Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
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Die Autoren danken den Mitgliedern des Zentrums für Regenerative Medizin am QUT, insbesondere Antonia Horst und Pawel Mieszczanek für ihre hilfreichen Anregungen und rückmeldungen. Diese Arbeit wurde durch den Postgraduate Research Award des QUT für SE und vom Australian Research Council (ARC) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing) unterstützt. NB wurde von einem Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734) des National Health and Medical Research Council (NHMRC) unterstützt.

CM und DWH sind Gründer und Aktionäre von Gelomics Pty Ltd. CM ist auch direktor von Gelomics Pty Ltd. Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt, der für das Thema dieses Artikels relevant ist. Die Autoren haben keine anderen relevanten Verbindungen oder finanziellen Beteiligungen an einer Organisation oder einem Unternehmen mit einem finanziellen Interesse an oder einem finanziellen Konflikt mit dem Thema oder den Materialien, die in dem Artikel diskutiert werden, mit Ausnahme der offengelegten.

Das Pipettieren von viskosen Materialien, insbesondere Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen19,20,21,33,47, sind Routineaufgaben in vielen Forschungslabors, um eine benutzerdefinierte Konzentration oder eine Verdünnungsreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen herzustellen. Obwohl es sich wiederholt und die Ausführung eher einfach ist, wird es meist manuell mit geringem Stichprobendurchsatz durchgeführt18. Dieses Tutorial stellt die Bedienung einer Open-Source-Workstation vor, die speziell für viskose Materialien entwickelt wurde, um das automatisierte Mischen viskoser Materialien zur reproduzierbaren Erzeugung gewünschter Konzentrationen zu ermöglichen. Diese Workstation ist für das Pipettieren von Hydrogelen optimiert, um eine automatisierte und äußerst zuverlässige Handhabung durch die Integration von Temperaturdocks für thermoresponsive Materialien, Verdrängerpipetten für viskose Materialien und einem optionalen Tip Touch Dock zum Entfernen von überschüssigem Material von der Spitze zu ermöglichen. Das Pipettiermodul wurde speziell optimiert, um die standardisierte und automatisierte Bearbeitung von viskosem Material zu ermöglichen. Im Vergleich zu Luftkissenpipetten (Abbildung 5a) dosieren Verdrängerpipetten (Abbildung 5b) viskose Materialien, ohne Restmaterial in der Spitze zu belassen, was zu genauen Saug- und Dosiervolumina führt. Das optionale Tip Touch Dock entfernt überschüssiges Probenmaterial aus der Spitze (Abbildung 5c,d), das für klebrige Materialien (z. B. 4% (w/v) Alginat) nützlich ist.
Die Protokolldesigner-Anwendung wurde speziell für Hydrogele programmiert und ermöglicht die Verdünnung von bis zu vier Reagenzien mit unterschiedlichen Konzentrationen und bis zu zwei Verdünnungsmitteln. Das Risiko von Fehlern bei der Berechnung der Endverdünnungen wird in dieser Anwendung vermieden, da die Benutzer nur die gewünschte Konzentration oder die seriellen Verdünnungsschritte wählen. Erforderliche Ansaug- und Dosiermengen werden automatisch berechnet, in einer separaten Dokumentationstextdatei gespeichert und dann in das Protokollskript eingegeben. Diese Protokolldesign-Anwendung gibt dem Benutzer die volle Kontrolle über alle experimentellen Parameter (z. B. Pipettiergeschwindigkeit) und gewährleistet die interne Dokumentation der wichtigen Parameter. Die Protokolldesign-App berücksichtigt den Füllstand des Reservoirs (z. B. gut) und variiert die Saug- / Dosierhöhe, um ein unnötiges Eintauchen in die viskosen Materialien zu vermeiden. Diese integrierte Funktion vermeidet Materialansammlungen an der Außenwand der Spitze und gewährleistet so zuverlässige Saug- und Dosieraufgaben während des gesamten Protokolls. Obwohl die Protokolldesigner-Anwendung für Hydrogel-Verdünnungsschritte entwickelt wurde, kann sie auch zur Verdünnung von nichtviskosen Flüssigkeiten wie Orange G-Farbstoffen verwendet werden. Die Protokoll-Designer-Anwendung, die über das Repository unter '/examples/publication-JoVE' zugänglich ist, ist die Version, die im Protokollabschnitt erklärt und im Video hervorgehoben wird. Diese Version wird nicht aktualisiert. Eine aktualisierte Version der Protokoll-Designer-Anwendung ist jedoch über die Haupt-Repository-Seite verfügbar. Die Kalibrierklemme wurde ursprünglich von Sanderson48 entwickelt und für die Kalibrierung von Verdrängerpipetten optimiert.
