Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

De auteurs erkennen de leden van het Centre in Regenerative Medicine bij QUT, in het bijzonder Antonia Horst en Pawel Mieszczanek voor hun nuttige suggesties en feedback. Dit werk werd ondersteund door de Postgraduate Research Award van de QUT voor SE en door de Australian Research Council (ARC) onder subsidieovereenkomst IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB werd ondersteund door een National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).

CM en DWH zijn oprichters en aandeelhouders van Gelomics Pty Ltd. CM is ook de directeur van Gelomics Pty Ltd. De auteurs verklaren geen belangenconflict relevant te zijn voor het onderwerp van dit artikel. De auteurs hebben geen andere relevante banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financieel conflict met het onderwerp of de materialen die in het artikel worden besproken, afgezien van de openbaar gemaakte.

Pipetteren van viskeuze materialen, met name hydrogels voor biomedische toepassingen19,20,21,33,47, zijn routinetaken in veel onderzoekslaboratoria om een door de gebruiker gedefinieerde concentratie of een verdunningsreeks met verschillende concentraties voor te bereiden. Hoewel het repetitief is en de uitvoering vrij eenvoudig is, wordt het meestal handmatig uitgevoerd met een lage monsterdoorvoer18. Deze tutorial introduceert de werking van een open source werkstation, dat speciaal is ontworpen voor viskeuze materialen, om geautomatiseerde menging van viskeuze materialen mogelijk te maken voor reproduceerbare generatie van gewenste concentraties. Dit werkstation is geoptimaliseerd voor het pipetteren van hydrogels om geautomatiseerde en zeer betrouwbare verwerking mogelijk te maken door de integratie van temperatuurdokken voor thermoresponsieve materialen, pipetten met positieve verplaatsing voor viskeuze materialen en een optioneel tipaanrakingsdok om overtollig materiaal van de punt te verwijderen. De pipetteermodule is specifiek geoptimaliseerd om de verwerking van viskeus materiaal op een gestandaardiseerde en geautomatiseerde manier mogelijk te maken. In vergelijking met luchtkussenpipeten (figuur 5a) doseren pipetten met verdringer (figuur 5b) viskeuze materialen zonder restmateriaal in de punt achter te laten, wat resulteert in nauwkeurige aanzuig- en doseervolumes. Het optionele tip touch dock verwijdert overtollig monstermateriaal van de punt (figuur 5c,d), wat handig is voor lijmachtige materialen (bijv. 4% (w/v) alginaat).
De protocol designer applicatie is speciaal geprogrammeerd voor hydrogels en maakt de verdunning van maximaal vier reagentia met verschillende concentraties en maximaal twee verdunningsmiddelen mogelijk. Het risico op fouten bij de berekening van eindverdunningen wordt in deze toepassing voorkomen, omdat gebruikers alleen de gewenste concentratie of de seriële verdunningsstappen kiezen. Vereiste aspiratie- en doseervolumes worden automatisch berekend, opgeslagen in een afzonderlijk documentatietekstbestand en vervolgens ingevuld in het protocolscript. Deze protocolontwerptoepassing geeft de gebruiker volledige controle over alle experimentele parameters (bijv. Pipetteersnelheid) en zorgt voor interne documentatie van de belangrijke parameters. De protocolontwerp-app houdt rekening met het vulniveau van het reservoir (bijv. goed) en varieert de aanzuig- / doseerhoogte om onnodige onderdompeling in de viskeuze materialen te voorkomen. Deze geïntegreerde functie voorkomt materiaalophoping op de buitenwand van de tip en zorgt daardoor voor betrouwbare aanzuig- en doseertaken gedurende het hele protocol. Hoewel de protocol designer applicatie is ontwikkeld voor hydrogel verdunningsstappen, kan het ook worden gebruikt voor verdunning van niet-viskeuze vloeistoffen, zoals Orange G-kleurstoffen. De protocol designer applicatie, die toegankelijk is via de repository onder '/examples/publication-JoVE', is de versie die wordt uitgelegd in de protocol sectie en gemarkeerd in de video. Deze versie wordt niet bijgewerkt. Een bijgewerkte versie van de protocolontwerperstoepassing is echter beschikbaar via de hoofdopslagpagina. De kalibratieterminal is in eerste instantie ontwikkeld door Sanderson48 en is geoptimaliseerd voor de kalibratie van verdringerpipetjes.
