Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
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Les auteurs remercient les membres du Centre de médecine régénérative de QUT, en particulier Antonia Horst et Pawel Mieszczanek pour leurs suggestions et commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par le Postgraduate Research Award for SE du QUT et par l’Australian Research Council (ARC) dans le cadre de la convention de subvention IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). Le Nouveau-Brunswick a reçu une bourse de recherche en début de carrière Peter Doherty (APP1091734) du Conseil national de la santé et de recherches médicales (NHMRC).

CM et DWH sont fondateurs et actionnaires de Gelomics Pty Ltd. CM est également le directeur de Gelomics Pty Ltd. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts pertinent pour le sujet de cet article. Les auteurs n’ont aucune autre affiliation ou implication financière pertinente avec une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou un conflit financier avec le sujet ou les documents discutés dans l’article, à l’exception de ceux divulgués.

Le pipetage de matériaux visqueux, en particulier d’hydrogels pour des applications biomédicales19,20,21,33,47, sont des tâches de routine dans de nombreux laboratoires de recherche pour préparer une concentration définie par l’utilisateur ou une série de dilution avec des concentrations variables. Bien qu’elle soit répétitive et que l’exécution soit plutôt simple, elle est principalement effectuée manuellement avec un faible débit d’échantillon18. Ce tutoriel présente le fonctionnement d’un poste de travail open source, spécialement conçu pour les matériaux visqueux, afin de permettre le mélange automatisé de matériaux visqueux pour une génération reproductible des concentrations souhaitées. Ce poste de travail est optimisé pour le pipetage d’hydrogels afin de permettre une manipulation automatisée et hautement fiable grâce à l’intégration de quais de température pour les matériaux thermorésensibles, de pipettes à déplacement positif pour les matériaux visqueux et d’un quai tactile à pointe en option pour éliminer l’excès de matériau de la pointe. Le module de pipetage a été spécialement optimisé pour permettre le traitement des matériaux visqueux de manière standardisée et automatisée. Par rapport aux pipettes à coussin d’air (figure 5a), les pipettes à déplacement positif (figure 5b) distribuent des matériaux visqueux sans laisser de matière résiduelle dans la pointe, ce qui donne des volumes d’aspiration et de distribution précis. La station d’accueil tactile à embout en option élimine l’excès de matériau d’échantillon de la pointe (Figure 5c,d), ce qui est utile pour les matériaux collants (par exemple, 4 % (p/v) d’alginate).
L’application de concepteur de protocole a été spécialement programmée pour les hydrogels et permet la dilution de jusqu’à quatre réactifs avec des concentrations différentes et jusqu’à deux diluants. Le risque d’erreurs dans le calcul des dilutions finales est évité dans cette application, car les utilisateurs ne choisissent que la concentration souhaitée ou les étapes de dilution en série. Les volumes d’aspiration et de distribution requis sont calculés automatiquement, enregistrés dans un fichier texte de documentation distinct, puis remplis dans le script de protocole. Cette application de conception de protocole donne à l’utilisateur un contrôle total de tous les paramètres expérimentaux (par exemple, la vitesse de pipetage) et assure la documentation interne des paramètres importants. L’application de conception du protocole prend en compte le niveau de remplissage du réservoir (par exemple, le puits) et fait varier la hauteur d’aspiration / distribution pour éviter les trempettes inutiles dans les matériaux visqueux. Cette fonction intégrée évite l’accumulation de matériau sur la paroi extérieure de la pointe et, par conséquent, garantit des tâches d’aspiration et de distribution fiables tout au long du protocole. Bien que l’application de concepteur de protocole ait été développée pour les étapes de dilution de l’hydrogel, elle peut également être utilisée pour la dilution de liquides non visqueux, tels que les colorants Orange G. L’application de concepteur de protocole, qui est accessible via le référentiel sous '/examples/publication-JoVE', est la version qui est expliquée dans la section protocole et mise en évidence dans la vidéo. Cette version ne sera pas mise à jour. Toutefois, une version mise à jour de l’application de concepteur de protocole est disponible via la page principale du référentiel. Le terminal d’étalonnage a été initialement développé par Sanderson48 et a été optimisé pour l’étalonnage des pipettes à déplacement positif.
