少量提取阶段从样品基质中提取小分子。在SPME最传统的器件配置（探针）中，纤维涂有适当的萃取相，固定在固体支撑上，即金属线5、6。生物相容涂层和设备（探针）可直接从复杂的生物基质中提取，而无需样品预处理，例如均质和过滤。通过萃取过程，分析物按初始浓度的比例在萃取阶段和样品基质之间划分。如果萃取时间足够长，则达到平衡。虽然平衡时萃取可提供最高的灵敏度和可重复性，但在某些情况下，例如在体内取样，与现场采样（例如手术室或急诊室）相关的时间限制需要快速提取，均衡前萃取也是可能的，甚至更可取。给定分析物的萃取时间轮廓通常受分析物的物理化学特性、所采样的基质、使用的吸附剂类型和其他几个萃取条件的影响。当进行代谢组位或脂肪多基等非目标分析时，控制其提取动力学的大量因素几乎不可能确保所有化合物的平衡萃取。出于上述原因，对现行协议的提取时间进行任意设定，一方面确保代谢物的灵敏度和覆盖度令人满意，另一方面确保现场使用实用性。
应当强调，用于从组织中提取样品的探针尺寸非常小，只会造成最小的组织损伤，而取样程序本身并不消耗任何组织，而是从取样区域消耗少量小分子;因此，同一样本可进一步用于常规测试，即组织学或遗传学，从而获得来自同一样本的基本和补充信息。这些互补的、全面的数据将使对肿瘤生物学有了更好的了解，有望促进新的治疗目标的发现。利用这种方法，在确定目标生物标志物时，进一步增加了现场术中诊断的可能性。
下面我们介绍脑肿瘤现场采样方案，用于代谢组学和唇部分析及数据处理。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>49199</td>
			<td>Mobile phase additive, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34967</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267</td>
			<td>Mobile phase additive, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMixer MultiTube Vortexer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BV1010*</td>
			<td>Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2076</td>
			<td>Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Discoverer 2.1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>software for data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm &#215; 2.1 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>567571-U</td>
			<td>Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567502-U</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>56302</td>
			<td>Mobile phase additive, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial inserts 250ul , deactivated</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial inserts 350ul</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials 1.5ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials, 2 mL (amber, deactivated)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials, 2mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Luna 3 &#956;m, 200A, 100 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-00D-4449-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34965</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSearch 4.1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>software for data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td>Xia Lab @ McGill</td>
			<td></td>
			<td>online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34966</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Negative Ion Calibration Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726049</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm &#215; 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&#181;m,100&#197; 100 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1506570001</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1504360001</td>
			<td>Guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, C18</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>custom order</td>
			<td>comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, mixed Mode</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 HPLC systems</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5200.0345</td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1153331000</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 3.5&#956;m 2.1x75mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005644</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 &#181;m, 3.9x5 mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007813</td>
			<td>Column cartidge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

on-site sampling and extraction of brain tumors for metabolomics and lipidomics analysis

尽管可用于癌症诊断和分类的工具种类繁多，但仍然需要能够快速、简单地对肿瘤进行表征的方法。近年来，质谱学已成为将歧视性化合物作为疾病的潜在生物标志物无目标分析的方法。生物流体通常被认为是可取的基质，因为其可访问性和更容易的样品处理，而直接组织分析提供了有关给定癌症的更具选择性的信息。通过传统方法准备组织分析要复杂得多，也更耗时，因此不适合快速现场分析。目前的工作提出了一个方案，结合样品制备和提取小分子现场，立即肿瘤切除。取样装置，这是针灸针的大小，可以直接插入到组织，然后运送到附近的实验室进行仪器分析。代谢组学和唇部学分析的结果表明，建立与肿瘤、恶性肿瘤和基因突变的组理起源有关的肿瘤表型，以及选择鉴别化合物或潜在生物标志物的方法，是有能力的。该技术的非破坏性允许随后对用于 SPME 分析的相同样本进行常规使用测试（如组织学测试）的检测，从而能够获得更全面的信息以支持个性化诊断。