Wie im Protokollabschnitt 4 beschrieben, müssen sowohl Pipetten als auch Behälter zunächst kalibriert werden. Dieser Kalibrierungsprozess ist entscheidend, um die Positionen zu definieren und zu speichern, die dann zur Berechnung der Bewegungsschritte verwendet werden. Daher hängt eine erfolgreiche Protokollausführung von klar definierten Kalibrierpositionen ab, da falsche Kalibrierpunkte zum Absturz der Spitze in einen Behälter führen können. Da die Kolbenpositionen der Pipetten manuell kalibriert werden müssen, hängen Pipettiergenauigkeit und -präzision stark von der durchgeführten Kalibrierung ab. Diese Kalibrierungsverfahren hängen stark von der Benutzererfahrung mit dem Pipettiermodul ab, und daher wird zu Beginn eine Schulung mit erfahrenem Personal empfohlen, um ordnungsgemäße Kalibrierverfahren sicherzustellen. Zusätzlich zur manuellen Kalibrierung am Pipettiermodul muss die Pipette selbst kalibriert werden, um ein genaues Pipettieren zu gewährleisten. Es wird empfohlen, die Pipetten mindestens alle 12 Monate zu kalibrieren, um die Akzeptanzkriterien gemäß ISO 8655 zu erfüllen. Um die Pipettenkalibrierung intern zu bewerten, sind Validierung und Verifizierung verfügbar, wie von Stangegaard et al.16 beschrieben.
Für die Generierung eines zuverlässigen Datensatzes ist es entscheidend, mit Reagenzien von hoher Qualität zu beginnen. Dies ist besonders wichtig für Hydrogelverarbeitungsaufgaben, da sich Batch-to-Batch-Variationen auf die generierten Ergebnisse innerhalb dieses Protokolls auswirken können. Neben Batch-to-Batch-Variationen können auch subtile Änderungen bei der Vorbereitung kleiner Volumina zu Eigenschaftsunterschieden beitragen. Um dies zu verhindern, empfiehlt sich die Vorbereitung größerer Volumina, die für die gesamten Experimente verwendet werden können.
Die Validierungs- und Verifizierungsverfahren beruhen auf der Verwendung eines Farbstoffs, um zuverlässige Gemische zu identifizieren. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Anwendung von Orange G, aber der allgemeine Protokoll- und Analyseablauf kann auch an Fluoreszenzfarbstoffe angepasst werden49,50. Die Verwendung von Orange G reduziert die technischen Anforderungen an das Spektralphotometer und eliminiert Vorsichtsmaßnahmen, die getroffen wurden, um ein Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe nach Lichteinwirkung zu verhindern. Probleme im Auflösungsverhalten oder in der Clusterbildung des Farbstoffs wurden bei den vorgestellten Materialien während der Experimente nicht beobachtet, können aber bei anderen Materialien auftreten. Eine mögliche Clusterbildung und damit die Wechselwirkung zwischen Farbstoff und Material ließe sich leicht mit einem Mikroskop nachweisen.
