Name: on-site sampling and extraction of brain tumors for metabolomics and lipidomics analysis
Uploaded: 2020-05-31T15:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis at JoVE.com

Исследование было поддержано грантом Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 от Национального научного центра. Авторы хотели бы отметить MilliporeSigma, бизнес Merck KGaA, Дармштадт, Германия, за предоставление устройств SPME, используемых в этой работе. Бизнес Merck в области науки о жизни работает как MilliporeSigma в США и Канаде. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Thermo Fisher Scientific за доступ к масс-спектрометру "К-Точный фокус".
Вклад авторов: JB: оптимизация подготовки выборки и параметров LC-MS, производительность экспериментов SPME-LC-MS, анализ данных, статистический анализ и интерпретация данных и подготовка рукописи, связанные с липидомной частью; ПЗГ: координация и выполнение большинства проб в больнице, оптимизация параметров отбора проб и подготовки образцов, выполнение экспериментов SPME-LC-MS, анализ данных, статистический анализ и интерпретация данных, подготовка рукописей, связанных с метаболомической частью; MG – помощь в оптимизации подготовки образца, метода LC-MS и анализа данных, связанных с липидомной частью; КГ: совместное выполнение проб SPME и оптимизация отбора проб и подготовки образцов, анализ SPME-LC-MS, связанный с метаболомической частью; KC: выполнение нескольких проб SPME в больнице, помощь в оптимизации выборки, подготовке выборки и анализе данных, связанных с метаболомической частью; KJ: производительность нескольких проб SPME в больнице, помощь в липидном анализе; ДП: выполнение хирургических процедур, набор пациентов; JF: выполнение хирургических процедур, набор пациентов; MH: выполнение хирургических процедур, координация клинической части исследования; BB: концепция, координационный надзор за проектом и подготовкой рукописей, выполнение нескольких проб