Comme décrit dans la section 4 du protocole, les pipettes ainsi que les contenants doivent être étalonnés au départ. Ce processus d’étalonnage est crucial pour définir et enregistrer les positions qui sont ensuite utilisées pour calculer les incréments de mouvement. Par conséquent, l’exécution réussie du protocole repose sur des positions d’étalonnage bien définies, car des points d’étalonnage incorrects pourraient entraîner un crash de la pointe dans un conteneur. Étant donné que les positions du piston des pipettes doivent être étalonnées manuellement, l’exactitude et la précision du pipetage dépendent grandement de l’étalonnage effectué. Ces procédures d’étalonnage dépendent fortement de l’expérience utilisateur avec le module de pipetage et, par conséquent, une formation avec du personnel expérimenté est recommandée au début pour assurer des procédures d’étalonnage appropriées. En plus de l’étalonnage manuel sur le module de pipetage, la pipette elle-même doit être étalonnée pour assurer un pipetage précis. Il est recommandé d’étalonner les pipettes au moins tous les 12 mois pour répondre aux critères d’acceptation spécifiés dans la norme ISO 8655. Pour évaluer l’étalonnage de la pipette en interne, la validation et la vérification sont disponibles comme décrit par Stangegaard et al.16.
Pour la génération d’un ensemble de données fiables, il est crucial de commencer avec des réactifs de haute qualité. Ceci est particulièrement important pour les tâches de traitement de l’hydrogel, car les variations de lot à lot peuvent avoir un impact sur les résultats générés dans ce protocole. En plus des variations d’un lot à l’autre, des changements subtils dans la préparation de petits volumes peuvent également contribuer aux différences de propriété. Pour éviter cela, la préparation de plus grands volumes est recommandée, qui peut être utilisée pour l’ensemble des expériences.
Les procédures de validation et de vérification reposent sur l’utilisation d’un colorant pour identifier des mélanges fiables. Le protocole présenté décrit l’application d’Orange G, mais le protocole général et le flux de travail d’analyse peuvent également être adaptés aux colorants fluorescents49,50. L’utilisation d’Orange G réduit les exigences techniques du spectrophotomètre et élimine les précautions prises pour empêcher le blanchiment des colorants fluorescents après exposition à la lumière. Des problèmes dans le comportement de dissolution ou la formation d’amas du colorant n’ont pas été observés avec les matériaux présentés au cours des expériences, mais peuvent apparaître avec d’autres matériaux. La formation potentielle d’amas et, par conséquent, l’interaction entre le colorant et le matériau pourraient être facilement détectées au microscope.
Les procédures et techniques présentées dans ce didacticiel ajoutent une capacité d’automatisation aux flux de travail actuels pour les matériaux visqueux afin de réaliser des tâches très fiables avec un minimum de travail humain. Le tableau de dépannage fourni (tableau 2) comprend les problèmes identifiés et présente les raisons possibles ainsi que les solutions pour résoudre les problèmes. Le poste de travail présenté a été appliqué avec succès aux matériaux polymères naturels (gélatine, gomme gellane, matrigel) et synthétiques (par exemple, poly(éthylène glycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) pour les tâches de pipetage automatisées. En particulier, la combinaison d’un poste de travail open source et d’une application de conception de protocole open source conçue pour les matériaux visqueux sera très utile pour les chercheurs travaillant dans les domaines du génie biomédical, de la science des matériaux et de la microbiologie.

La reproductibilité et la reproductibilité sont d’une importance capitale dans les travaux scientifiques1,2,3,4. Cependant, des preuves récentes ont mis en évidence des défis importants dans la répétition d’études biomédicales à fort impact en sciences fondamentales ainsi qu’en recherche translationnelle4,5,6,7. Les facteurs contribuant à des résultats irreproductibles sont complexes et multiples, tels qu’une conception d’étude médiocre ou biaisée6,8, une puissance statistique insuffisante3,9, une conformité insuffisante aux normes de déclaration7,10,11, une pression pour publier6 ou des méthodes ou un code logiciel indisponible6,9 . Parmi eux, des changements subtils dans le protocole et des erreurs humaines dans l’exécution des expériences ont été identifiés comme d’autres éléments expliquant l’irreproductibilité4. Par exemple, les tâches manuelles de pipetage introduisent une imprécision intra- et inter-individuelle12,13 et augmentent la probabilité d’erreurs humaines14. Alors que les robots commerciaux de manutention de liquides sont capables de surmonter ces inconvénients et ont démontré une fiabilité accrue pour les liquides15,16,17, la manipulation automatisée de matériaux ayant des propriétés visqueuses importantes reste difficile.
