Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

Forfatterne anerkender medlemmerne af Center i Regenerativ Medicin ved QUT, især Antonia Horst og Pawel Mieszczanek for deres nyttige forslag og feedback. Dette arbejde blev støttet af QUT's Postgraduate Research Award for SE og af Australian Research Council (ARC) under tilskudsaftale IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB blev støttet af et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

CM og DWH er grundlæggere og aktionærer i Gelomics Pty Ltd. CM er også direktør for Gelomics Pty Ltd. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, der er relevante for emnet for denne artikel. Forfatterne har ingen andre relevante tilknytninger eller økonomisk involvering med nogen organisation eller enhed med en økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materialerne, der diskuteres i artiklen, bortset fra dem, der er beskrevet.

Pipettering af viskøse materialer, især hydrogeler til biomedicinske anvendelser19,20,21,33,47, er rutinemæssige opgaver i mange forskningslaboratorier for at forberede en brugerdefineret koncentration eller en fortyndingsserie med varierende koncentrationer. Selvom det er gentagende, og udførelsen er ret enkel, udføres den for det meste manuelt med lav prøvegennemstrømning18. Denne vejledning introducerer driften af en open source-arbejdsstation, der er specielt designet til viskøse materialer, for at muliggøre automatiseret blanding af viskøse materialer til reproducerbar generering af ønskede koncentrationer. Denne arbejdsstation er optimeret til pipettering af hydrogeler for at muliggøre automatiseret og yderst pålidelig håndtering ved integration af temperaturdokker til termoresponsive materialer, positive forskydningspipetter til viskøse materialer og en valgfri tipberøringsdock for at fjerne overskydende materiale fra spidsen. Pipetteringsmodulet er specifikt optimeret til at muliggøre behandling af tyktflydende materiale på en standardiseret og automatiseret måde. Sammenlignet med luftpudepipetter (figur 5a) dispenserer positive fortrængningspipetter (figur 5b) viskøse materialer uden at efterlade restmateriale tilbage i spidsen, hvilket resulterer i nøjagtige aspirerings- og dispenseringsvolumener. Den valgfri spidsberøringsdock fjerner overskydende prøvemateriale fra spidsen (figur 5c,d), hvilket er nyttigt til limmaterialer (f.eks. 4% (w/v) alginat).
Protokoldesignerapplikationen er specielt programmeret til hydrogeler og tillader fortynding af op til fire reagenser med forskellige koncentrationer og op til to fortyndingsmidler. Risikoen for fejl i beregningen af endelige fortyndinger forhindres i denne applikation, da brugerne kun vælger den ønskede koncentration eller de serielle fortyndingstrin. Påkrævede aspirerings- og dispenseringsenheder beregnes automatisk, gemmes i en separat dokumentationstekstfil og udfyldes derefter i protokolscriptet. Denne protokoldesignapplikation giver brugeren fuld kontrol over alle eksperimentelle parametre (f.eks. Pipetteringshastighed) og sikrer intern dokumentation af de vigtige parametre. Protokoldesignappen tager højde for reservoirets påfyldningsniveau (f.eks. Brønd) og varierer aspirerings-/dispenseringshøjden for at forhindre unødvendig dypning i de viskøse materialer. Denne integrerede funktion undgår materialeakkumulering på spidsens ydervæg og sikrer derved pålidelige aspirerings- og dispenseringsopgaver i hele protokollen. Selvom protokoldesignerapplikationen er udviklet til hydrogelfortyndingstrin, kan den også bruges til fortynding af ikke-viskøse væsker, såsom Orange G-farvestoffer. Protokoldesignerapplikationen, som er tilgængelig via lageret under »/examples/publication-JoVE«, er den version, der forklares i protokolafsnittet og fremhæves i videoen. Denne version opdateres ikke. En opdateret version af protokoldesignerprogrammet er dog tilgængelig via hovedlagersiden. Kalibreringsterminalen blev oprindeligt udviklet af Sanderson48 og er optimeret til kalibrering af positive fortrængningspipetter.
Som beskrevet i protokolafsnit 4 skal pipetter såvel som beholdere kalibreres i første omgang. Denne kalibreringsproces er afgørende for at definere og gemme de positioner, som derefter bruges til at beregne bevægelsesintervallerne. Derfor er en vellykket protokoludførelse afhængig af veldefinerede kalibreringspositioner, da forkerte kalibreringspunkter kan resultere i, at spidsen styrter ned i en beholder. Da pipetternes stempelpositioner skal kalibreres manuelt, afhænger pipetteringsnøjagtigheden og -præcisionen i høj grad af den udførte kalibrering. Disse kalibreringsprocedurer afhænger i høj grad af brugeroplevelsen med pipetteringsmodulet, og derfor anbefales uddannelse med erfarent personale i begyndelsen for at sikre korrekte kalibreringsprocedurer. Ud over den manuelle kalibrering på pipetteringsmodulet skal selve pipetten kalibreres for at sikre nøjagtig pipettering. Det anbefales at kalibrere pipetterne mindst hver 12. måned for at opfylde acceptkriterierne som specificeret i ISO 8655. For at evaluere pipettekalibreringen internt er validering og verifikation tilgængelig som beskrevet af Stangegaard et al.16.
For at kunne frembringe et pålideligt datasæt er det afgørende at starte med reagenser af høj kvalitet. Dette er især vigtigt for hydrogelbehandlingsopgaver, da batch-til-batch-variationer kan påvirke de genererede resultater inden for denne protokol. Ud over batch-til-batch-variationer kan subtile ændringer i fremstillingen af små mængder også bidrage til egenskabsforskelle. For at forhindre dette anbefales fremstilling af større mængder, som kan bruges til hele forsøgene.