Die in diesem Tutorial vorgestellten Verfahren und Techniken erweitern aktuelle Workflows für viskose Materialien um Automatisierungsfunktionen, um äußerst zuverlässige Aufgaben mit minimalem Arbeitsaufwand zu erfüllen. Die bereitgestellte Fehlerbehebungstabelle (Tabelle 2) enthält identifizierte Probleme und zeigt mögliche Gründe sowie Lösungen zur Lösung der Probleme auf. Die vorgestellte Workstation wurde erfolgreich auf natürliche (Gelatine, Gellangummi, Matrigel) und synthetische (z.B. Poly(ethylenglykol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere Materialien für automatisierte Pipettieraufgaben angewendet. Insbesondere die Kombination aus einer Open-Source-Workstation und einer Open-Source-Protokolldesignanwendung für viskose Materialien wird für Forscher in den Bereichen Biomedizintechnik, Materialwissenschaften und Mikrobiologie sehr nützlich sein.

Reproduzierbarkeit und Replizierbarkeit sind in der wissenschaftlichen Arbeit von größter Bedeutung1,2,3,4. Jüngste Erkenntnisse haben jedoch erhebliche Herausforderungen bei der Wiederholung von hochwirksamen biomedizinischen Studien in der Grundlagenforschung sowie in der translationalen Forschung aufgezeigt4,5,6,7. Faktoren, die zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen beitragen, sind komplex und vielfältig, wie z. B. schlechtes oder verzerrtes Studiendesign6,8, unzureichende statistische Aussagekraft3,9, fehlende Einhaltung der Berichtsstandards7,10,11, Druck zur Veröffentlichung6 oder nicht verfügbare Methoden oder Softwarecode6,9 . Unter ihnen wurden subtile Änderungen im Protokoll und menschliche Fehler bei der Durchführung von Experimenten als weitere Elemente identifiziert, die für die Unreproduzierbarkeit verantwortlich sind4. Beispielsweise führen manuelle Pipettieraufgaben zu intra- und interindividuellen Ungenauigkeiten12,13 und erhöhen die Wahrscheinlichkeit menschlicher Fehler14. Während kommerzielle Liquid-Handling-Roboter in der Lage sind, diese Nachteile zu überwinden und eine erhöhte Zuverlässigkeit für Flüssigkeiten gezeigt haben15,16,17, ist die automatisierte Handhabung von Materialien mit signifikanten viskosen Eigenschaften immer noch eine Herausforderung.
Kommerzielle Liquid-Handling-Roboter verwenden üblicherweise Luftkissenpipetten, auch bekannt als Luftkolben- oder Luftverdrängungspipetten. Das Reagenz und der Kolben sind durch ein Luftkissen getrennt, das während der Dosierschritte schrumpft und sich während der Saugschritte ausdehnt. Bei der Verwendung von Luftkissenpipetten "fließen" viskose Materialien nur langsam in die Spitze hinein und wieder heraus, und eine frühzeitige Entnahme der Pipette aus dem Reservoir kann zur Ansaugung von Luftblasen führen. Bei Dosieraufgaben hinterlässt das zähflüssige Material einen Film an der inneren Spitzenwand, der nur langsam oder gar nicht "fließt", wenn er von der Luft gedrückt wird. Um diese Probleme zu lösen, wurden Verdrängerpipetten kommerziell eingeführt, um das viskose Material mit einem festen Kolben aktiv aus der Spitze zu extrudieren. Obwohl diese Verdrängerpipetten eine genaue und zuverlässige Handhabung viskoser Materialien ermöglichen, sind automatisierte Lösungen mit Verdrängerpipetten für akademische Laborumgebungen immer noch zu teuer, und daher verlassen sich die meisten Arbeitsabläufe mit viskosen Materialien ausschließlich auf manuelle Pipettieraufgaben18.