Les robots commerciaux de traitement des liquides utilisent généralement des pipettes à coussin d’air, également connues sous le nom de pipettes à piston d’air ou de pipettes à déplacement d’air. Le réactif et le piston sont séparés par un coussin d’air qui rétrécit pendant les étapes de distribution et se dilate pendant les étapes d’aspiration. À l’aide de pipettes à coussin d’air, les matériaux visqueux ne « s’écoulent » que lentement dans et hors de la pointe, et le retrait précoce de la pipette du réservoir peut entraîner l’aspiration de bulles d’air. Pendant les tâches de distribution, le matériau visqueux laisse un film sur la paroi interne de la pointe qui ne « coule » que lentement ou pas du tout lorsqu’il est forcé par l’air. Pour surmonter ces problèmes, des pipettes à déplacement positif ont été introduites commercialement pour extruder activement le matériau visqueux hors de la pointe à l’aide d’un piston solide. Bien que ces pipettes à déplacement positif permettent une manipulation précise et fiable des matériaux visqueux, les solutions automatisées avec des pipettes à déplacement positif sont encore trop coûteuses pour les laboratoires universitaires et, par conséquent, la plupart des flux de travail avec des matériaux visqueux reposent uniquement sur des tâches de pipetage manuel18.
En général, la viscosité est définie comme la résistance d’un fluide à l’écoulement, et les matériaux visqueux sont en outre définis comme des matériaux ayant une plus grande viscosité de l’eau (0,89 mPa·s s à 25 °C). Dans le domaine des applications biomédicales, les installations expérimentales contiennent souvent plusieurs matériaux ayant une viscosité supérieure à celle de l’eau, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO; 1,99 mPa·s à 25 °C), le glycérol (208,1 mPa·s à 25 °C pour 90 % de glycérol [v/v]), le triton X-100 (240 mPa·s à 25 °C) et les polymères gonflés à l’eau, appelés hydrogels19, 20. Les hydrogels sont des réseaux de polymères hydrophiles disposés en mode physique et/ou chimique utilisés pour diverses applications, y compris l’encapsulation cellulaire, l’administration de médicaments et les actionneurs souples19,20,21,22. La viscosité des hydrogels dépend de la concentration du polymère et du poids moléculaire19. Les hydrogels couramment utilisés pour des applications biomédicales présentent des valeurs de viscosité comprises entre 1 et 1000 mPa·s, tandis que des systèmes d’hydrogel spécifiques ont été rapportés avec des valeurs allant jusqu’à 6 x 107 mPa·s19,23,24. Cependant, les mesures de viscosité des hydrogels ne sont pas normalisées en termes de protocole de mesure et de préparation des échantillons, et, par conséquent, les valeurs de viscosité entre les différentes études sont difficiles à comparer.