<ol>
	<li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+Classification+of+Tumors+of+the+Central+Nervous+System:+a+summary.">The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Bi, W. L., Beroukhim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beating+the+odds:+extreme+long-term+survival+with+glioblastoma.">Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma.</a> Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).</li><li>Ifa, D. R., Eberlin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambient+Ionization+Mass+Spectrometry+for+Cancer+Diagnosis+and+Surgical+Margin+Evaluation.">Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation.</a> Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).</li><li>Alexander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+methodology+for+in+vivo+endoscopic+phenotyping+of+colorectal+cancer+based+on+real-time+analysis+of+the+mucosal+lipidome:+a+prospective+observational+study+of+the+iKnife.">A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife.</a> Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).</li><li>Reyes-Garc&#233;s, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Solid+Phase+Microextraction+and+Perspective+on+Future+Directions.">Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions.</a> Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).</li><li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Solid Phase Microextraction. , (2009).</li><li>Vuckovic, D., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Evaluation+of+Solid-Phase+Microextraction+Coatings+for+Untargeted+Metabolomic+Profiling+of+Biological+Fluids+by+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry.">Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).</li><li>Cajka, T., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+lipids+in+biological+systems+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).</li><li>Gory&#324;ska, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+brain+tumour+metabolomic+analysis.">A new strategy for brain tumour metabolomic analysis.</a> Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).</li><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Fernandes, M., Rosel, D., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+in+solid+cancer:+are+size-based+response+criteria+an+anachronism.">Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism.</a> Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).</li><li>L&#228;mmerhofer, M., Weckwerth, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , (2013).</li><li>Lendor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Microextraction-+Based+Miniaturized+Probe+and+Protocol+for+Extraction+of+Neurotransmitters+from+Brains+in+Vivo.">Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo.</a> Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).</li><li>Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Free+Drug+Concentration+from+Biological+Tissue+by+Solid-Phase+Microextraction:+In+Silico+and+Experimental+Study.">Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study.</a> Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).</li><li>Looby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry+via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring.">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Нецелевые метаболомики и липидомики обычно используются в исследованиях, ориентированных на выявление биомаркеров опухоли. Однако в большинстве случаев исследователи ищут соединения, которые могут быть использованы для скрининга заболевания. Следовательно, предпочтительными биологическими образцами являются кровь или моча из-за их относительно легкого доступа. Анализ опухолевых тканей в основном проводится для понимания механизмов, стоящих за болезнью, характеризует различные типы опухолей и т.д. На месте анализ биомаркеров опухоли проводится редко, так как такие приложения требуют обширной подготовки образца. Кроме того, стратегии, основанные на анализе в режиме реального времени профилей тканей без предварительного отбора конкретных биомаркеров,привлекают внимание медицинского сообщества 3,4. Решение, представленное в настоящем подробнее, дает еще один взгляд на обработку тканей на месте, раскрывая тип информации, которую можно получить с помощью таких методов.
Сочетание выборки, подготовки образцов и экстракции делает SPME очень полезным инструментом для анализа на месте. Кроме того, отсутствие потребления тканей во время отбора проб позволяет в дальнейшем использовать те же образцы для анализа биомаркеров и рутинных испытаний (генотипирование, гистологический анализ), поэтому добавляет новую информацию к результатам стандартного тестирования. Устройство для отбора проб имеет очень простую конструкцию, его эксплуатация очень проста, и никакой специальной подготовки для выполнения самой добычи не требуется. Однако достижение надежных результатов требует гораздо большего, чем просто правильное обращение с устройствами. Чтобы правильно выполнить эксперимент, необходимо понять процесс извлечения, характер образца, и быть в курсе потенциальных ошибок, которые могут повлиять на данные.
Важно учитывать неоднородность раковых тканей10; пробы опухолей могут содержать части, проходящие некроз, кальцификации и гипоксии, и каждый из этих процессов будет отражен в метаболоме и липидоме, достигнутых, тем самым влияя на результаты. Поэтому рекомендуется проводить выборку пространственного разрешения путем вставки нескольких волокон в различные части раковой ткани, или же, чтобы более длинное покрытие было использовано для проникновения всей опухоли, чтобы получить усредненную информацию о опухоли. Если метод отбора проб пространственного разрешения осуществляется, волокна могут быть все desorbed в один растворитель desorption; это не только позволит получить общую информацию об опухоли, но и повысит чувствительность анализа. Кроме того, desorption отдельных волокон в отдельные флаконы позволит исследования, чтобы выяснить внутреннее разнообразие опухоли головного мозга, которая состоит из ядра построен из раковых клеток, и внешняя зона, которая является границей здоровых тканей. Более глубокие части опухоли, как правило, более повреждены процессами, связанными сраком 11. Тем не менее, исследователи должны иметь в виду, что этот вариант ставит под угрозу чувствительность метода и общее количество обнаруживаемых соединений. В текущих работах использовалось 7-мм покрытие; эта длина считалась оптимальной для различных размеров опухолей, включенных в исследование. Покрытия проникали в опухоли, и, таким образом, при условии, не специальное разрешение, но усредненые данные по образцу. Независимо от выбранного протокола, важно, чтобы в течение всего исследования соблюдался один и тот же протокол, включая количество волокон, используемых для индивидуальной выборки, продолжительность покрытия, время извлечения и все другие факторы, очерченные в этой работе.