Zoals beschreven in protocol paragraaf 4, moeten pipetten en containers in eerste instantie worden gekalibreerd. Dit kalibratieproces is cruciaal om de posities te definiëren en op te slaan die vervolgens worden gebruikt om de bewegingsstappen te berekenen. Daarom is een succesvolle protocoluitvoering afhankelijk van goed gedefinieerde kalibratieposities, omdat verkeerde kalibratiepunten kunnen leiden tot het crashen van de tip in een container. Aangezien de zuigerposities van de pipetten handmatig moeten worden gekalibreerd, zijn de nauwkeurigheid en precisie van het pipetteren sterk afhankelijk van de uitgevoerde kalibratie. Deze kalibratieprocedures zijn sterk afhankelijk van de gebruikerservaring met de pipetteermodule en daarom wordt aan het begin training met ervaren personeel aanbevolen om de juiste kalibratieprocedures te garanderen. Naast de handmatige kalibratie op de pipetteermodule moet de pipet zelf worden gekalibreerd om nauwkeurig pipetteren te garanderen. Het wordt aanbevolen om de pipetten ten minste om de 12 maanden te kalibreren om te voldoen aan de acceptatiecriteria zoals gespecificeerd in ISO 8655. Om de pipetkalibratie intern te evalueren, zijn validatie en verificatie beschikbaar zoals beschreven door Stangegaard et al.16.
Voor het genereren van een betrouwbare dataset is het cruciaal om te beginnen met reagentia van hoge kwaliteit. Dit is vooral belangrijk voor hydrogelverwerkingstaken, omdat batch-to-batch-variaties van invloed kunnen zijn op de gegenereerde resultaten binnen dit protocol. Naast batch-to-batch variaties kunnen subtiele veranderingen in de voorbereiding van kleine volumes ook bijdragen aan eigenschapsverschillen. Om dit te voorkomen, wordt voorbereiding van grotere volumes aanbevolen, die voor de hele experimenten kunnen worden gebruikt.
De validatie- en verificatieprocedures zijn afhankelijk van het gebruik van een kleurstof om betrouwbare mengsels te identificeren. Het gepresenteerde protocol beschrijft de toepassing van Orange G, maar het algemene protocol en de analyseworkflow kunnen ook worden aangepast aan fluorescerende kleurstoffen49,50. Het gebruik van Orange G vermindert de technische vereisten van de spectrofotometer en elimineert voorzorgsmaatregelen die zijn genomen om bleken van de fluorescerende kleurstoffen na blootstelling aan licht te voorkomen. Problemen in het oplossend gedrag of clustervorming van de kleurstof zijn niet waargenomen met de gepresenteerde materialen tijdens experimenten, maar kunnen zich voordoen met andere materialen. Potentiële clustervorming en daarmee de interactie tussen kleurstof en materiaal konden eenvoudig met een microscoop worden gedetecteerd.
De procedures en technieken die in deze zelfstudie worden gepresenteerd, voegen automatiseringsmogelijkheden toe aan de huidige workflows voor viskeuze materialen om zeer betrouwbare taken uit te voeren met minimale menselijke arbeid. De meegeleverde tabel voor probleemoplossing (tabel 2) bevat geïdentificeerde problemen en presenteert mogelijke redenen en oplossingen om de problemen op te lossen. Het gepresenteerde werkstation is met succes toegepast op natuurlijke (gelatine, gellangom, matrigel) en synthetische (bijv. Poly(ethyleenglycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialen voor geautomatiseerde pipetteertaken. Met name de combinatie van een open source werkstation en een open source protocol ontwerp applicatie ontworpen voor viskeuze materialen zal zeer nuttig zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van biomedische technologie, materiaalkunde en microbiologie.