Étant donné que les solutions automatisées disponibles dans le commerce spécialement conçues pour les hydrogels sont manquantes ou trop coûteuses, les flux de travail actuels pour l’hydrogel dépendent de la manipulation manuelle18. Pour comprendre les limites du flux de travail manuel actuel pour le pipetage des hydrogels, il est important de comprendre les tâches de manutention essentielles18. Par exemple, une fois qu’un nouveau matériau d’hydrogel a été synthétisé, une concentration souhaitée ou une série de dilution avec des concentrations variables est générée pour identifier des protocoles de synthèse fiables et des caractéristiques de réticulation avec une analyse ultérieure des propriétés mécaniques25,26,27,28 . En général, une solution mère est préparée ou achetée, puis mélangée avec un diluant et/ou d’autres réactifs pour obtenir un mélange. Les tâches de mélange ne sont généralement pas effectuées directement dans une plaque de puits (ou n’importe quel format de sortie), et sont plutôt effectuées dans un tube de réaction séparé, communément appelé mélange maître. Au cours de ces tâches de préparation, diverses étapes d’aspiration et de distribution sont nécessaires pour transférer le ou les matériaux visqueux, mélanger les réactifs et transférer le mélange dans un format de sortie (par exemple, une plaque de 96 puits). Ces tâches nécessitent une grande quantité de travail humain18, de longues heures expérimentales et augmentent la probabilité d’erreurs humaines qui pourraient potentiellement se manifester par des résultats inexacts. De plus, la manipulation manuelle empêche la préparation efficace de nombres d’échantillons élevés pour filtrer diverses combinaisons de paramètres afin une caractérisation détaillée. Le traitement manuel empêche également l’utilisation d’hydrogels pour des applications de criblage à haut débit, telles que l’identification de composés prometteurs pendant le développement de médicaments. Les étapes actuelles de préparation manuelle ne sont pas réalisables pour dépister les bibliothèques de médicaments composées de milliers de médicaments. Pour ces raisons, des solutions automatisées sont nécessaires pour fournir un processus de développement efficace et permettre la traduction réussie d’hydrogels pour les applications de dépistage de médicaments.
Pour passer de flux de travail manuels à des processus automatisés, nous avons optimisé un robot de pipetage open source commercial pour la manipulation de matériaux visqueux par l’intégration de stations de température pour les matériaux thermorésensibles, l’utilisation de pipettes volumétriques prêtes à l’emploi utilisant des pointes de piston capillaire et une station d’accueil tactile en option pour le nettoyage des pointes de pipette. Ce robot de pipetage a été intégré en tant que module de pipetage dans un poste de travail open source nouvellement développé, qui se compose de modules prêts à installer et personnalisables18,29. Les instructions de montage détaillées pour le poste de travail développé, y compris les fichiers matériels et logiciels, sont librement accessibles depuis le GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) et le référentiel Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). En plus du développement matériel, une application de conception de protocole open source a été programmée et publiée pour guider l’utilisateur tout au long du processus de sélection des paramètres et générer un code de protocole prêt à l’emploi (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Ce code s’exécute sur le robot de pipetage open source commercial ainsi que sur le poste de travail open source développé.
Un tutoriel complet est fourni ici sur le fonctionnement de la station de travail open source pour automatiser les tâches de mélange pour les matériaux visqueux (Figure 1). Les étapes de protocole spécifiques au didacticiel peuvent être effectuées avec la station de travail open source développée ainsi qu’avec le robot de pipetage open source commercial. Soutenu par une application de conception de protocole open source développée en interne, le mélange automatisé et la préparation des concentrations requises pour le glycérol, la géthacryloyl de gélatine (GelMA) et l’alginate sont démontrés. Le glycérol a été sélectionné dans ce tutoriel, car il est bien caractérisé30,31, il est peu coûteux et facilement disponible, et, par conséquent, il est couramment utilisé comme matériau de référence visqueux pour les tâches de pipetage automatisées. À titre d’exemples d’hydrogels utilisés dans des applications biomédicales, gelMA et solutions précurseurs d’hydrogel d’alginate ont été appliquées pour des expériences de mélange automatisées. GelMA présente l’un des hydrogels les plus couramment utilisés pour les études d’encapsulation cellulaire32,33, et l’alginate a été sélectionné dans cette étude pour démontrer la capacité de fabriquer des hydrogels à double réseau34,35. En utilisant Orange G comme colorant, une procédure rapide et peu coûteuse a été mise en œuvre pour valider et vérifier les résultats du mélange avec un spectrophotomètre16.