Validerings- og verifikationsprocedurerne er afhængige af brugen af et farvestof til at identificere pålidelige blandinger. Den præsenterede protokol beskriver anvendelsen af Orange G, men den generelle protokol- og analysearbejdsgang kan også tilpasses fluorescerende farvestoffer49,50. Brugen af Orange G reducerer spektrofotometerets tekniske krav og eliminerer forholdsregler, der træffes for at forhindre blegning af de fluorescerende farvestoffer efter udsættelse for lys. Problemer i opløsningsadfærd eller klyngedannelse af farvestoffet er ikke blevet observeret med de præsenterede materialer under forsøg, men kan forekomme med andre materialer. Potentiel klyngedannelse og dermed interaktionen mellem farvestof og materiale kunne let detekteres med et mikroskop.
De procedurer og teknikker, der præsenteres i denne vejledning, tilføjer automatiseringskapacitet til aktuelle arbejdsgange for viskøse materialer for at opnå meget pålidelige opgaver med minimal menneskelig arbejdskraft. Den medfølgende fejlfindingstabel (tabel 2) indeholder identificerede problemer og præsenterer mulige årsager samt løsninger til løsning af problemerne. Den præsenterede arbejdsstation er blevet anvendt med succes på naturlige (gelatine, gellangummi, matrigel) og syntetiske (f.eks. Poly(ethylenglycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialer til automatiserede pipetteringsopgaver. Især vil kombinationen af en open source-arbejdsstation og en open source-protokoldesignapplikation designet til viskøse materialer være meget nyttig for forskere, der arbejder inden for biomedicinsk teknik, materialevidenskab og mikrobiologi.

Reproducerbarhed og replikabilitet er af afgørende betydning i videnskabeligt arbejde1,2,3,4. Nylige beviser har imidlertid fremhævet betydelige udfordringer med at gentage biomedicinske undersøgelser med stor effekt inden for grundlæggende videnskab såvel som translationel forskning4,5,6,7. Faktorer, der bidrager til irreproducerbare resultater, er komplekse og mangfoldige, såsom dårligt eller forudindtaget undersøgelsesdesign6,8, utilstrækkelig statistisk effekt3,9, manglende overholdelse af rapporteringsstandarder7,10,11, pres for at offentliggøre6 eller utilgængelige metoder eller softwarekode6,9 . Blandt dem er subtile ændringer i protokollen og menneskelige fejl i udførelsen af eksperimenter blevet identificeret som yderligere elementer, der tegner sig for irreproducerbarhed4. F.eks. indfører manuelle pipetteringsopgaver intra- og interpersonlig unøjagtighed12,13 og øger sandsynligheden for menneskelige fejl14. Mens kommercielle væskehåndteringsrobotter er i stand til at overvinde disse ulemper og har vist øget pålidelighed for væsker15,16,17, er automatiseret håndtering af materialer med betydelige viskøse egenskaber stadig udfordrende.
Kommercielle væskehåndteringsrobotter bruger almindeligvis luftpudepipetter, også kendt som luftstempel eller luftfortrængningspipetter. Reagenset og stemplet adskilles af en luftpude, der krymper under dispenseringstrin og udvider sig under aspirerende trin. Ved hjælp af luftpudepipetter 'flyder' viskøse materialer kun langsomt ind og ud af spidsen, og tidlig tilbagetrækning af pipetten fra reservoiret kan resultere i aspiration af luftbobler. Under dispenseringsopgaver efterlader det tyktflydende materiale en film på den indvendige spidsvæg, som kun 'flyder' langsomt eller slet ikke, når det tvinges af luft. For at overvinde disse problemer blev positive forskydningspipetter introduceret kommercielt for aktivt at ekstrudere det viskøse materiale ud af spidsen ved hjælp af et solidt stempel. Selv om disse positive fortrængningspipetter muliggør nøjagtig og pålidelig håndtering af viskøse materialer, er automatiserede løsninger med positive fortrængningspipetter stadig for dyre til akademiske laboratorieindstillinger, og derfor er de fleste arbejdsgange med tyktflydende materialer udelukkende afhængige af manuelle pipetteringsopgaver18.
Generelt defineres viskositet som en væskes modstandsdygtighed over for strømning, og viskøse materialer defineres yderligere som materialer med større viskositet af vand (0,89 mPa·s ved 25 °C). Inden for biomedicinske anvendelser indeholder eksperimentelle opsætninger ofte flere materialer med en større viskositet end vand, såsom dimethylsulfoxid (DMSO; 1,99 mPa·s ved 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s ved 25 °C for 90 % glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s ved 25 °C) og vandsvulmede polymerer, benævnt hydrogeler19 20. Hydrogeler er hydrofile polymernetværk arrangeret i en fysisk eller / og kemisk tilstand, der anvendes til forskellige anvendelser, herunder celleindkapsling, lægemiddelafgivelse og bløde aktuatorer19,20,21,22. Hydrogelernes viskositet afhænger af polymerkoncentrationen og molekylvægten19. Rutinemæssigt anvendte hydrogeler til biomedicinske anvendelser udviser viskositetsværdier mellem 1 og 1000 mPa·s, mens specifikke hydrogelsystemer er blevet rapporteret med værdier på op til 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmålinger af hydrogeler er imidlertid ikke standardiseret med hensyn til måleprotokol og prøveforberedelse, og derfor er viskositetsværdier mellem forskellige undersøgelser vanskelige at sammenligne.