Reproduceerbaarheid en reproduceerbaarheid zijn van het grootste belang in wetenschappelijk werk1,2,3,4. Recent bewijs heeft echter aanzienlijke uitdagingen aangetoond bij het herhalen van biomedische studies met een hoge impact in de fundamentele wetenschap en translationeel onderzoek4,5,6,7. Factoren die bijdragen tot onherleidbare resultaten zijn complex en veelzijdig, zoals een slechte of bevooroordeelde onderzoeksopzet6,8, onvoldoende statistische kracht3,9, ontbrekende naleving van rapportagestandaarden7,10,11, druk om te publiceren6 of niet-beschikbare methoden of softwarecode6,9 . Onder hen zijn subtiele veranderingen in het protocol en menselijke fouten bij de uitvoering van experimenten geïdentificeerd als verdere elementen die verantwoordelijk zijn voor onreproduceerbaarheid4. Handmatig pipetteren leidt bijvoorbeeld tot intra- en interindividuele onnauwkeurigheid12,13 en vergroot de kans op menselijke fouten14. Hoewel commerciële vloeistofbehandelingsrobots in staat zijn om deze nadelen te overwinnen en een verhoogde betrouwbaarheid voor vloeistoffen hebben aangetoond15,16,17, is geautomatiseerde verwerking van materialen met aanzienlijke viskeuze eigenschappen nog steeds een uitdaging.
Commerciële vloeistofbehandelingsrobots gebruiken vaak luchtkussenpipetjes, ook bekend als luchtzuiger- of luchtverplaatsingsp pipetten. Het reagens en de zuiger worden gescheiden door een luchtkussen dat krimpt tijdens doseerstappen en uitzet tijdens aanzuigende stappen. Met behulp van luchtkussenpipets 'stromen' viskeuze materialen slechts langzaam in en uit de punt, en vroege terugtrekking van de pipet uit het reservoir kan resulteren in het aspiratie van luchtbellen. Tijdens doseerwerkzaamheden laat het stroperige materiaal een film achter op de binnenste tipwand die slechts langzaam of helemaal niet 'stroomt' wanneer het door lucht wordt geforceerd. Om deze problemen op te lossen, werden verdringerpipetten commercieel geïntroduceerd om het viskeuze materiaal actief uit de punt te extruderen met behulp van een stevige zuiger. Hoewel deze verdringerpipeten een nauwkeurige en betrouwbare verwerking van viskeuze materialen mogelijk maken, zijn geautomatiseerde oplossingen met verdringerpipeten nog steeds te duur voor academische laboratoriumomgevingen, en daarom zijn de meeste workflows met viskeuze materialen uitsluitend afhankelijk van handmatige pipetteertaken18.
In het algemeen wordt viscositeit gedefinieerd als de weerstand van een vloeistof tegen stroming, en viskeuze materialen worden verder gedefinieerd als materialen met een grotere viscositeit van water (0,89 mPa·s s bij 25 °C). Op het gebied van biomedische toepassingen bevatten experimentele opstellingen vaak meerdere materialen met een grotere viscositeit dan water, zoals dimethylsulfoxide (DMSO; 1,99 mPa·s bij 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s bij 25 °C voor 90% glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s bij 25 °C) en watergezwollen polymeren, hydrogels genoemd19, 20. Hydrogels zijn hydrofiele polymeernetwerken die zijn gerangschikt in een fysische en / en chemische modus die wordt gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder celinkapseling, medicijnafgifte en zachte actuatoren19,20,21,22. De viscositeit van hydrogels is afhankelijk van de polymeerconcentratie en het molecuulgewicht19. Routinematig gebruikte hydrogels voor biomedische toepassingen vertonen viscositeitswaarden tussen 1 en 1000 mPa·s, terwijl specifieke hydrogelsystemen zijn gerapporteerd met waarden tot 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viscositeitsmetingen van hydrogels zijn echter niet gestandaardiseerd in termen van meetprotocol en monstervoorbereiding, en daarom zijn viscositeitswaarden tussen verschillende onderzoeken moeilijk te vergelijken.