Un robot de pipetage open source commercial a été intégré en tant que module de pipetage dans le poste de travail open source développé (Figure 2a), et par conséquent, le nom de « module de pipetage » est également utilisé pour décrire le robot de pipetage. Une description détaillée du matériel installé dépasse le cadre de ce protocole et est disponible via les référentiels fournis qui incluent également des instructions étape par étape pour l’assemblage général de la plate-forme open source. Le module de pipetage peut être équipé de deux pipettes (pipette à un ou 8 canaux) qui sont installées sur l’axe A (à droite) et l’axe B (à gauche) (Figure 2b). Le module de pipetage offre une capacité de 10 ponts selon les normes ansI/SLAS (American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening), et les positions d’emplacement suivantes sont définies sur le pont : A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Figure 2c). Pour initier la polymérisation photo-induite des solutions d’hydrogel, un module de réticulation séparé est nécessaire et a été ajouté au poste de travail. Le module de réticulation est équipé de LED d’une longueur d’onde de 400 nm et, par conséquent, des substances qui excitent à une longueur d’onde de lumière visible peuvent être utilisées avec les systèmes actuels, telles que le lithium phényl-2,4,6 triméthylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. L’intensité (en mW/cm2) des LED peut être traitée par l’utilisateur dans l’application de conception de protocole pour étudier le comportement de réticulation38. Le poste de travail comprend également un module de stockage pour permettre des études de débit accrues; toutefois, ce module n’est pas utilisé dans le cadre de la présente étude et, par conséquent, n’est pas décrit plus en détail. En général, il est recommandé d’utiliser le module de pipetage dans une armoire de sécurité biologique pour éviter la contamination des échantillons. Le circuit d’alimentation principal pour faire fonctionner le module de pipetage est un circuit de 12 V, qui est considéré comme une application basse tension dans la plupart des pays. Tous les composants électriques sont basés dans un boîtier de commande dédié empêchant les utilisateurs d’entrer en contact avec la source d’un danger électrique.
En suivant ces protocoles de mélange standardisés, les chercheurs sont en mesure d’obtenir des mélanges fiables pour les matériaux visqueux et non visqueux de manière automatisée. L’approche open source permet aux utilisateurs d’optimiser les séquences de mixage et de partager les protocoles nouvellement développés avec la communauté. En fin de compte, cette approche facilitera le criblage de combinaisons de paramètres multiples pour étudier les interdépendances entre différents facteurs et, par conséquent, accélérer l’application et le développement fiables de matériaux visqueux pour des applications biomédicales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Les étapes de mélange actuelles des matériaux visqueux reposent sur des tâches répétitives et chronophages qui sont effectuées principalement manuellement dans un mode à faible débit. Ces problèmes représentent des inconvénients dans les flux de travail qui peuvent finalement entraîner l’irreproductibilité des résultats de la recherche. Les flux de travail manuels limitent davantage l’avancement et l’adoption généralisée des matériaux visqueux, tels que les hydrogels utilisés pour des applications biomédicales. Ces défis peuvent être surmontés en utilisant des flux de travail automatisés avec des processus de mélange standardisés pour augmenter la reproductibilité. Dans cette étude, nous présentons des instructions étape par étape pour utiliser un concepteur de protocole open source, pour faire fonctionner un poste de travail open source et pour identifier les mélanges reproductibles. Plus précisément, le concepteur de protocole open source guide l’utilisateur à travers la sélection expérimentale des paramètres et génère un code de protocole prêt à l’emploi pour faire fonctionner le poste de travail. Ce poste de travail est optimisé pour le pipetage de matériaux visqueux afin de permettre une manipulation automatisée et hautement fiable grâce à l’intégration de quais de température pour les matériaux thermorésensibles, de pipettes à déplacement positif pour les matériaux visqueux et d’un quai tactile en option pour éliminer l’excès de matériau de la pointe de la pipette. La validation et la vérification des mélanges sont effectuées par une mesure d’absorbance rapide et peu coûteuse d’Orange G. Ce protocole présente des résultats pour obtenir des mélanges de glycérol à 80% (v/v), une série de dilution pour la méthacryloyl de gélatine (GelMA) et des hydrogels à double réseau de 5% (p/v) de GelMA et de 2% (p/v) d’alginate. Un guide de dépannage est inclus pour aider les utilisateurs à adopter le protocole. Le flux de travail décrit peut être largement appliqué à un certain nombre de matériaux visqueux pour générer des concentrations définies par l’utilisateur de manière automatisée.