Da kommercielt tilgængelige automatiserede løsninger, der er specielt designet til hydrogeler, enten mangler eller er for dyre, afhænger de nuværende arbejdsgange for hydrogel af manuel håndtering18. For at forstå begrænsningerne i den nuværende manuelle arbejdsgang for pipettering af hydrogeler er det vigtigt at forstå vigtige håndteringsopgaver18. For eksempel, når et nyt hydrogelmateriale er blevet syntetiseret, genereres en ønsket koncentration eller en fortyndingsserie med varierende koncentrationer for at identificere pålidelige synteseprotokoller og tværbindingsegenskaber med efterfølgende analyse af de mekaniske egenskaber25,26,27,28 . Generelt fremstilles eller købes en stamopløsning og blandes derefter med et fortyndingsmiddel og/eller andre reagenser for at opnå en blanding. Blandingsopgaverne udføres for det meste ikke direkte i en brøndplade (eller noget outputformat) og udføres snarere i et separat reaktionsrør, der almindeligvis betegnes som mastermix. Under disse forberedelsesopgaver kræves forskellige aspirerings- og dispenseringstrin for at overføre det eller de viskøse materialer, blande reagenserne og overføre blandingen til et udgangsformat (f.eks. En 96 brøndplade). Disse opgaver kræver en stor mængde menneskeligt arbejde18, lange eksperimentelle timer og øger sandsynligheden for menneskelige fejl, der potentielt kan manifestere sig som unøjagtige resultater. Desuden forhindrer manuel håndtering effektiv forberedelse af høje prøvenumre til at screene forskellige parameterkombinationer for detaljeret karakterisering. Den manuelle behandling hindrer også brugen af hydrogeler til screeningsapplikationer med høj kapacitet, såsom identifikation af lovende forbindelser under lægemiddeludvikling. De nuværende manuelle forberedelsestrin er ikke mulige at screene lægemiddelbiblioteker, der består af tusindvis af lægemidler. Af disse grunde er automatiserede løsninger nødvendige for at tilvejebringe en effektiv udviklingsproces og muliggøre en vellykket oversættelse af hydrogeler til lægemiddelscreeningsapplikationer.
For at gå fra manuelt baserede arbejdsgange til automatiserede processer har vi optimeret en kommerciel open source-pipetteringsrobot til håndtering af viskøse materialer ved at integrere temperaturdokker til termoresponsive materialer, brugen af hylden positive fortrængningspipetter ved hjælp af kapillære stempelspidser og en valgfri tipberøringsdock til rengøring af pipettespidser. Denne pipetteringsrobot er blevet yderligere integreret som pipetteringsmodul i en nyudviklet open source-arbejdsstation, som består af moduler, der er klar til installation og kan tilpasses18,29. Detaljerede monteringsinstruktioner til den udviklede arbejdsstation, herunder hardware- og softwarefiler, er frit tilgængelige fra GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) og Zenodo-lageret (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Ud over hardwareudviklingen er en open source-protokoldesignapplikation blevet programmeret og frigivet til at guide brugeren gennem parametervalgsprocessen og generere en klar til brug protokolkode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denne kode kører på den kommercielle open source pipetteringsrobot såvel som på den udviklede open source-arbejdsstation.
Heri gives en omfattende tutorial om driften af open source-arbejdsstationen til automatisering af blandingsopgaver for viskøse materialer (figur 1). De tutorial-specifikke protokoltrin kan udføres med den udviklede open source-arbejdsstation såvel som den kommercielle open source pipetteringsrobot. Understøttet af en internt udviklet open source-protokoldesignapplikation demonstreres automatiseret blanding og forberedelse af krævede koncentrationer for glycerol, gelatinemethacyloyl (GelMA) og alginat. Glycerol er valgt i denne vejledning, da den er godt karakteriseret30,31, den er billig og let tilgængelig, og derfor bruges den almindeligvis som viskøst referencemateriale til automatiserede pipetteringsopgaver. Som eksempler på hydrogeler, der anvendes i biomedicinske anvendelser, er GelMA og alginathydrogelprækursoropløsninger blevet anvendt til automatiserede blandingsforsøg. GelMA præsenterer en af de mest almindeligt anvendte hydrogeler til celleindkapslingsundersøgelser32,33, og alginat blev udvalgt i denne undersøgelse for at demonstrere evnen til at fremstille dobbeltnetværkshydrogeler34,35. Ved hjælp af Orange G som farvestof blev der implementeret en hurtig og billig procedure for at validere og verificere blandingsresultaterne med et spektrofotometer16.
En kommerciel open source pipetteringsrobot er blevet integreret som pipetteringsmodul i den udviklede open source-arbejdsstation (figur 2a), og derfor bruges navnet 'pipetteringsmodul' yderligere til at beskrive pipetteringsrobotten. En detaljeret beskrivelse af den installerede hardware ligger uden for denne protokols anvendelsesområde og er tilgængelig via de medfølgende lagre, som også indeholder trinvise instruktioner til generalforsamlingen af open source-platformen. Pipetteringsmodulet kan udstyres med to pipetter (enkelt- eller 8-kanals pipette), som er monteret på akse A (højre) og akse B (venstre) (figur 2b). Pipetteringsmodulet tilbyder en kapacitet på 10 dæk i henhold til American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, og følgende placeringspositioner er defineret på dækket: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). For at starte fotoinduceret polymerisation af hydrogelopløsninger kræves et separat tværbindingsmodul og er blevet tilføjet til arbejdsstationen. Tværbindingsmodulet er udstyret med lysdioder med en bølgelængde på 400 nm, og derfor kan stoffer, der ophidser ved en synlig lysbølgelængde, anvendes med de nuværende systemer, såsom lithiumphenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) af lysdioderne kan adresseres af brugeren i protokoldesignapplikationen for at studere tværbindingsadfærden38. Arbejdsstationen indeholder også et lagermodul, der muliggør øgede gennemløbsundersøgelser; Dette modul anvendes imidlertid ikke i denne undersøgelse og er derfor ikke yderligere beskrevet. Generelt anbefales det at betjene pipetteringsmodulet i et biologisk sikkerhedsskab for at undgå prøvekontaminering. Det vigtigste strømkredsløb til betjening af pipetteringsmodulet er et 12 V kredsløb, der betragtes som en lavspændingsapplikation i de fleste lande. Alle elektriske komponenter er baseret på en dedikeret kontrolboks, der forhindrer brugere i at komme i kontakt med kilden til en elektrisk fare.