Aangezien commercieel beschikbare geautomatiseerde oplossingen die speciaal zijn ontworpen voor hydrogels ontbreken of te duur zijn, zijn de huidige workflows voor hydrogel afhankelijk van handmatige hantering18. Om de beperkingen van de huidige handmatige workflow voor het pipetteren van hydrogels te begrijpen, is het belangrijk om essentiële verwerkingstaken te begrijpen18. Zodra bijvoorbeeld een nieuw hydrogelmateriaal is gesynthetiseerd, wordt een gewenste concentratie of een verdunningsreeks met verschillende concentraties gegenereerd om betrouwbare syntheseprotocollen en verknoopkingskenmerken te identificeren met daaropvolgende analyse van de mechanische eigenschappen25,26,27,28 . Over het algemeen wordt een stamoplossing bereid of gekocht en vervolgens gemengd met een verdunningsmiddel en/of andere reagentia om een mengsel te verkrijgen. De mengtaken worden meestal niet direct in een putplaat (of een ander uitvoerformaat) uitgevoerd en worden eerder uitgevoerd in een afzonderlijke reactiebuis, die gewoonlijk mastermix wordt genoemd. Tijdens deze bereidingstaken zijn verschillende aanzuig- en doseerstappen nodig om het viskeuze materiaal (en) over te brengen, de reagentia te mengen en het mengsel over te brengen naar een uitvoerformaat (bijvoorbeeld een 96-putplaat). Deze taken vereisen een grote hoeveelheid menselijke arbeid18, lange experimentele uren en vergroten de kans op menselijke fouten die zich mogelijk kunnen manifesteren als onnauwkeurige resultaten. Bovendien voorkomt handmatige hantering een efficiënte voorbereiding van hoge monsteraantallen om verschillende parametercombinaties te screenen voor gedetailleerde karakterisering. De handmatige verwerking belemmert ook het gebruik van hydrogels voor screeningstoepassingen met een hoge doorvoer, zoals de identificatie van veelbelovende verbindingen tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. De huidige handmatige voorbereidingsstappen zijn niet haalbaar om drugsbibliotheken bestaande uit duizenden drugs te screenen. Om deze redenen zijn geautomatiseerde oplossingen nodig om een efficiënt ontwikkelingsproces te bieden en de succesvolle vertaling van hydrogels voor screeningstoepassingen voor geneesmiddelen mogelijk te maken.
Om over te stappen van handmatige workflows naar geautomatiseerde processen, hebben we een commerciële open source pipetteerrobot geoptimaliseerd voor de behandeling van viskeuze materialen door de integratie van temperatuurdocks voor thermoresponsieve materialen, het gebruik van kant-en-klare verdringerpipeten met capillaire zuigertips en een optioneel tip touch dock voor pipetpuntreiniging. Deze pipetteerrobot is verder geïntegreerd als pipetteermodule in een nieuw ontwikkeld open source werkstation, dat bestaat uit kant-en-klare en aanpasbare modules18,29. Gedetailleerde montage-instructies voor het ontwikkelde werkstation inclusief hardware- en softwarebestanden zijn vrij toegankelijk vanuit de GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) en de Zenodo-repository (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Naast de hardwareontwikkeling is een open source protocol ontwerp applicatie geprogrammeerd en vrijgegeven om de gebruiker door het parameterselectieproces te leiden en een kant-en-klare protocolcode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp) te genereren. Deze code draait zowel op de commerciële open source pipetteerrobot als op het ontwikkelde open source werkstation.