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An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Ce protocole sert de didacticiel complet pour le mélange standardisé et reproductible de matériaux visqueux avec une nouvelle technologie d’automatisation open source. Des instructions détaillées sont fournies sur le fonctionnement d’un poste de travail open source nouvellement développé, l’utilisation d’un concepteur de protocole open source et la validation et la vérification pour identifier les mélanges reproductibles.

Une plate-forme technologique open source pour fabriquer des modèles de culture 3D basés sur l’hydrogel de manière automatisée et standardisée

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

La recherche biomédicale est confrontée à une crise de reproductibilité dans la mesure où les nouveaux résultats de la recherche sont rarement traduits en applications thérapeutiques. Ce protocole réduit le facteur humain et introduit l’automatisation et la normalisation dans la fabrication. Cette méthode se concentre spécifiquement sur les hydrogels phototiculables pour les applications de culture cellulaire 3D, car les hydrogels sont devenus la plate-forme la plus utilisée dans le cancer et d’autres modèles de tissus pathologiques au cours de la dernière décennie.Nous avons réussi à résoudre les limitations matérielles et logicielles actuelles avec le développement d’une plate-forme technologique open source. Cette plate-forme a été spécialement conçue pour les hydrogels et permet des flux de travail de fabrication automatisés pour la recherche en génie tissulaire. Pour installer l’API, ouvrez l’interface de ligne de commande.Pour installer l’API de travail, entrez pip install openworkstation et appuyez sur Entrée. Pour faire fonctionner le module de biofabrication de pipetage, entrez la commande pour installer l’API opentrons. Utilisez ensuite la ligne de commande pour ouvrir un script Python et vérifier si les deux API ont été installées avec succès.Pour générer le code de protocole, ouvrez l’application de conception de protocole pour générer un script de protocole personnalisé qui sera exécuté par la plate-forme. L’interface fonctionne sur tous les navigateurs Internet couramment utilisés. Entrez le nom du protocole sur la page de configuration et cliquez sur Continuer.Dans la configuration du bac d’entrée, sélectionnez trois par quatre bloc chauffant pour définir le bac d’entrée. Pour définir les matériaux et les concentrations de stock, sélectionnez Gel 1 dans le menu Définir les entrées et entrez GelMA comme nom. Définissez la concentration du stock sur 20 % et le nombre d’échantillons sur trois, puis cliquez sur Ajouter pour enregistrer les entrées et remplir la première colonne.Sélectionnez Gel 2 dans le menu Définir les entrées et entrez Alginate comme nom. Définissez la concentration du stock sur 4 % et le nombre d’échantillons sur trois, puis cliquez sur Ajouter pour enregistrer les entrées et remplir la deuxième colonne. Après avoir défini les paramètres du photoinitiateur et du diluant comme illustré, sélectionnez la réticulation de la photo, réglez le temps sur 30 secondes et l’intensité sur deux, puis cliquez sur OK. Ensuite, définissez le type de plaque de puits sur 96 plaques de puits et cliquez sur Groupe 1 pour permettre de spécifier les paramètres de création d’hydrogels à double réseau.Cochez ensuite la case Appliquer le protocole de mélange avancé si nécessaire, définissez le nombre d’échantillons sur 96, puis cliquez sur Continuer. Pour définir la disposition du pont, sélectionnez le type de plateau approprié pour chaque emplacement. Lorsque tous les types de plateaux ont été sélectionnés, cliquez sur la case de gauche de la pipette et sélectionnez un déplacement positif de 10 à 100 microlitres dans le menu déroulant.Réglez la vitesse d’aspiration sur 600 et la vitesse de distribution sur 800. Ensuite, réglez les paramètres droits de la pipette de la même manière. Cliquez ensuite sur Générer le protocole pour générer et enregistrer le script de protocole.Avant d’exécuter le protocole, vaporisez les consommables avec de l’éthanol à 70% et positionnez-les en fonction de la configuration définie dans la configuration de l’utilisateur. Placez les tubes de réaction avec les matériaux dans le bloc d’aluminium sur les quais de température en fonction de la configuration sélectionnée. Ensuite, vaporisez vos gants avec de l’éthanol à 70% et ouvrez soigneusement