Ved at følge disse standardiserede blandingsprotokoller er forskere i stand til at opnå pålidelige blandinger til viskøse såvel som ikke-viskøse materialer på en automatiseret måde. Open source-tilgangen giver brugerne mulighed for at optimere blandingssekvenser og dele nyudviklede protokoller med samfundet. I sidste ende vil denne tilgang lette screeningen af flere parameterkombinationer for at undersøge den indbyrdes afhængighed mellem forskellige faktorer og dermed fremskynde den pålidelige anvendelse og udvikling af viskøse materialer til biomedicinske anvendelser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Nuværende blandingstrin af viskøse materialer er afhængige af gentagne og tidskrævende opgaver, der hovedsageligt udføres manuelt i en tilstand med lav gennemstrømning. Disse problemer repræsenterer ulemper i arbejdsgange, der i sidste ende kan resultere i irreproducerbarhed af forskningsresultater. Manuelt baserede arbejdsgange begrænser yderligere fremskridt og udbredt vedtagelse af viskøse materialer, såsom hydrogeler, der anvendes til biomedicinske applikationer. Disse udfordringer kan overvindes ved at bruge automatiserede arbejdsgange med standardiserede blandingsprocesser for at øge reproducerbarheden. I denne undersøgelse præsenterer vi trinvise instruktioner til at bruge en open source-protokoldesigner, til at drive en open source-arbejdsstation og til at identificere reproducerbare blandinger. Specifikt guider open source-protokoldesigneren brugeren gennem det eksperimentelle parametervalg og genererer en klar til brug protokolkode til betjening af arbejdsstationen. Denne arbejdsstation er optimeret til pipettering af viskøse materialer for at muliggøre automatiseret og yderst pålidelig håndtering ved integration af temperaturdokker til termoresponsive materialer, positive forskydningspipetter til viskøse materialer og en valgfri tipberøringsdock for at fjerne overskydende materiale fra pipettespidsen. Validering og verifikation af blandinger udføres ved en hurtig og billig absorbensmåling af Orange G. Denne protokol præsenterer resultater for at opnå 80% (v / v) glycerolblandinger, en fortyndingsserie for gelatinemethacyloyl (GelMA) og dobbeltnetværkshydrogeler på 5% (w / v) GelMA og 2% (w / v) alginat. Der medfølger en fejlfindingsvejledning, der hjælper brugerne med at vedtage protokoller. Den beskrevne arbejdsgang kan anvendes bredt på en række viskøse materialer for at generere brugerdefinerede koncentrationer på en automatiseret måde.

Denne vejledning præsenterer resultater for eksperimenter med glycerol (figur 3) og GelMA med LAP og alginat (figur 4).
Frembringelsen af en 80 % (v/v) glycerolopløsning blev undersøgt enten uden temperaturregulering (stuetemperatur, 22 °C) og uden spidsberøring (defineret som opsætning 1), med temperaturregulering (40 °C) og uden spidsberøring (opsætning 2) eller med temperaturregulering (40 °C) og med spidsberøring (opsætning 3) (figur 3a-i). Disse to temperaturindstillinger blev valgt for at evaluere håndteringsforskellen, da glycerols viskositet falder næsten med en faktor 3 ved opvarmning fra 22 °C (139,5 mPa·s) til 40 °C (46,6 mPa·s)30. En 85% (v / v) stamopløsning af glycerol blev fortyndet til en endelig koncentration på 80% og ensartet fordelt i en 96 brøndplade (n = 96 pr. Opsætning). Forsøgstiden, som omfatter dispensering af hvert materiale i blandingsrøret, de respektive blandingsopgaver og prøvefordeling i en 96 brøndplade, var 30 min 42 s. For at identificere forskelle mellem fortyndingsblandinger blev ultrarent vand - som fortyndingsmiddel for glycerol - fremstillet med 1 mg/ml Orange G. Absorbansaflæsningerne fremhæver, at integrationen af temperaturreguleringen og spidsberømningerne påvirker blandingerne betydeligt (p < 0,0001). Ud over den udførte tovejsanalyse af varians (ANOVA) blev CV-værdierne beregnet for at evaluere den relative standardafvigelse. Variationskoefficienten beskriver en standardiseret indikator til identifikation af graden af afvigelse i forhold til gennemsnittet og udtrykkes som en procentdel. Hvis prøvemidlerne ikke er særlig interessante, men variabiliteten inden for målingerne, giver variationskoefficienten yderligere indsigt med henblik på at identificere reproducerbare blandinger46. Inden for dette eksperiment med tre forskellige opsætninger viste absorbansværdierne faldende CV-værdier fra 5,6%, 4,2% til 2,0% for henholdsvis opsætning 1, opsætning 2 og opsætning 3, hvilket demonstrerede den signifikante indflydelse af temperaturdokken og tipberøringsfunktionen på at producere pålidelige resultater (figur 3a-ii). Afbildning af prøveabsorbansværdier for opsætning 3 (prøvenummer #1 til #96 i en 96 brøndplade) giver ingen stigende eller faldende værdier under hele forsøget og indikerer derfor ingen indflydelse af prøvepositionen på absorbansværdierne (figur 3a-iii). Visualisering af dataene for hver målt brøndplade med varmekort giver yderligere indsigt i at identificere heterogeniteter for en bestemt række eller kolonne eller varierende absorbansværdier gennem dispenseringsopgaverne. De visualiserede heatmaps for de tre opsætninger viser nedsat heterogenitet på tværs af hele brøndpladerne fra opsætning 1 til opsætning 3 (figur 3b). Endelig blev replikabiliteten af den gennemførte blanding evalueret inden for otte uafhængige kørsler (figur 3c-i,ii), hvor hvert løb tog 6 min 57 s. Enkeltblandingskørsler viste lave CV-værdier mellem 1,1% og 2,6%, hvilket indikerer meget pålidelige blandings- og dispenseringsopgaver for de enkelte kørsler. Absorbansværdier for alle otte kørsler gav en CV-værdi på 3,3% og demonstrerede reproducerbarheden af den etablerede blandingsprotokol.