Hierin wordt een uitgebreide tutorial gegeven over de werking van het open source werkstation om mengtaken voor viskeuze materialen te automatiseren (figuur 1). De tutorial-specifieke protocolstappen kunnen worden uitgevoerd met het ontwikkelde open source werkstation en de commerciële open source pipetteerrobot. Ondersteund door een in eigen huis ontwikkelde open source protocol ontwerp applicatie, wordt geautomatiseerd mengen en bereiden van vereiste concentraties voor glycerol, gelatine methacryloyl (GelMA) en alginaat gedemonstreerd. Glycerol is geselecteerd in deze tutorial, omdat het goed wordt gekenmerkt30,31, het is goedkoop en direct beschikbaar, en daarom wordt het vaak gebruikt als viskeus referentiemateriaal voor geautomatiseerde pipettertaken. Als voorbeelden voor hydrogels die in biomedische toepassingen worden gebruikt, zijn GelMA- en alginaathydrogelvoorloperoplossingen toegepast voor geautomatiseerde mengexperimenten. GelMA presenteert een van de meest gebruikte hydrogels voor celinkapselingsstudies32,33, en alginaat werd in deze studie geselecteerd om het vermogen aan te tonen om hydrogels met dubbele netwerken te produceren34,35. Met Orange G als kleurstof werd een snelle en goedkope procedure geïmplementeerd om de mengresultaten te valideren en te verifiëren met een spectrofotometer16.
Een commerciële open source pipetteerrobot is als pipetteermodule geïntegreerd in het ontwikkelde open source werkstation (figuur 2a), en daarom wordt de naam 'pipetteermodule' verder gebruikt om de pipetteerrobot te beschrijven. Een gedetailleerde beschrijving van de geïnstalleerde hardware valt buiten het bereik van dit protocol en is beschikbaar via de meegeleverde repositories die ook stapsgewijze instructies bevatten voor de algemene assemblage van het open source-platform. De pipetteermodule kan worden uitgerust met twee pipetten (een- of 8-kanaals pipet) die worden geïnstalleerd op as A (rechts) en as B (links) (figuur 2b). De pipetteermodule biedt een capaciteit van 10 dekken volgens de normen van het American National Standards Institute / Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI / SLAS) en de volgende locatieposities zijn gedefinieerd op het dek: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figuur 2c). Om foto-geïnduceerde polymerisatie van hydrogeloplossingen te initiëren, is een afzonderlijke crosslinkermodule vereist die aan het werkstation is toegevoegd. De crosslinkermodule is uitgerust met LED's met een golflengte van 400 nm en daarom kunnen stoffen die exciteren bij een zichtbare lichtgolflengte worden gebruikt met de huidige systemen, zoals lithiumfenyl-2,4,6 trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)36,37. De intensiteit (in mW/cm2) van de LED's kan door de gebruiker worden aangepakt in de protocolontwerptoepassing om het crosslinkinggedrag te bestuderen38. Het werkstation bevat ook een opslagmodule om studies met verhoogde doorvoer mogelijk te maken; deze module wordt echter niet gebruikt binnen dit onderzoek en daarom niet verder beschreven. Over het algemeen wordt aanbevolen om de pipetteermodule in een biologische veiligheidskast te gebruiken om verontreiniging van het monster te voorkomen. Het hoofdstroomcircuit om de pipetteermodule te bedienen is een 12 V-circuit, dat in de meeste landen als een laagspanningstoepassing wordt beschouwd. Alle elektrische componenten zijn gebaseerd op een speciale besturingskast die voorkomt dat gebruikers in contact komen met de bron van een elektrisch gevaar.