les tubes de réaction sans toucher les tubes ouverts.Lorsque les substances ont atteint la température expérimentale appropriée, exécutez le protocole généré à l’aide de l’interface utilisateur. Le poste de travail commencera par le processus de repérage, suivi de l’obtention d’une plaque de puits vide à partir du module de stockage. Après avoir retiré le couvercle de la plaque du puits, la plaque est transportée vers le module suivant.Le protocole spécifie le volume pipeté à partir de chaque solution mère et modifie automatiquement les embouts après chaque matériau pour éviter toute contamination croisée. Pour mélanger des solutions visqueuses de manière reproductible, le poste de travail exécute un protocole de mélange spécifique qui a été optimisé pour les hydrogels visqueux. L’application de conception de protocole prend en compte le niveau de remplissage du réservoir et adapte automatiquement la hauteur de mélange pour éviter tout immersion inutile dans les matériaux visqueux.Après la génération automatique de modèles 3D et de plaques de puits, le poste de travail referme la plaque de puits avec le couvercle et stocke la plaque de puits dans la position programmée dans le module de stockage. Une fois le protocole terminé, retirez la plaque du module de stockage. Pour la validation et la vérification du protocole conduit, chargez la plaque sur un spectrophotomètre et lisez l’absorbance deux fois à 450 nanomètres.Après avoir enregistré les valeurs d’absorbance, ouvrez le fichier de feuille de calcul d’analyse qui est fourni en tant que matériel supplémentaire dans la publication et copiez les lectures d’absorbance dans le tableau de la fiche de données brutes. Cliquez ensuite sur la feuille d’analyse pour afficher les valeurs moyennes, l’écart-type et les valeurs du coefficient de variance, qui sont automatiquement calculées et affichées pour une distribution uniforme de l’échantillon pour des lignes spécifiques et pour des colonnes spécifiques d’une plaque de 96 puits. Pour trouver la configuration qui assure une reproductibilité élevée pour les solutions de glycérol, des protocoles ont été générés sans contrôle de la température et sans contact de la pointe, avec contrôle de la température et sans contact de la pointe, ou avec contrôle de la température et avec la pointe tactile.Les valeurs de coefficient de variation calculées pour les trois configurations ont révélé une influence significative de la station de température et de la fonction tactile de pointe, soulignant la capacité du protocole à générer des résultats hautement reproductibles lorsqu’il est utilisé dans les deux fonctionnalités. En utilisant la fonction tactile de pointe avec la station de température, l’écart-type a été considérablement réduit dans la configuration trois. Le traçage des valeurs d’absorbance de l’échantillon pour la configuration trois n’a donné aucune valeur d’augmentation ou de diminution tout au long de l’expérience et n’a donc indiqué aucune influence de la position de l’échantillon sur les valeurs d’absorbance.Ensuite, une série de dilution GelMA a été préparée en diluant une solution mère GelMA à 20% et en évaluant les différences entre les différentes dilutions GelMA. La valeur d’absorbance mesurée à chaque étape de concentration était significativement différente et la régression linéaire a démontré un ajustement élevé confirmant la capacité de générer des étapes de concentration distinctes. En outre, l’influence du toucher de pointe a été évaluée pour les hydrogels à double réseau avec 5% GelMA, 2% alginate et 0,15% LAP, qui ont été générés automatiquement avec la configuration.L’intégration du tip touch se traduit par une diminution significative de l’écart-type supportant la génération d’un jeu de données reproductible. La visualisation des valeurs d’absorbance et des cartes thermiques a confirmé l’écart réduit lors de l’utilisation du toucher de la pointe pour éliminer l’excès de matière de la pointe. Notre technologie permet l’automatisation de la fabrication d’hydrogel pour la culture cellulaire 3D et l’ingénierie tissulaire.Il s’agit d’une solution peu coûteuse pour augmenter le débit et la reproductibilité des flux de travail techniquement difficiles. En fournissant une approche open source personnalisable, cette technologie ouvre la voie à l’adaptation généralisée de l’automatisation des processus dans la recherche en génie tissulaire.

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