Im Allgemeinen ist die Viskosität definiert als der Fließwiderstand einer Flüssigkeit, und viskose Materialien werden ferner als Materialien mit einer höheren Viskosität von Wasser (0,89 mPa·s bei 25 °C) definiert. Im Bereich biomedizinischer Anwendungen enthalten Versuchsaufbauten häufig mehrere Materialien mit einer höheren Viskosität als Wasser, wie Dimethylsulfoxid (DMSO; 1,99 mPa·s bei 25 °C), Glycerin (208,1 mPa·s bei 25 °C für 90% Glycerin [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s bei 25 °C) und wassergeschwollene Polymere, die als Hydrogele bezeichnet werden19, 20. Auflage. Hydrogele sind hydrophile Polymernetzwerke, die in einem physikalischen und/oder chemischen Modus angeordnet sind und für verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich Zellverkapselung, Arzneimittelabgabe und weiche Aktuatoren19,20,21,22. Die Viskosität von Hydrogelen hängt von der Polymerkonzentration und dem Molekulargewicht ab19. Routinemäßig verwendete Hydrogele für biomedizinische Anwendungen weisen Viskositätswerte zwischen 1 und 1000 mPa·s auf, während spezifische Hydrogelsysteme mit Werten von bis zu 6 x 107 mPa·s19,23,24 berichtet wurden. Viskositätsmessungen von Hydrogelen sind jedoch in Bezug auf messprotokoll und Probenvorbereitung nicht standardisiert, und daher sind Viskositätswerte zwischen verschiedenen Studien schwer zu vergleichen.
Da kommerziell erhältliche automatisierte Lösungen, die speziell für Hydrogele entwickelt wurden, entweder fehlen oder zu teuer sind, hängen die aktuellen Arbeitsabläufe für Hydrogel von der manuellen Handhabung ab18. Um die Grenzen des derzeitigen manuellen Workflows für das Pipettieren von Hydrogelen zu verstehen, ist es wichtig, die wesentlichen Handhabungsaufgaben zu verstehen18. Sobald beispielsweise ein neuartiges Hydrogelmaterial synthetisiert wurde, wird eine gewünschte Konzentration oder eine Verdünnungsreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen erzeugt, um zuverlässige Syntheseprotokolle und Vernetzungseigenschaften mit anschließender Analyse der mechanischen Eigenschaften zu identifizieren25,26,27,28 . Im Allgemeinen wird eine Stammlösung hergestellt oder gekauft und anschließend mit einem Verdünnungsmittel und/oder anderen Reagenzien gemischt, um eine Mischung zu erhalten. Die Mischaufgaben werden meist nicht direkt in einer Wellplatte (oder einem beliebigen Ausgabeformat) ausgeführt, sondern in einem separaten Reaktionsrohr, das gemeinhin als Master-Mix bezeichnet wird. Während dieser Vorbereitungsaufgaben sind verschiedene Saug- und Dosierschritte erforderlich, um das/die viskose(n) Material(e) zu übertragen, die Reagenzien zu mischen und die Mischung in ein Ausgabeformat (z. B. eine 96-Well-Platte) zu übertragen. Diese Aufgaben erfordern eine hohe Menge an menschlicher Arbeit18, lange experimentelle Stunden und erhöhen die Wahrscheinlichkeit menschlicher Fehler, die sich möglicherweise als ungenaue Ergebnisse manifestieren können. Darüber hinaus verhindert die manuelle Handhabung eine effiziente Vorbereitung hoher Probenzahlen, um verschiedene Parameterkombinationen für eine detaillierte Charakterisierung zu screenen. Die manuelle Verarbeitung behindert auch den Einsatz von Hydrogelen für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen, wie die Identifizierung vielversprechender Verbindungen während der Arzneimittelentwicklung. Die derzeitigen manuellen Vorbereitungsschritte sind nicht durchführbar, um Arzneimittelbibliotheken, die aus Tausenden von Arzneimitteln bestehen, zu screenen. Aus diesen Gründen sind automatisierte Lösungen erforderlich, um einen effizienten Entwicklungsprozess zu ermöglichen und die erfolgreiche Translation von Hydrogelen für Drug-Screening-Anwendungen zu ermöglichen.