GelMA-fortyndingsserien blev fremstillet ved at fortynde en 20 % (w/v) stamopløsning med PBS til 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0 % (w/v) og tilsætte LAP til en konstant koncentration på 0,15 % (w/v) (figur 4a-i), hvilket i alt tog 55 minutter 12 s. Som specificeret i det eksperimentelle protokolscript var hydrogelen tværbinding i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. For at evaluere forskellene mellem blandingerne blev PBS - som fortyndingsstof for GelMA og alginat - fremstillet med 1 mg/ml Orange G. Derfor identificeres absorbansforskellen mellem prøver inden for en blanding såvel som mellem de serielle fortyndinger med et spektrofotometer. Målte absorbansværdier for hvert koncentrationstrin er signifikant forskellige (p < 0,0001) og har meget lave CV-værdier mellem 1,2% og 3,4% i hele koncentrationstrinnene (n = 12 pr. Koncentrationstrin). Lineær regression viste høj pasform med en R²-værdi på 0,9869 (figur 4a-ii), og et varmekort bekræftede den homogene fordeling for hver koncentration og forskellen mellem koncentrationerne (figur 4a-iii). Automatiseret blanding af fire reagenser blev udført til generering af 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginat, 0,15% (w/v) LAP og PBS som fortyndingsstof uden (opsætning 2) og med (opsætning 3) berøringsspids (n = 96 for hver opsætning) med de samme tværbindingsparametre (30 s, 2,0 mW/cm2, 400 nm). Dispensering af de fire materialer, blanding og distribution i en 96 brøndplade tog 32 min 22 s. Alle forsøg med GelMA og alginat blev udført ved 37 °C for at forhindre termisk gelering, som forhindrer pipettering af GelMA. Med tip touch-indstillingen blev CV-værdien reduceret fra 5,2% til 3,4%, og især outliers i det nedre område blev forhindret ved at fjerne overskydende materiale fra spidsen (figur 4b-i). Selvom middelværdien på 1.927 og 1.944 for opsætning 2 og opsætning 3 er meget tætte, fremhæver variationskoefficienten den faldende afvigelse i forhold til middelværdien. Enkelte rækker af 96 brøndpladen kan sammenlignes med hinanden ved hjælp af en heatmapvisualisering til at detektere række- og/eller kolonneforskelle (figur 4b-ii).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig1.jpg"> Figur 1: Protokolarbejdsgang med individuelle opgaver. Den beskrevne arbejdsgang er opdelt i syv opgaver, som er opdelt i opsætning, forberedelse, udførelse og analyse. I starten skal softwaren (opgave 1) samt hardwaren (opgave 2) sættes op. Efter forberedelsen af materialerne (opgave 3) og genereringen af protokolscriptet (opgave 4) kalibreres pipetteringsmodulet ved at definere pipettens og beholderpositionerne (opgave 5). Derefter udføres protokolscriptet på arbejdsstationen (opgave 6), og validering og verifikation (opgave 7) af blandinger udføres for at evaluere blandinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig2.jpg"> Figur 2: Open source arbejdsstation og dæk opsætning af pipetteringsmodulet. a) Den udviklede arbejdsstation er inspireret af en samlebåndstilgang, hvor prøver transporteres gennem forskellige moduler, og består af følgende moduler: pipettering, tværbinding, opbevaring, transport og beregningsmodul. b) Pipetteringsmodulets dæk opstilles afhængigt af forsøgslayoutet (f.eks. brøndpladetype, rørvolumen osv.). Den viste dækopsætning blev brugt til de præsenterede eksperimenter og består af positive forskydningspipetter med et interval fra 10-100 μL (M100E) og 100-1.000 μL (M1000E), spidsstativerne med kapillære stempler (CP) til 100 μL (CP1000) og 1.000 μL (CP1000), en skraldespand, en blandebakke og en indgangsbakke til indgangsreagenserne. c) De tilgængelige dækpositioner defineres med de viste numre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig3.jpg"> Figur 3: Resultater for automatiseret pipettering af glycerolblandinger. a) Det fleksible arbejdsstationsdesign gør det muligt at evaluere tre forskellige opsætninger (i) for at identificere optimale parametre for reproducerbare resultater. (ii) Tilsætningen af en spidsberøring og opvarmning af materialet resulterede i en reduceret varianskoefficient (CV) værdier og meget reproducerbare blandinger til opsætning 3. Hvert forsøg blev udført med 96 prøver. iii) Afbildning af enkelte prøveværdier viste ingen indflydelse på pipetteringssekvensen. (b) Eksperimentelle resultater af hver opsætning blev visualiseret med varmekort for at identificere indflydelsen på rå/kolonne forskelle, kanter eller masterblanding. (c) Reproducerbarheden af opsætning 3 blev analyseret inden for otte uafhængige kørsler ved hjælp af (i) median, standardafvigelse, CV-værdi og (ii) heatmaps. Data i panelerne a-ii (n = 96) og b-i (n = 12) præsenteres med midlerne og de enkelte datapunkter. Statistisk signifikans blev defineret som ****p < 0,0001 ved hjælp af tovejs variansanalyse (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig4.jpg"> Figur 4: Resultater for blanding af opgaver med hydrogeler. a) Fra en gelatinemetacryloylopløsning (GelMA) med 20 % (w/v) blev der inden for en forsøgskørsel genereret en seriel fortynding på 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 og 0 % (w/v) inden for en forsøgskørsel under anvendelse af en 96 brøndplade (n = 12 pr. koncentration). i) Varianskoefficientværdierne (CV) varierede mellem 1,2 % og 3,4 % i de forberedte koncentrationer, og ii) lineær regression viste en høj tilpasning med en R²-værdi på 