利用固相微萃取物作为样品制备方法，结合液相色谱，结合高分辨率质谱法和先进的数据处理软件，我们成功地对人脑肿瘤的代谢和脂质表进行了表征。该探针的大小相当于针灸针，对所研究组织造成的损害最小，且无组织消耗，因此，可以进一步将样本用于组织学或基因研究。对于反相和HILIC列，以及代谢组学和唇部分析中的电离模式，均获得了选定组的满意分离。这两种分离方法不仅在代谢组学中，而且在脂质分析中也提供了宝贵的补充数据。反向相柱将脂质与碳链长度和不饱和键的存在分开，而HILIC柱可用于分析脂质组，特别是磷脂8。
根据主要成分分析图上QC样品的紧密聚类（图3A，三个QC样本沿序列重叠注入的8个QC样本），仪器分析的可重复性非常好。此外，发现用于负对分析的提取空白与真实样品分离得很好。探测器提取的多种分析物有助于发现具有代表性的物种，从而成功地根据其组织起源、恶性肿瘤和其他因素（如遗传）来区分人类脑肿瘤。 图3B 显示了从胶质瘤和月经瘤患者身上采集的样本的唇膜数据。这些肿瘤之间的分化，其特点是不同的组织起源和恶性肿瘤，是研究的一个重要目标，因为脑瘤通常被认为是良性肿瘤，而胶质瘤是最恶性的。此外，在 图4 中，在呈现代谢组学数据时，胶质瘤根据恶性程度分为高低。这些子组与月经瘤的分子表型进行比较。在这两种情况下，都观察到了聚类的显著分离。如今，胶质瘤的诊断主要依靠确定肿瘤样本中的特定基因突变。因此，将所得结果与基因分型数据进行比较。 图 5A 显示样本与检测到的共切 1p19q 和未观察到突变的样本的分离。
统计分析还允许在研究组中选择化合物。在对适当大群进行采样的情况下，这些化合物可被视为潜在的生物标志物。然而，需要进行更深入的分析，包括通过碎片对检测到的化合物进行结论性确认，以及将检测到的物种与分析标准进行比较，才能得出具有生物学性质的明确结论。图 3C 和图5B中提供了这种鉴别 代谢物的示例。通过比较样品和真实标准的代谢物的碎裂模式，证实了这些化合物的身份，即狮身人面像：SM d36：1和丙林。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig01.jpg"> 图1：为提取过程准备的SPME纤维。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig02.jpg"> 图2：使用SPME探针提取眼皮瘤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig03.jpg"> 图3：胶质瘤和眼皮瘤的五氯苯A和盒图。包含 （ A ） 的所有分析样本的主要成分图，包括空白、提取质量控制、空白、月牙、胶质;（B） 只包含研究组（排除空白和 QC 后）;（C） 狮身人面像的盒须图： SM d36：1 区分患者与胶质瘤和肌瘤。唇部数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig04.jpg"> 图4：HGG、LGG和梅宁瘤的PCA。主要成分分析图显示 （A） 高档胶质瘤 （HGG） 和梅宁约马斯 （MEN）9 和 （B） 低品位胶质瘤 （LGG） 和梅宁约马斯之间的分化。代谢组数据转载从 Via Medica 参考9 的许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig05.jpg"> 图5：带无删除的胶质瘤的PCA和框图。（A） 主要成分分析图显示有与无共删除1p19q的患者存在差异;（B） 盒须图为蛋白素分化患者与和没有共删除 1p19q;n - 不删除，y - 带删除。代谢组学 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig05large.jpg" target="_blank">数据请点击这里查看这个数字的更大版本。</a>

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On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

手稿介绍了人类脑肿瘤的现场采样与固相微extraction，然后其生化分析，以发现生物标志物。

代谢组学和利皮多米分析脑肿瘤的现场采样与提取

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

该协议可用于使用固相微外切纤维从服务器内或旁边的脑肿瘤进行提取。该技术能够直接从切除的肿瘤中提取小分子，通过将提取设备直接耦合到分析仪器，为快速术中诊断提供了机会。为了准备固相微traction装置，根据肿瘤的大小，将每个固体相微traction装置探针的编码与混合模式或C18涂层修剪为适当的长度。在样品采集前至少浸泡探头和 50 50 甲醇水溶液至少一小时。该协议侧重于脑肿瘤，但策略可以实施为许多不同的癌症的诊断。该技术是完全便携的，因此无需任何其他设备。尽快在肿瘤切除后将探针纤维用 LCMS 级水浸入 5 秒钟，然后尽可能将纤维插入脑肿瘤组织样本，以确保整个提取阶段位于肿瘤内。将探针留在组织内精确 30 分钟，以消除由于样品肿瘤以外的来源存在伪影而导致的误差源，将条件探针纤维放在桌子上一段时间内。在萃取过程中，标记 HPLC 小瓶，用于提取后探头存储。在提取结束时，将纤维浸入 LCMS 级水中三秒钟，以清除任何血液或细胞碎片，并将每个探针插入单个 HPLC 小瓶盖的隔膜底部，以固定纤维。然后用固定纤维盖住小瓶，将小瓶放入适当的运输容器中。实验室到达后，立即将小瓶放入零下30或零下80摄氏度的冰柜中，分别不超过3年或5年。收集单个实验中的所有样本后，将含有混合模式纤维的小瓶放在室温下。并标记两毫升小瓶，用于脱吸，将一个玻璃插入到每个小瓶中，并添加 300 微升新鲜准备的 80 20 乙酰三叶酸水溶液到每个刀片。将每个探针的编码完全浸入脱吸溶剂的单个小瓶中，并在涡流上每分钟1200转，搅拌小瓶120分钟。脱吸完成后，从小瓶中取下瓶盖，从每个含有肿瘤提取物的文件中留出 10 微升等分，以制备质量控制样品。然后用新瓶盖关闭小瓶，将小瓶放入液相色谱高分辨率质谱仪的四摄氏度自动采样器中。为准备利皮多米分析样品，将含有C 18纤维的小瓶放在室温下，并标记两毫升HPLC小瓶，用于破坏将硅化玻璃插入小瓶，并在每个刀片中加入200微升新鲜准备的50 50异丙醇甲醇溶液。将每个探针涂层完全浸入溶剂中，并在涡流上以每分钟 1，200 转的速度搅拌样品 50 分钟。在时间结束时，通过去除瓶盖停止脱吸，然后从每个包含肿瘤提取物的文件中留出 10 微升等同物，以准备质量控制样品，并关闭新瓶盖。然后，将小瓶放入液相色谱高分辨率质谱仪的四摄氏度自动采样器中。基于主要成分分析图上质量控制样品的紧密聚类，确定仪器分析的可重复性非常好。这些从胶质瘤和脑膜瘤患者身上采集的样本的唇膜学数据突出了肿瘤样本根据其组织起源和恶性肿瘤进行区分的能力。正如这些代谢组学数据所示，胶质瘤可以根据其恶性程度或或存在或是否存在感兴趣的突变进一步划分。统计分析还允许在研究组内选择特定的化合物。必须仔细控制提取时间，并维护所有样品的可重复条件。或者，样品可以直接从纤维溶解到Ms，无需色谱分离，从而能够有针对性地分析特定标记，将整个过程缩短几分钟。

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