Um von manuellen Arbeitsabläufen zu automatisierten Prozessen überzugehen, haben wir einen kommerziellen Open-Source-Pipettierroboter für die Handhabung viskoser Materialien durch die Integration von Temperaturdocks für thermoresponsive Materialien, die Verwendung von handelsüblichen Verdrängerpipetten mit Kapillarkolbenspitzen und ein optionales Spitzen-Touchdock für die Pipettenspitzenreinigung optimiert. Dieser Pipettierroboter wurde als Pipettiermodul weiter in eine neu entwickelte Open-Source-Workstation integriert, die aus einbaufertigen und anpassbaren Modulen besteht18,29. Detaillierte Montageanleitungen für die entwickelte Workstation inklusive Hard- und Softwaredateien sind über GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) und das Zenodo Repository (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757) frei zugänglich. Neben der Hardwareentwicklung wurde eine Open-Source-Protokolldesign-Anwendung programmiert und freigegeben, um den Benutzer durch den Parameterauswahlprozess zu führen und einen gebrauchsfertigen Protokollcode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp) zu generieren. Dieser Code läuft sowohl auf dem kommerziellen Open-Source-Pipettierroboter als auch auf der entwickelten Open-Source-Workstation.
Hierin wird ein umfassendes Tutorial zur Bedienung der Open-Source-Workstation zur Automatisierung von Mischaufgaben für viskose Materialien bereitgestellt (Abbildung 1). Die Tutorial-spezifischen Protokollschritte können sowohl mit der entwickelten Open-Source-Workstation als auch mit dem kommerziellen Open-Source-Pipettierroboter durchgeführt werden. Unterstützt durch eine selbst entwickelte Open-Source-Protokolldesign-Anwendung wird das automatisierte Mischen und Präparation der erforderlichen Konzentrationen für Glycerin, Gelatine Methacryloyl (GelMA) und Alginat demonstriert. Glycerin wurde in diesem Tutorial ausgewählt, da es gut charakterisiert ist30,31, es ist kostengünstig und leicht verfügbar und wird daher häufig als viskoses Referenzmaterial für automatisierte Pipettieraufgaben verwendet. Als Beispiele für Hydrogele, die in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt werden, wurden GelMA- und Alginat-Hydrogel-Vorläuferlösungen für automatisierte Mischexperimente eingesetzt. GelMA stellt eines der am häufigsten verwendeten Hydrogele für Zellverkapselungsstudien dar32,33, und Alginat wurde in dieser Studie ausgewählt, um die Fähigkeit zur Herstellung von Doppelnetzwerk-Hydrogelen zu demonstrieren34,35. Mit Orange G als Farbstoff wurde ein schnelles und kostengünstiges Verfahren implementiert, um die Mischergebnisse mit einem Spektralphotometer16 zu validieren und zu verifizieren.
Ein kommerzieller Open-Source-Pipettierroboter wurde als Pipettiermodul in die entwickelte Open-Source-Workstation integriert (Abbildung 2a), und daher wird der Name "Pipettiermodul" weiter verwendet, um den Pipettierroboter zu beschreiben. Eine detaillierte Beschreibung der installierten Hardware geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus und ist über die bereitgestellten Repositories verfügbar, die auch eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die allgemeine Montage der Open-Source-Plattform enthalten. Das Pipettiermodul kann mit zwei Pipetten (Ein- oder 8-Kanal-Pipette) ausgestattet werden, die auf Achse A (rechts) und Achse B (links) installiert sind (Abbildung 2b). Das Pipettiermodul bietet eine Kapazität von 10 Decks gemäß den Standards des American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS), und die folgenden Standortpositionen sind auf dem Deck definiert: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (Abbildung 2c). Um die photoinduzierte Polymerisation von Hydrogellösungen einzuleiten, ist ein separates Vernetzermodul erforderlich, das dem Arbeitsplatz hinzugefügt wurde. Das Vernetzungsmodul ist mit LEDs mit einer Wellenlänge von 400 nm ausgestattet und daher können Substanzen, die bei einer Wellenlänge des sichtbaren Lichts anregen, mit den aktuellen Systemen verwendet werden, wie z.B. Lithiumphenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinat (LAP)36,37. Die Intensität (in mW/cm2) der LEDs kann vom Benutzer in der Protokolldesignanwendung angegeben werden, um das Vernetzungsverhalten zu untersuchen38. Die Workstation enthält auch ein Speichermodul, um Studien mit erhöhtem Durchsatz zu ermöglichen. Dieses Modul wird jedoch in dieser Studie nicht verwendet und daher nicht weiter beschrieben. Generell empfiehlt es sich, das Pipettiermodul in einer biologischen Sicherheitswerkbank zu betreiben, um eine Probenkontamination zu vermeiden. Der Hauptstromkreis für den Betrieb des Pipettiermoduls ist ein 12-V-Stromkreis, der in den meisten Ländern als Niederspannungsanwendung gilt. Alle elektrischen Komponenten basieren auf einem speziellen Steuerkasten, der verhindert, dass Benutzer mit der Quelle einer elektrischen Gefahr in Kontakt kommen.