Door deze gestandaardiseerde mengprotocollen te volgen, zijn onderzoekers in staat om op een geautomatiseerde manier betrouwbare mengsels voor zowel viskeuze als niet-viskeuze materialen te bereiken. De open source-aanpak stelt gebruikers in staat om mengsequenties te optimaliseren en nieuw ontwikkelde protocollen met de gemeenschap te delen. Uiteindelijk zal deze aanpak de screening van meerdere parametercombinaties vergemakkelijken om de onderlinge afhankelijkheden tussen verschillende factoren te onderzoeken en daardoor de betrouwbare toepassing en ontwikkeling van viskeuze materialen voor biomedische toepassingen te versnellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

De huidige mengstappen van viskeuze materialen zijn afhankelijk van repetitieve en tijdrovende taken die voornamelijk handmatig worden uitgevoerd in een modus met lage doorvoer. Deze problemen vertegenwoordigen nadelen in workflows die uiteindelijk kunnen resulteren in onherleidbaarheid van onderzoeksresultaten. Handmatige workflows beperken de vooruitgang en wijdverspreide acceptatie van viskeuze materialen, zoals hydrogels die worden gebruikt voor biomedische toepassingen, verder. Deze uitdagingen kunnen worden overwonnen door geautomatiseerde workflows met gestandaardiseerde mengprocessen te gebruiken om de reproduceerbaarheid te vergroten. In deze studie presenteren we stapsgewijze instructies voor het gebruik van een open source protocolontwerper, voor het bedienen van een open source werkstation en voor het identificeren van reproduceerbare mengsels. In het bijzonder begeleidt de open source protocolontwerper de gebruiker door de experimentele parameterselectie en genereert een kant-en-klare protocolcode om het werkstation te bedienen. Dit werkstation is geoptimaliseerd voor het pipetteren van viskeuze materialen om geautomatiseerde en zeer betrouwbare verwerking mogelijk te maken door de integratie van temperatuurdocks voor thermoresponsieve materialen, pipetten met positieve verplaatsing voor viskeuze materialen en een optioneel tip touch dock om overtollig materiaal uit de pipetpunt te verwijderen. De validatie en verificatie van mengsels worden uitgevoerd door een snelle en goedkope absorptiemeting van Orange G. Dit protocol presenteert resultaten voor het verkrijgen van 80% (v/v) glycerolmengsels, een verdunningsreeks voor gelatinemethacryloyl (GelMA) en dubbelnetwerkhydrogels van 5% (w/v) GelMA en 2% (w/v) alginaat. Er is een handleiding voor probleemoplossing opgenomen om gebruikers te ondersteunen bij het aannemen van protocollen. De beschreven workflow kan breed worden toegepast op een aantal viskeuze materialen om op een geautomatiseerde manier door de gebruiker gedefinieerde concentraties te genereren.

Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Dit protocol dient als een uitgebreide tutorial voor gestandaardiseerde en reproduceerbare menging van viskeuze materialen met een nieuwe open source automatiseringstechnologie. Gedetailleerde instructies worden gegeven over de werking van een nieuw ontwikkeld open source werkstation, het gebruik van een open source protocol designer, en de validatie en verificatie om reproduceerbare mengsels te identificeren.