Важно контролировать качество анализа. Объединение КК (см. шаги 4.7 и 7.7 в протоколе) должно быть подготовлено и использовано для мониторинга стабильности приборов во время времени времени ирования всей партии выборки. Пустые элементы управления (см. шаг 2.8) могут быть позже использованы для подготовки "списка исключений" для устранения сигналов загрязняющих веществ, происходящих из растворителей или производства волокон. В особых случаях, таких, как риск заражения, необходимо проводить отбор проб из перчаток, столов, аппаратов или любых других поверхностей, которые могут представлять опасность загрязнения. В таких случаях, волокна подготовки, время извлечения и desorption протоколы такие же, как для образцов.
Метаболомические и липидомные анализы полностью сосредоточены на небольших молекулах (менее 1500 да), появляющихся в организме или конкретных компонентах организма, таких как специфические органы, ткани, жидкости, клетки и т.д. Метаболомические и липидомные препараты предлагают снимок биохимических изменений, происходящих в организме, а в случае рака, они интегрируют информацию, связанную с геномом, гистологией и злокачественностью опухоли. Эти науки омичи создают связь между физиологией и фенотипом, поскольку метаболиты выше в биохимической лестнице, чем белки или гены12. Понимая метаболом и липидом раковых опухолей, мы приблизимся к открытию фенотипа среди всех наук-омиков, поскольку эти отрасли исследования предлагают более глубокие знания динамических изменений молекул как реакции живых организмов на различные раздражители. Как представлено в этой работе, данные, полученные в одной выборке, соответствуют гистологии рака, степени злокачественности, и отражают изменения, происходящие на уровне генома. В глиомах, как тип рака, представляющий интерес в этом исследовании, информация, скрытая в геноме, особенно важна, так как персонализированное лечение разрабатывается на основе результатов генетических тестов. Особые мутации являются прогностические маркеры исходов химиотерапии или лучевой терапии. Как попродемонстрировано здесь, выбор биомаркеров, отражающих данный мутации, возможен с предлагаемой стратегией. Мутациотельные маркеры, а также дополнительные типы дескрипторов, такие как те, которые указывают на степень злокачественности опухоли, также могут быть использованы для поддержки обычных диагностических методов.
Химическая биопсия Ex vivo с использованием твердых фазовых микроэкстракционных волокон является первым шагом в применении метода к интраоперационной диагностике. Метод может быть легко принят для отбора проб in vivo до получения разрешения от соответствующих этических советов. В таких случаях стерилизация устройств SPME должна проводиться в соответствии с принятыми процедурами стерилизации в больнице, где проводится отбор проб, т.е. автоклавированием или стерилизацией оксида этилена. Предварительно кондиционированные и стерилизованные волокна должны храниться в запечатанных упаковках, помеченных сроком годности стерилизации. Важно отметить, что волокна не должны быть очищены с использованием сурфактантов. Такая процедура может вызвать неспецифические изменения в составе сорбента, тем самым влияя на экстракции аналитов. В исследованиях, описанных в настоящем, 30-минутный период извлечения был использован, но другие доклады подтверждают, что более короткие сроки могут дать удовлетворительные результаты в исследованиях vivo 13. Huq et al. показали, что равновесное время аналитии достигается быстрее в тканях, как сложная матрица, чем в простыхматрицах 14. Однако воспроизводимость полученных результатов может быть скомпрометирована в более короткие периоды извлечения, поскольку больше анлитов будет добываться в до равновесных условиях; поэтому необходимо осуществлять точный контроль за временем.
Обе науки омичи, эксплуатируемые в рамках этой работы, имеют отличный потенциал в качестве инструментов обнаружения биомаркеров. После выбора биомаркеров или создания хемометрической модели медицинская диагностика, основанная на определении целевых метаболитов с помощью методов, применимых для проведения исследований на месте, таких как подход SPME, описанный в этой работе, может быть разработана и реализована в рамках обычной диагностики.
В протоколе, предложенном в настоящей рукописи, описывается, как проводить нецелевых метаболимических и липидомных анализов раковых тканей с использованием твердой фазовой микроэкстракции для скрининга потенциальных биомаркеров. Он предназначен для обеспечения экстракции репрезентативных соединений, дифференциации опухолей и выявления дискриминационных соединений, характеризующих данный рак, т.е. потенциальных биомаркеров. Нецелесочных анализов с SPME описаны в этой статье представляют собой отправную точку в развитии быстрой интраоперационной диагностики, где выбранная группа соединений может быть определена без необходимости скрининга всех соединений, присутствующих в образце. В интересах быстрых диагностических результатов, зонды SPME, используемые для извлечения на месте, могут быть непосредственно соединены с аналитическими приборами, расположенными в больничном учреждении. Простые экстракции, выполняемые с минимальным препаратом образца с последующим анализом без хроматографии, значительно сократят общее время с нескольких часов до нескольких минут, как уже описано для мониторингалекарств 15.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) и компьютерная томография (КТ) являются основными методами, используемыми для анализа поражений головного мозга в режиме реального времени. Дифференциация опухоли головного мозга, как правило, основана на гистопатологии с дополнительными окрашивания и передовых иммуногистохимических методов. Согласно обновленному руководству по центральным опухолям нервного мозга, изданного Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2016 году, генетические тесты имеют решающее значение для дифференциации и классификацииэтих опухолей 1. Дифференциация и классификация опухолей позволяют врачам выбирать наиболее эффективное лечение данного типа опухоли, тем самым увеличивая продолжительность жизни пациента. К сожалению, несмотря на наличие таких передовых методов, чтобы помочь врачам в выборе оптимальной терапии для своих пациентов, продолжительность жизни пациентов с диагнозом глиобластома (глиома IV класса) составляет всего около 15-16 месяцев2. Даже с изощренностью и повышенной точностью сказал изображений и гистологических методов в качестве диагностических инструментов, по-прежнему существует большая потребность в новых методах, способных предложить дополнительную информацию для оказания помощи врачам в принятии решений, касающихся курса лечения. За последние годы было предложено несколько новых подходов, основанных на масс-спектрометрии для внутриоперационногоанализа рака 3,4. Потенциал микроэкстракции твердой фазы (SPME), метод, представленный в настоящем месте, как инструмент быстрого анализа на месте, уже был продемонстрирован в различных исследованиях5. Текущая рукопись показывает одно из клинических применений метода, нецелевые метаболомики и липидомики опухолей головного мозга человека. Нецелесоприимные исследования являются важной отправной точкой в открытии потенциальных биомаркеров. После создания, такие биомаркеры могут быть использованы в качестве диагностических ссылок для дифференциации между опухолями, используя ту же технологию в сочетании с приборами на месте.