Durch die Einhaltung dieser standardisierten Mischprotokolle sind Forscher in der Lage, zuverlässige Mischungen sowohl für viskose als auch für nicht viskose Materialien automatisiert zu erreichen. Der Open-Source-Ansatz ermöglicht es Benutzern, Mischsequenzen zu optimieren und neu entwickelte Protokolle mit der Community zu teilen. Letztendlich wird dieser Ansatz das Screening mehrerer Parameterkombinationen erleichtern, um die Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Faktoren zu untersuchen und dadurch die zuverlässige Anwendung und Entwicklung viskoser Materialien für biomedizinische Anwendungen zu beschleunigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

Aktuelle Mischschritte viskoser Materialien beruhen auf sich wiederholenden und zeitaufwändigen Aufgaben, die hauptsächlich manuell in einem Niedrigdurchsatzmodus ausgeführt werden. Diese Probleme stellen Nachteile in Arbeitsabläufen dar, die letztendlich zu einer Unreproduzierbarkeit von Forschungsergebnissen führen können. Manuelle Arbeitsabläufe schränken die Weiterentwicklung und weit verbreitete Einführung viskoser Materialien wie Hydrogele für biomedizinische Anwendungen weiter ein. Diese Herausforderungen können durch den Einsatz automatisierter Workflows mit standardisierten Mischprozessen zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit bewältigt werden. In dieser Studie präsentieren wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Verwendung eines Open-Source-Protokolldesigners, zum Betrieb einer Open-Source-Workstation und zur Identifizierung reproduzierbarer Mischungen. Konkret führt der Open-Source-Protokolldesigner den Anwender durch die experimentelle Parameterauswahl und generiert einen gebrauchsfertigen Protokollcode zur Bedienung der Workstation. Diese Workstation ist für das Pipettieren von viskosen Materialien optimiert, um eine automatisierte und äußerst zuverlässige Handhabung durch die Integration von Temperaturdocks für thermoresponsive Materialien, Verdrängerpipetten für viskose Materialien und einem optionalen Tip Touch Dock zum Entfernen von überschüssigem Material von der Pipettenspitze zu ermöglichen. Die Validierung und Verifizierung von Gemischen erfolgt durch eine schnelle und kostengünstige Absorptionsmessung von Orange G. Dieses Protokoll enthält Ergebnisse zur Erzielung von 80% (v/v) Glyceringemischen, einer Verdünnungsreihe für Gelatinemethacryloyl (GelMA) und Doppelnetzwerkhydrogelen von 5% (w/v) GelMA und 2% (w/v) Alginat. Eine Anleitung zur Fehlerbehebung ist enthalten, um Benutzer bei der Protokollübernahme zu unterstützen. Der beschriebene Workflow kann breit auf eine Reihe von viskosen Materialien angewendet werden, um benutzerdefinierte Konzentrationen automatisiert zu erzeugen.