0,9869. iii) Homogene fortyndinger blev bekræftet visuelt med det genererede heatmap. b) Dobbeltnetværkshydrogeler blev genereret med 5 % (w/v) GelMA, 2 % (w/v)alginat og 0,15 % (w/v) LAP (i) med og uden spidsberøring (n = 96 for hver opsætning) og tværbundet i 30 s med en intensitet på 2,0 mW/cm2 ved 400 nm. Integrationen af tip touch resulterede i faldende CV-værdier fra 5,2% til 3,4%. (ii,iii) Heatmaps bekræfter færre afvigelser, når du bruger tip touch til at fjerne overskydende materiale fra spidsen. Data i panelerne a-i og b-i præsenteres med midlerne og de enkelte datapunkter. Statistisk signifikans blev defineret som *p < 0,05, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001 ved hjælp af envejsanalyse af varians (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig5.jpg"> Figur 5: Oversigt over forskellen i pipettetype og problemer med viskøse biomaterialer. a) Reagenset og stemplet adskilles af en luftpude, der krymper under dispenseringstrin og udvider sig under aspirerende trin. Ved aspirering og dispensering af viskøse materialer introducerer den langsomme 'strømning' problemer som luftbobler og uregelmæssig pipetteringsadfærd. b) Pipetter med positiv forskydning muliggør pålidelig opsugelse og dispensering af tyktflydende materiale ved hjælp af et stempel inde i spidsen. c) Pipettering af meget tyktflydende materialer (f.eks. 4 % alginat (w/v)) kan resultere i ophobning af overskydende materiale på spidsen, hvilket fører til unøjagtighed under forsøgene. d) Implementeringen af en simpel spidsberøringsbakke gør det muligt at fjerne det overskydende materiale på spidsen og resulterer i nøjagtige aspirerings- og dispenseringsvolumener. Dette realiseres ved at bruge indersiden af brøndpladelåget placeret på en tip rackbeholder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:font-size="9px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Materiale nr. 1 (lagerkoncentration)</td>
			<td>Endelig koncentration af materiale nr. 1</td>
			<td>Materiale nr. 2 (lagerkoncentration)</td>
			<td>Endelig koncentration af materiale nr. 2</td>
			<td>Materialer nr. 3 (lagerkoncentration)</td>
			<td>Endelig koncentration af materiale nr. 3</td>
			<td>Fortyndingsmiddel (Orange G-arbejdsløsning)</td>
			<td>Endelig orange G-koncentration i blanding</td>
			<td>Vist i figur</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol (85% (w/v))</td>
			<td>80% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>vand (1 mg/ml Orange G)</td>
			<td>0,059 mg/ml</td>
			<td>Figur 3a-c</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>0% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>2% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,85 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>4% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,75 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>6% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,65 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>8% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,55 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>10% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,45 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>12% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,35 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>14% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,25 mg/ml</td>
			<td>Figur 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>GelMA (20% (w/v))</td>
			<td>5% (m/v)</td>
			<td>Alginat (4% (w/v))</td>
			<td>2% (m/v)</td>
			<td>LAP (3% (w/v))</td>
			<td>0,15% (w/v)</td>
			<td>PBS (1 mg/mL Orange G)</td>
			<td>0,2 mg/ml</td>
			<td>Figur 4b</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Parameteroversigt for de udførte forsøg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Protokol trin</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Mulig årsag</td>
			<td>Opløsning</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1</td>
			<td>Software kan ikke installeres eller opdateres</td>
			<td>Løber tør for diskplads på SD-kort</td>
			<td>Kontroller diskplads på SD-kort. Fjern om nødvendigt unødvendige genstande, tøm papirkurven eller brug et SD-kort i passende størrelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>API kan ikke installeres</td>
			<td>Brugernes mulighed for installation er begrænset (ingen root-brugertilladelse)</td>
			<td>Brug kommandoen 'sudo' foran specificerede kommandoer for at få administratorrettigheder. I Linux er denne form for adgang kendt som superbrugeren.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.1</td>
			<td>Problemer med GelMA</td>
			<td>Funktionalisering, dialyse eller lyofilisering</td>
			<td>Detaljeret trin-for-trin protokol inklusive fejlfindingsliste tilgængelig i Loessner et al.33.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 og 6.2</td>
			<td>Arbejdsstationen reagerer ikke på kommandoer</td>
			<td>Problemer med forbindelsen</td>
			<td>Drej af alt og luk computeren. Sluk for strømforsyningen i 10 s. Tænd computeren og arbejdsstationen igen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 og 6.2</td>
			<td>Arbejdsstationen reagerer ikke på kommandoer</td>
			<td>Problemer med forbindelsen</td>
			<td>Kontroller, om computeren genkender USB-forbindelsen, og USB-porten er defineret korrekt. Sørg for, at firewall ikke forhindrer forbindelsesprocessen (se linket under tabel 2).</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 og 6.2</td>