SPME - это метод подготовки образцов на основе равновесия, который извлекает небольшие молекулы из матриц образца с использованием небольших количеств фазы экстракции. В самой традиционной конфигурации spME устройства (зонда) волокно покрыто соответствующей фазой извлечения и обездвижено на твердой опоре, т.е. металлическойпроволоке 5,6. Биосовместимые покрытия и приборы (зонды) позволяют извлечения непосредственно из сложных биологических матриц без предварительной обработки образца, например, гомогенизации и фильтрации. В процессе извлечения анализы разделены между фазой и матрицей образца пропорционально их первоначальным концентрациям. Если добыча осуществляется достаточно долго, то равновесие достигается. Хотя добыча на равновесии обеспечивает максимально возможную чувствительность и воспроизводимость, возможна и даже предпочтительнее в некоторых случаях, т.е. отбор проб in vivo, где ограничения по времени, связанные с выборкой на месте (например, операционные или аварийные отделения), требуют быстрой добычи. Профиль времени извлечения данного анализа, как правило, зависит от физико-химических свойств аналита, пробы матрицы, типа используемого сорбента и ряда других условий экстракции. Множество факторов, регулирующих их экстракции кинетики делает практически невозможным обеспечить равновесное извлечение всех соединений, когда нецелесохотные анализы, такие как метаболомика или липидомика выполняются. По вышеупомянутым причинам время извлечения текущего протокола было установлено произвольно для обеспечения удовлетворительной чувствительности и охвата метаболитов, с одной стороны, и практичности использования на месте - с другой.
Следует подчеркнуть, что очень небольшой размер зондов, используемых для извлечения образца из тканей, вызывает лишь минимальные повреждения тканей, в то время как сама процедура отбора проб не потребляет никаких тканей, а очень небольшое количество мелких молекул из отобранной области; таким образом, этот же образец может быть дополнительно использован для обычных тестов, т.е. гистологических или генетических, что позволяет получить необходимую и дополняемую информацию из одного и того же образца. Такие дополнительные, всеобъемлющие данные позволили бы лучше понять биологию опухолей, что, как мы надеемся, способствовало бы открытию новых целей лечения. Использование этого метода еще больше увеличивает возможность внутриоперационной диагностики на месте при определении целевых биомаркеров.
Ниже мы представляем протоколы отбора проб опухолей головного мозга на месте для метаболомики и липидомики анализов и обработки данных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>49199</td>
			<td>Mobile phase additive, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34967</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267</td>
			<td>Mobile phase additive, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMixer MultiTube Vortexer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>BV1010*</td>
			<td>Vortex mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2076</td>
			<td>Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound Discoverer 2.1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>software for data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm &#215; 2.1 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>567571-U</td>
			<td>Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>567502-U</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>56302</td>
			<td>Mobile phase additive, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial inserts 250ul , deactivated</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial inserts 350ul</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials 1.5ml</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials, 2 mL (amber, deactivated)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials, 2mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HILIC Luna 3 &#956;m, 200A, 100 x 2.0 mm</td>
			<td>Shim-Pol</td>
			<td>PHX-00D-4449-B0</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34965</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidSearch 4.1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>software for data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td>Xia Lab @ McGill</td>
			<td></td>
			<td>online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34966</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Negative Ion Calibration Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726049</td>
			<td>Mass Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm &#215; 2.0 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>KJ0-4282</td>
			<td>Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&#181;m,100&#197; 100 x 2.1 mm</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1506570001</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>1504360001</td>
			<td>Guard column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, C18</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>custom order</td>
			<td>comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPME LC fiber probes, mixed Mode</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 HPLC systems</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5200.0345</td>
			<td>HPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1153331000</td>
			<td>HPLC solvent, LCMS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 3.5&#956;m 2.1x75mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186005644</td>
			<td>HPLC Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 &#181;m, 3.9x5 mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007813</td>
			<td>Column cartidge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