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An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Dieses Protokoll dient als umfassendes Tutorial für das standardisierte und reproduzierbare Mischen viskoser Materialien mit einer neuartigen Open-Source-Automatisierungstechnologie. Detaillierte Anleitungen zum Betrieb einer neu entwickelten Open-Source-Workstation, zur Verwendung eines Open-Source-Protokolldesigners sowie zur Validierung und Verifizierung zur Identifizierung reproduzierbarer Mischungen werden bereitgestellt.

Eine Open-Source-Technologieplattform zur automatisierten und standardisierten Herstellung von Hydrogel-basierten 3D-Kulturmodellen

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Die biomedizinische Forschung steht vor einer Reproduzierbarkeitskrise, da neue Forschungsergebnisse selten in therapeutische Anwendungen umgesetzt werden. Dieses Protokoll reduziert den menschlichen Faktor und führt Automatisierung und Standardisierung in die Fertigung ein. Diese Methode konzentriert sich speziell auf photovernetzbare Hydrogele für 3D-Zellkulturanwendungen, da Hydrogele in den letzten zehn Jahren zur am häufigsten verwendeten Plattform in Krebs- und anderen Krankheitsgewebemodellen geworden sind.Mit der Entwicklung einer Open-Source-Technologieplattform haben wir die aktuellen Hard- und Software-Einschränkungen erfolgreich adressiert. Diese Plattform wurde speziell für Hydrogele entwickelt und ermöglicht automatisierte Fertigungsabläufe für die Tissue-Engineering-Forschung. Um die API zu installieren, öffnen Sie die Befehlszeilenschnittstelle.Um die Arbeits-API zu installieren, geben Sie pip install openworkstation ein und drücken Sie die Eingabetaste. Um das Pipettier-Biofabrikationsmodul zu betreiben, geben Sie den Befehl zur Installation der opentrons-API ein. Öffnen Sie dann über die Befehlszeile ein Python-Skript und überprüfen Sie, ob beide APIs erfolgreich installiert wurden.Um den Protokollcode zu generieren, öffnen Sie die Protokollentwurfsanwendung, um ein benutzerdefiniertes Protokollskript zu generieren, das von der Plattform ausgeführt wird. Die Schnittstelle läuft auf jedem gängigen Internetbrowser. Geben Sie den Protokollnamen auf der Setup-Seite ein und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie in der Einrichtung des Eingabefachs drei mal vier Heizblöcke aus, um das Einzugsfach zu definieren. Um die Materialien und Stammkonzentrationen zu definieren, wählen Sie Gel 1 aus dem Menü Eingaben definieren und geben Sie GelMA als Namen ein. Legen Sie die Stammkonzentration auf 20 % und die Anzahl der Proben auf drei fest und klicken Sie auf Hinzufügen, um die Einträge zu speichern und die erste Spalte zu füllen.Wählen Sie Gel 2 aus dem Menü Eingaben definieren und geben Sie Alginat als Namen ein. Legen Sie die Stammkonzentration auf 4 % und die Anzahl der Proben auf drei fest und klicken Sie auf Hinzufügen, um die Einträge zu speichern und die zweite Spalte zu füllen. Nachdem Sie den Photoinitiator und die Verdünnungsmittelparameter wie gezeigt eingestellt haben, wählen Sie die Fotovernetzung, stellen Sie die Zeit auf 30 Sekunden und die Intensität auf zwei und klicken Sie auf OK. Legen Sie als Nächstes den Wellplattentyp auf 96 Well Plate fest und klicken Sie auf Gruppe 1, um die Parameter für die Erstellung von Doppelnetzwerk-Hydrogelen anzugeben.Aktivieren Sie dann bei Bedarf das Kontrollkästchen Erweitertes Mischprotokoll anwenden, legen Sie die Anzahl der Samples auf 96 fest und klicken Sie auf Weiter. Um das Deck-Layout festzulegen, wählen Sie den entsprechenden Tray-Typ für jeden Slot aus. Wenn alle Tray-Typen ausgewählt wurden, klicken