Een open source technologieplatform om op Hydrogel gebaseerde 3D-cultuurmodellen op een geautomatiseerde en gestandaardiseerde manier te produceren

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Biomedisch onderzoek wordt geconfronteerd met een reproduceerbaarheidscrisis omdat nieuwe onderzoeksresultaten zelden worden vertaald in therapeutische toepassingen. Dit protocol vermindert de menselijke factor en introduceert automatisering en standaardisatie in de productie. Deze methode richt zich specifiek op foto-cross-linkable hydrogels voor 3D-celkweektoepassingen, aangezien hydrogels het afgelopen decennium het meest gebruikte platform zijn geworden in kanker- en andere ziekteweefselmodellen.We hebben de huidige hardware- en softwarebeperkingen met succes aangepakt met de ontwikkeling van een open source technologieplatform. Dit platform is speciaal ontworpen voor hydrogels en maakt geautomatiseerde productieworkflows mogelijk voor weefselmanipulatieonderzoek. Als u de API wilt installeren, opent u de opdrachtregelinterface.Om de werk-API te installeren, voert u pip install openworkstation in en drukt u op Enter. Als u de pipetterende biofabricagemodule wilt bedienen, voert u de opdracht in om de opentrons API te installeren. Gebruik vervolgens de opdrachtregel om een Python-script te openen en te controleren of beide API's met succes zijn geïnstalleerd.Als u de protocolcode wilt genereren, opent u de protocolontwerptoepassing om een aangepast protocolscript te genereren dat door het platform wordt uitgevoerd. De interface draait op elke veelgebruikte internetbrowser. Voer de protocolnaam in op de instellingenpagina en klik op Doorgaan.Selecteer in de instelling van de invoerlade drie bij vier verwarmingsblokken om de invoerlade te definiëren. Als u de materialen en voorraadconcentraties wilt definiëren, selecteert u Gel 1 in het menu Invoer definiëren en voert u GelMA in als naam. Stel de voorraadconcentratie in op 20% en het aantal monsters op drie en klik op Toevoegen om de vermeldingen op te slaan en de eerste kolom te vullen.Selecteer Gel 2 in het menu invoer definiëren en voer Alginaat in als naam. Stel de voorraadconcentratie in op 4% en het aantal monsters op drie en klik op Toevoegen om de vermeldingen op te slaan en de tweede kolom te vullen. Nadat u de parameters van de foto-initiator en het verdunningsmiddel hebt ingesteld zoals gedemonstreerd, selecteert u fotocrosslinking, stelt u de tijd in op 30 seconden en de intensiteit op twee en klikt u op OK. Stel vervolgens het type putplaat in op 96 putplaat en klik op Groep 1 om de parameters voor het maken van hydrogels met dubbel netwerk te specificeren.Vink vervolgens indien nodig het selectievakje Geavanceerd mengprotocol toepassen aan, stel het aantal monsters in op 96 en klik op Doorgaan. Als u de indeling van het dek wilt instellen, selecteert u het juiste ladetype voor elke sleuf. Wanneer alle ladetypen zijn geselecteerd, klikt u op het linkervak pipet en selecteert u 10 tot 100 microliter positieve verplaatsing in het vervolgkeuzemenu.Stel de aanzuigsnelheid in op 600 en de doseersnelheid op 800. Stel vervolgens de juiste parameters van de pipet op dezelfde manier in. Klik vervolgens op Protocol genereren om het protocolscript te genereren en op te slaan.Voordat u het protocol uitvoert, spuit u de verbruiksartikelen met 70% ethanol en plaatst u ze volgens de setup die is gedefinieerd in de gebruikersconfiguratie. Plaats de reactiebuizen met de materialen in het aluminium blok op de temperatuurdocks volgens de geselecteerde opstelling. Spuit vervolgens uw handschoenen in met 70% ethanol en open de reactiebuizen voorzichtig zonder geopende buizen aan te raken.Wanneer de stoffen de juiste experimentele temperatuur hebben bereikt, voert u het gegenereerde protocol uit met behulp van de gebruikersinterface. Het werkstation begint met het homing-proces, gevolgd door het verkrijgen van een lege putplaat van de opslagmodule. Na het verwijderen van het deksel van de putplaat, wordt de plaat getransporteerd naar de volgende module.Het protocol specificeert het volume dat uit elke voorraadoplossing wordt gepipetteerd en verandert automatisch de uiteinden na elk materiaal om