on-site sampling and extraction of brain tumors for metabolomics and lipidomics analysis

Несмотря на разнообразие инструментов, доступных для диагностики и классификации рака, методы, которые позволяют быстро и простой характеристики опухолей по-прежнему нуждаются. В последние годы масс-спектрометрия стала можно сделать выбор для нецелевого профилирования дискриминационного соединения в качестве потенциальных биомаркеров заболевания. Биофлюиды, как правило, рассматриваются как предпочтительные матрицы, учитывая их доступность и более легкую обработку образцов, в то время как прямое профилирование тканей обеспечивает более избирательную информацию о данном раке. Подготовка тканей к анализу традиционными методами гораздо сложнее и трудоемка, а значит, не подходит для быстрого анализа на месте. Текущая работа представляет собой протокол, сочетающий подготовку образца и экстракцию небольших молекул на месте, сразу после ресекции опухоли. Устройство для отбора проб размером с иглоукалывание может быть вставлено непосредственно в ткань, а затем доставлено в ближайшую лабораторию для инструментального анализа. Результаты метаболомических и липидомических анализов демонстрируют способность подхода к установлению фенотипов опухолей, связанных с гистологическим происхождением опухоли, злокачественных новообразований и генетических мутаций, а также для отбора распознавания соединений или потенциальных биомаркеров. Неразрушательный характер метода позволяет последующее выполнение регулярно используемых тестов, например, гистологических тестов, на тех же образцах, используемых для анализа SPME, что позволяет получить более полную информацию для поддержки персонализированной диагностики.