			<td>Kan ikke åbne filen</td>
			<td>Forkert mappe</td>
			<td>Kontroller direktør (mappesti) for at sikre, at den rigtige sti bruges. Hvis en fil (f.eks. interface.py) ikke kan findes, er det sandsynligt, at den forkerte sti bruges.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Spidsen er ikke korrekt fastgjort eller falder under bevægelse</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Gentag kalibreringstrinnene for pipetten, og sørg for, at kapillærstemplet er forbundet korrekt med pipetten.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Spidsen er ikke korrekt fastgjort eller falder under bevægelse</td>
			<td>Problem med vedhæftede filer</td>
			<td>Pipetten er ikke korrekt forbundet til pipetteaksen og bevæger sig under bevægelsestrinnene. Spænd skruerne fast for at forhindre dette.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Tip aspirerer over materiale</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Gentag kalibreringen af denne bakketype for at definere højden korrekt.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Tip aspirerer over materiale</td>
			<td>Kalibreringsproblem</td>
			<td>Kontroller lydstyrken i røret, og sørg for, at lydstyrken er lig med den lydstyrke, der er defineret i protokoldesignerprogrammet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Materialet dyppes under bevægelse</td>
			<td>For meget overskydende materiale på spidsen</td>
			<td>Tilføj tip touch dock mulighed; eventuelt kan også tiden for tip touch øges.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>Materialet er fast eller for tyktflydende til pipettering</td>
			<td>Materialets termoresponsive opførsel</td>
			<td>Kontroller termoresponsiv materialekarakterisering, og juster opvarmnings- / køletemperaturen for temperaturdocken i overensstemmelse hermed.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Fejlfindingstabel med identificerede problemer, mulige årsager samt løsninger til løsning af problemerne.
Supplerende fil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/supplementary_template-analysis.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Denne protokol fungerer som en omfattende tutorial til standardiseret og reproducerbar blanding af viskøse materialer med en ny open source-automatiseringsteknologi. Der gives detaljerede instruktioner om driften af en nyudviklet open source-arbejdsstation, brugen af en open source-protokoldesigner og validering og verifikation for at identificere reproducerbare blandinger.

En open source-teknologiplatform til fremstilling af hydrogelbaserede 3D-kulturmodeller på en automatiseret og standardiseret måde

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Biomedicinsk forskning står over for en reproducerbarhedskrise, idet nye forskningsresultater sjældent oversættes til terapeutiske anvendelser. Denne protokol reducerer den menneskelige faktor og introducerer automatisering og standardisering i fremstillingen. Denne metode fokuserer specifikt på foto-tværbindbare hydrogeler til 3D-cellekulturapplikationer, da hydrogeler er blevet den mest anvendte platform inden for kræft og andre sygdomsvævsmodeller inden for det sidste årti.Vi har med succes taget fat på de nuværende hardware- og softwarebegrænsninger med udviklingen af en open source-teknologiplatform. Denne platform er specielt designet til hydrogeler og muliggør automatiserede produktionsarbejdsgange til vævsteknisk forskning. For at installere API'en skal du åbne kommandolinjegrænsefladen.For at installere arbejds-API'en skal du indtaste pip install openworkstation og trykke på Enter. For at betjene pipetteringsbiofabrikationsmodulet skal du indtaste kommandoen for at installere opentrons API. Brug derefter kommandolinjen til at åbne et Python-script og kontrollere, om begge API'er er blevet installeret.For at generere protokolkoden skal du åbne protokoldesignapplikationen for at generere et tilpasset protokolscript, der udføres af platformen. Interfacet kører på alle almindeligt anvendte internetbrowsere. Indtast protokolnavnet på opsætningssiden, og klik på Fortsæt.I opsætningen af inputbakken skal du vælge tre til fire varmeblokke for at definere inputbakken. Hvis du vil definere materialer og lagerkoncentrationer, skal du vælge Gel 1 i menuen Definer input og angive GelMA som navnet. Indstil lagerkoncentrationen til 20 % og antallet af prøver til tre, og klik på Tilføj for at gemme posterne og udfylde den første kolonne.Vælg Gel 2 i menuen Definer input, og indtast Alginat som navnet. Indstil lagerkoncentrationen til 4 % og antallet af prøver til tre, og klik på Tilføj for at gemme posterne og udfylde den anden kolonne. Når du har indstillet fotoinitiator- og fortyndingsparametrene som vist, skal du vælge fototværbinding, indstille tiden til 30 sekunder og intensiteten til to og klikke på OK. Indstil derefter brøndpladetypen til 96 brøndplade, og klik på Gruppe 1 for at tillade, at parametrene til oprettelse af dobbeltnetværkshydrogeler specificeres.Marker derefter afkrydsningsfeltet Anvend avanceret blandingsprotokol, hvis det er nødvendigt, indstil antallet af prøver til 96, og klik på Fortsæt. For at indstille dæklayoutet skal du vælge den relevante bakketype for hver slot. Når alle bakketyperne er valgt, skal du klikke på pipettens venstre boks og