kruisbesmetting te voorkomen. Om viskeuze oplossingen op een reproduceerbare manier te mengen, voert het werkstation een specifiek mengprotocol uit dat is geoptimaliseerd voor viskeuze hydrogels. De protocolontwerp-app houdt rekening met het vulniveau van het reservoir en past automatisch de menghoogte aan om onnodig dompelen in de viskeuze materialen te voorkomen.Na het automatisch genereren van 3D-modellen en putplaten sluit het werkstation de putplaat met het deksel weer en slaat de putplaat op in de geprogrammeerde positie in de opslagmodule. Zodra het protocol is voltooid, verwijdert u de plaat uit de opslagmodule. Voor validatie en verificatie van het uitgevoerde protocol laadt u de plaat op een spectrofotometer en leest u de absorptie twee keer af bij 450 nanometer.Nadat u de absorptiewaarden hebt opgeslagen, opent u het analysespreadsheetbestand dat als aanvullend materiaal in de publicatie wordt verstrekt en kopieert u de absorptiemetingen naar de tabel in het onbewerkte gegevensblad. Klik vervolgens op het analyseblad om de gemiddelde waarden, de standaarddeviatie en de variantiecoëfficiëntwaarden te bekijken, die automatisch worden berekend en weergegeven voor een uniforme monsterverdeling voor specifieke rijen en voor specifieke kolommen van een 96-putplaat. Om de opstelling te vinden die een hoge reproduceerbaarheid voor glyceroloplossingen garandeert, werden protocollen gegenereerd zonder temperatuurregeling en zonder tipaanraking, met temperatuurregeling en zonder tipaanraking, of met temperatuurregeling en met tipaanraking.De berekende variatiecoëfficiëntwaarden voor de drie opstellingen onthulde een significante invloed van het temperatuurdock en de tip touch-functie, wat het vermogen van het protocol benadrukte om zeer reproduceerbare resultaten te genereren bij gebruik van beide functies. Met behulp van de tip touch-functie met het temperatuurdock werd de standaardafwijking aanzienlijk verminderd in opstelling drie. Het uitzetten van de absorptiewaarden van het monster voor opstelling drie leverde gedurende het hele experiment geen stijgende of dalende waarden op en gaf derhalve aan dat de monsterpositie niet van invloed was op de absorptiewaarden.Vervolgens werd een GelMA-verdunningsreeks bereid door een 20% GelMA-stamoplossing te verdunnen en de verschillen tussen verschillende GelMA-verdunningen te beoordelen. De absorptiewaarde gemeten bij elke concentratiestap was significant anders en lineaire regressie toonde een hoge fit aan die het vermogen van verschillende concentratiestappen om te genereren bevestigt. Daarnaast werd de invloed van de tip touch geëvalueerd voor hydrogels met dubbele netwerk met 5%GelMA, 2%alginaat en 0,15% LAP, die automatisch werden gegenereerd met de setup.De integratie van de tip touch resulteert in een significante afname van de standaarddeviatie die het genereren van een reproduceerbare dataset ondersteunt. Visualisatie van de absorptiewaarden en heatmaps bevestigden de verminderde afwijking bij het gebruik van tip touch om overtollig materiaal van de tip te verwijderen. Onze technologie maakt de automatisering van hydrogelfabricage voor 3D-celkweek en tissue engineering mogelijk.Het is een goedkope oplossing om de doorvoer en reproduceerbaarheid van technisch uitdagende workflows te verhogen. Door een aanpasbare open source-aanpak te bieden, maakt deze technologie de weg vrij voor de wijdverspreide aanpassing van procesautomatisering in weefselmanipulatieonderzoek.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Contactlenzen Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Additief fabricage techniek voor de Facile en snelle fabricage van Hydrogel gebaseerde Micromachines met magnetisch responsieve onderdelen

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Ontwerp van een Open-Source, Low-Cost Bioink en Food Melt Extrusie 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Toepassingen voor open source Microplate-compatibele verlichtings panelen

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening en identificatie van kleine peptiden gericht op fibroblast groei factor Receptor2 met behulp van een Phage display peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...