Использование твердой фазовой микроэкстракции в качестве метода подготовки образцов в сочетании с жидкой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения и передовым программным обеспечением для обработки данных позволило нам успешно охарактеризовать метаболому и липидом опухолей головного мозга человека. Таким образом, зонд, размер которого был эквивалентен игле иглоукалывания, нанес минимальный ущерб изученной ткани и отсутствие потребления тканей, что позволило продолжить использование образцов для гистологических или генетических исследований. Удовлетворительное разделение выбранных групп было получено как для обратных фазовых, так и для столбцов HILIC, а также для обоих режимов ионизации в анализах метаболомики и липидомики. Использование обоих методов разделения не только в метаболомике, но и в липидомном анализе предоставило ценные дополнительные данные. Обратный столбец фазы отделяет липиды по отношению к длине углеродных цепей и наличию ненасыщенных связей, в то время как столбец HILIC полезен для профилирования липидных групп, особенно фосфолипидов8.
Воспроизводимость инструментального анализа была признана очень хорошей на основе плотной кластеризации образцов КК на основной участок анализа компонентов(рисунок 3A, три образца КК вводили каждые восемь образцов пациентов вдоль перекрытия последовательности). Кроме того, были обнаружены пробелы для извлечения, используемые для отрицательного контрольного анализа, которые хорошо отделялись от реальных образцов. Широкий спектр анализов, извлеченных зондами, способствовал открытию репрезентативных видов, что позволило успешно провести дифференциацию опухолей головного мозга человека на основе их гистологического происхождения, злокачественности и других факторов (например, генетических). На рисунке 3B показаны данные липидомики для образцов, взятых у пациентов с глиомами и менингиомами. Включение дифференциации между этими опухолями, которые характеризовались различным гистологическим происхождением и злокачественностью, было важной целью исследования, так как менингиомы обычно рассматриваются как доброкачественные опухоли, в то время как глиомы являются одними из самых злокачественных. Кроме того, на рисунке 4, представляя данные метаболомики, глиомы были разделены на основе степени злокачественности на высокие и низкие. Эти подгруппы сравнивались с молекулярным фенотипом менингиом. В обоих случаях наблюдалось заметное разделение кластеров. В настоящее время диагностика глиомы в первую очередь основывается на определении специфических генетических мутаций в образцах опухолей. Таким образом, полученные результаты были сопоставлены с генотипированием данных. На рисунке 5A представлено разделение образцов с обнаруженным совместное удаление 1p19q и образцы, где мутации не наблюдалось.
Статистический анализ также позволяет отвечать соединения в изученных группах. Эти соединения могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров в тех случаях, когда отдается выборка достаточно большой когорты. Однако для того, чтобы сделать окончательные выводы биологического характера, необходим более углубленный анализ, включая окончательное подтверждение обнаруженных соединений путем фрагментации и сопоставления обнаруженных видов с аналитическими стандартами. Примеры таких дискриминантных метаболитов представлены на рисунке 3C и рисунке 5B. Идентичность этих соединений, т.е. сфингомиелина: SM d36:1 и пролина, была подтверждена путем сравнения моделей фрагментации метаболитов из выборки и подлинных стандартов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig01.jpg"> Рисунок 1: Волокна SPME, подготовленные для процесса экстракции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig02.jpg"> Рисунок 2: Извлечение менингиомы с помощью зондов SPME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig03.jpg"> Рисунок 3: PCA и коробки участков для глиомы и менингиомы. Основной участок анализа компонентов,содержащий ( A) все проанализированные образцы, включая пробелы, экстракции КК, пробелы, менингиомы, глиомы; (B)содержащие только изученные группы (после исключения пробелов и КК); (C) коробка усы участок для сфингомиелин: SM d36:1 дифференциации пациента с глиомой и менингиомой. Липидомные данные. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig04.jpg"> Рисунок 4: PCA для HGG, LGG и менингиомы. Основной участок анализа компонентов,показывающий дифференциациюмежду ( A ) глиомами высокого класса (HGG) и менингиомами (MEN)9 и (B) низкосортными глиомами (LGG) и менингиомами. Метаболомики данные перепечатаны из Via Medica ref9 с разрешения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig05.jpg"> Рисунок 5: PCA и коробки участков для глиомы с и без удаления. (A)Основной участок анализа компонентов показал различия у пациентов с и без совместного удаления 1p19q; (B) коробка усы участки для proline дифференцированных пациентов с и без совместного удаления 1p19q; n-без удаления, y-с удалением. Данные метаболомики <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis at JoVE.com