vælge 10 til 100 mikroliter positiv forskydning i rullemenuen.Indstil aspireringshastigheden til 600 og dispenseringshastigheden til 800. Indstil derefter pipetten rigtige parametre på samme måde. Klik derefter på Generer protokol for at generere og gemme protokolscriptet.Før du udfører protokollen, skal du sprøjte forbrugsstofferne med 70% ethanol og placere dem i henhold til den opsætning, der er defineret i brugeropsætningen. Placer reaktionsrørene med materialerne i aluminiumsblokken på temperaturdokkerne i henhold til den valgte opsætning. Sprøjt derefter dine handsker med 70% ethanol og åbn reaktionsrørene forsigtigt uden at røre ved åbnede rør.Når stofferne har nået den passende forsøgstemperatur, skal du køre den genererede protokol ved hjælp af brugergrænsefladen. Arbejdsstationen begynder med homing-processen, efterfulgt af at få en tom brøndplade fra lagermodulet. Efter fjernelse af låget fra brøndpladen transporteres pladen til næste modul.Protokollen specificerer det volumen, der pipetteres fra hver stamopløsning, og ændrer automatisk spidserne efter hvert materiale for at forhindre krydskontaminering. For at blande viskøse opløsninger på en reproducerbar måde udfører arbejdsstationen en specifik blandingsprotokol, der er optimeret til viskøse hydrogeler. Protokoldesignappen tager højde for reservoirets påfyldningsniveau og tilpasser automatisk blandehøjden for at forhindre unødvendig dypning i de viskøse materialer.Efter automatisk generering af 3D-modeller og brøndplader lukker arbejdsstationen brøndpladen med låget igen og opbevarer brøndpladen i den programmerede position i lagermodulet. Når protokollen er færdig, skal du fjerne pladen fra lagermodulet. Til validering og verifikation af den udførte protokol skal pladen lægges på et spektrofotometer og aflæses absorbansen to gange ved 450 nanometer.Når du har gemt absorbansværdierne, skal du åbne analyseregnearkfilen, der leveres som supplerende materiale i publikationen, og kopiere absorbansaflæsningerne til tabellen i rådatabladet. Klik derefter på analysearket for at se gennemsnitsværdierne, standardafvigelsen og varianskoefficienten, som automatisk beregnes og vises for en ensartet prøvefordeling for bestemte rækker og for specifikke kolonner i en 96 brøndplade. For at finde den opsætning, der sikrer en høj reproducerbarhed for glycerolopløsninger, blev protokoller genereret uden temperaturregulering og uden spidsberøring, med temperaturregulering og uden spidsberøring eller med temperaturregulering og med spidsberøring.Den beregnede variationskoefficient for de tre opsætninger afslørede en signifikant indflydelse af temperaturdokken og tip touch-funktionen, hvilket fremhævede protokollens evne til at generere meget reproducerbare resultater, når begge funktioner blev brugt. Ved hjælp af tip touch-funktionen med temperaturdocken blev standardafvigelsen reduceret betydeligt i opsætning tre. Afbildning af prøveabsorbansværdierne for opsætning tre gav ingen stigende eller faldende værdier under hele forsøget og indikerede derfor ingen indflydelse af prøvepositionen på absorbansværdierne.Dernæst blev en GelMA-fortyndingsserie fremstillet ved at fortynde en 20% GelMA-stamopløsning og vurdere forskellene mellem forskellige GelMA-fortyndinger. Absorbansværdien målt ved hvert koncentrationstrin var signifikant forskellig, og lineær regression viste en høj pasform, der bekræftede evnen til at generere forskellige koncentrationstrin. Derudover blev indflydelsen af spidsberømningerne evalueret for dobbeltnetværkshydrogeler med 5% GelMA, 2% alginat og 0,15% LAP, som automatisk blev genereret med opsætningen.Integrationen af tip touch resulterer i et betydeligt fald i standardafvigelsen, der understøtter genereringen af et reproducerbart datasæt. Visualisering af absorbansværdierne og varmekortene bekræftede den reducerede afvigelse ved brug af tip touch til at fjerne overskydende materiale fra spidsen. Vores teknologi muliggør automatisering af hydrogelfabrikation til 3D-cellekultur og vævsteknik.Det er en billig løsning til at øge gennemstrømningen og reproducerbarheden af teknisk udfordrende arbejdsgange. Ved at tilbyde en tilpasselig open source-tilgang baner denne teknologi vejen for den udbredte tilpasning af procesautomatisering inden for vævsteknisk forskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: En automatiseret platform for biomasse Enzyme Discovery og Cocktail optimering

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Ocular Platform til Test Kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Tilsætningsstof fremstilling teknik for den letkøbt og hurtig fabrikation af Hydrogel-baserede Micromachines med magnetisk lydhør komponenter

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

En Ultrahigh-overførselshastighed mikrofluid Platform for encellede Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Design af en Open Source, Low-Cost Bioink og Food Melt Ekstrudering 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Applikationer til Open Source-Mikroplade kompatible belysnings paneler

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening og identifikation af små peptider rettet mod fibroblast vækstfaktor Receptor2 ved hjælp af et Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokoller af 3D Bioprinting af gelatine Methacryloyl hydrogel baserede Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...