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Рукопись представляет на месте выборки опухолей головного мозга человека с твердой фазы микроэкстракции следуют их биохимического профилирования к открытию биомаркеров.

Выборка и удаление опухолей головного мозга для метаболомики и липидомического анализа

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Этот протокол может быть использован для выполнения извлечения из опухолей головного мозга в или рядом с сервером на использовании твердых волокон микроэкстракции фазы. Этот метод позволяет экстракции малых молекул непосредственно из ресектных опухолей и предоставляет возможность для быстрой интраоперационной диагностики путем соединения экстракции устройств непосредственно с аналитическими приборами. Чтобы подготовить твердое устройство микроэкстракции фазы, обрезать кодирование каждого твердого микроэкстракционного устройства зонда со смешанным режимом или C18 покрытий соответствующей длины в зависимости от размера опухоли.И замочите зонды и 50 50 метанол воды раствор, по крайней мере за один час до сбора проб. Этот протокол фокусируется на опухолях головного мозга, но стратегия может быть реализована для диагностики многих различных видов рака. Технология полностью портативная, поэтому нет необходимости в каких-либо дополнительных устройствах.Как можно скорее после удаления опухоли погрузить зонд волокон с LCMS класса воды в течение пяти секунд, прежде чем вставить волокна, насколько это возможно в образец опухолевой ткани головного мозга, чтобы убедиться, что вся фаза экстракции находится внутри опухоли. Оставьте зонды в тканях ровно на 30 минут, чтобы устранить источники ошибок из-за присутствия артефактов из других источников, кроме образца опухоли, место условных волокон зонда на столе в течение того же периода времени. Во время извлечения, этикетка HPLC флаконы, которые будут использоваться для хранения зонда после извлечения.В конце извлечения, погрузить волокна в lcMS класса воды в течение трех секунд, чтобы удалить кровь или клеточный мусор и вставить каждый зонд через дно септы одного HPLC флакон крышка для обездвиживания волокон. Затем крышка флаконы с обездвиженными волокнами и поместите флаконы в соответствующий транспортный контейнер. По прибытии в лабораторию немедленно поместил флаконы в морозильную камеру минус 30 или минус 80 градусов по Цельсию в течение не более трех или пяти лет соответственно.После того, как все образцы из одного эксперимента были собраны, поместите флаконы, содержащие смешанные волокна режима при комнатной температуре. и этикетки два миллилитров флаконы для desorption место стеклянную вставку в каждый флакон и добавить 300 микролитров свежеприготовленных 80 20 ацетонитриль воды раствор для каждой вставки. Полностью погружен кодирование каждого зонда в отдельные флаконы растворителя desorption и агитировать флаконы в течение 120 минут при 1200 оборотов в минуту на вихре.После того, как desorption завершена, удалить шапки из флаконов и выделить 10 микролитер aliquots из каждого файла, содержащего экстракт из опухоли, чтобы подготовить образец контроля качества. Затем закройте флаконы новыми колпачками и поместите флаконы в четырехградсовой автоматический пробоотборитель жидкого хроматографии высокого разрешения масс-спектрометра. Для подготовки образцов для Липидомического анализа поместите флаконы, содержащие волокна C 18 при комнатной температуре, и наклейте два миллилитровых флакона HPLC на место нарушения силанизированных стеклянных вставок во флаконы и добавьте 200 микролитров свежеприготовленного 50 50 раствора изопропанола метанола в каждую вставку.Полностью погрузить каждый зонд покрытие в растворитель и агитировать образцов в течение 50 минут на 1200 оборотов в минуту на вихре. В конце времени, остановить desorption путем удаления шапки, а затем выделить 10 микролитер aliquots из каждого файла, содержащего экстракт из опухоли, чтобы подготовить образец контроля качества и закрыть флаконы с новыми крышками. Затем поместите флаконы в четырехградсовой автоматический сэмплер жидкой хроматографии высокого разрешения масс-спектрометра.Было установлено, что воспроизводимость инструментального анализа весьма хороша на основе плотной кластеризации образцов контроля качества на основных участках анализа компонентов. Эти липидомные данные для образцов, собранных у пациентов с глиомами и менингиомами, подчеркивают способность образцов опухоли различаться в зависимости от их гистологического происхождения и злокачественности. Как показано на этих метаболомных данных, глиомы могут быть дополнительно разделены в зависимости от степени злокачественности и или в зависимости от наличия или отсутствия мутаций, представляющих интерес.Статистический анализ также позволяет отвечать конкретные соединения в рамках изучаемых групп. Необходимо тщательно контролировать время извлечения и поддерживать воспроизводимые условия для всех образцов. Кроме того, образцы могут быть растворены из волокна непосредственно г-жа без хроматографического разделения позволяет целевой анализ конкретных маркеров и сокращение всей процедуры до нескольких минут.

Research

JoVE Journal

Medicine

Thermal Ablation for the Treatment of Abdominal Tumors

Тепловые абляции для лечения опухолей брюшной

Percutaneous thermal ablation is an emerging treatment option for many tumors of the abdomen not amenable to conventional treatments. During a thermal ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Создание и распространение опухолей человека Ретинобластома в иммунодефицитных мышей

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

Бедренная артериального и венозного Катетеризация для забора крови, медикаментов и сознавая, кровяное давление и измерения пульса

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Протокол генной индукции и визуализации доброкачественных и инвазивных опухолей в Cephalic комплексов<em&gt; Дрозофилы</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

В Vivo визуализация пространственного распределения опухолей головного мозга и артрита использованием флуоресцентных SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Создание Анатомически точного и воспроизводимого внутричерепного Ксенотрансплантаты человека опухолей головного мозга

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Экс Vivo Лечение отклика первичных опухолей и / или связанных метастазов для доклинических и клинических развития Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Устные биопленки выборки для анализа микрофлора в здоровых детей

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Улучшение модели свинину инфаркт миокарда закрытой груди путем стандартизации процедур отбора проб крови и тканей

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...