Sie auf das linke Pipettenfeld und wählen Sie 10 bis 100 Mikroliter Verdrängung aus dem Dropdown-Menü.Stellen Sie die Sauggeschwindigkeit auf 600 und die Dosiergeschwindigkeit auf 800 ein. Stellen Sie dann die Pipettenparameter auf die gleiche Weise richtig ein. Klicken Sie dann auf Protokoll generieren, um das Protokollskript zu generieren und zu speichern.Bevor Sie das Protokoll ausführen, besprühen Sie die Verbrauchsmaterialien mit 70% Ethanol und positionieren Sie sie entsprechend dem im Benutzer-Setup definierten Setup. Platzieren Sie die Reaktionsrohre mit den Materialien im Aluminiumblock auf den Temperaturdocks entsprechend dem gewählten Setup. Als nächstes besprühen Sie Ihre Handschuhe mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Reaktionsröhrchen vorsichtig, ohne die geöffneten Röhrchen zu berühren.Wenn die Substanzen die entsprechende experimentelle Temperatur erreicht haben, führen Sie das generierte Protokoll über die Benutzeroberfläche aus. Die Workstation beginnt mit dem Homing-Prozess, gefolgt von einer leeren Well-Platte aus dem Speichermodul. Nach dem Entfernen des Deckels von der Brunnenplatte wird die Platte zum nächsten Modul transportiert.Das Protokoll legt das Volumen fest, das aus jeder Stammlösung pipettiert wird, und ändert automatisch die Spitzen nach jedem Material, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Um viskose Lösungen reproduzierbar zu mischen, führt die Workstation ein spezifisches Mischprotokoll aus, das für viskose Hydrogele optimiert wurde. Die Protokolldesign-App berücksichtigt den Füllstand des Behälters und passt die Mischhöhe automatisch an, um unnötiges Eintauchen in die viskosen Materialien zu vermeiden.Nach automatischer Generierung von 3D-Modellen und Brunnenplatten schließt der Arbeitsplatz die Brunnenplatte wieder mit dem Deckel und speichert die Brunnenplatte in der programmierten Position im Speichermodul. Sobald das Protokoll abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus dem Speichermodul. Zur Validierung und Verifizierung des leitungsgeführten Protokolls laden Sie die Platte auf ein Spektralphotometer und lesen Sie die Absorption zweimal bei 450 Nanometern ab.Öffnen Sie nach dem Speichern der Absorptionswerte die Analysetabellendatei, die als ergänzendes Material in der Publikation bereitgestellt wird, und kopieren Sie die Absorptionswerte in die Tabelle im Rohdatenblatt. Klicken Sie dann auf das Analyseblatt, um die Mittelwerte, die Standardabweichung und den Varianzkoeffizienten anzuzeigen, die automatisch berechnet und angezeigt werden, um eine gleichmäßige Stichprobenverteilung für bestimmte Zeilen und für bestimmte Spalten einer 96-Well-Platte zu erhalten. Um den Aufbau zu finden, der eine hohe Reproduzierbarkeit für Glycerinlösungen gewährleistet, wurden Protokolle ohne Temperaturregelung und ohne Spitzenberührung, mit Temperaturregelung und ohne Spitzenberührung oder mit Temperaturregelung und mit Spitzenberührung erstellt.Der berechnete Variationskoeffizient für die drei Setups zeigte einen signifikanten Einfluss des Temperaturdocks und der Tip-Touch-Funktion, was die Fähigkeit des Protokolls unterstreicht, bei Verwendung beider Funktionen hochgradig reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Durch die Tip-Touch-Funktion mit dem Temperatur-Dock wurde die Standardabweichung in Setup drei deutlich reduziert. Das Aufzeichnen der Probenabsorptionswerte für Setup drei ergab während des gesamten Experiments keine steigenden oder abnehmenden Werte und zeigte daher keinen Einfluss der Probenposition auf die Absorptionswerte.Als nächstes wurde eine GelMA-Verdünnungsserie hergestellt, indem eine 20% ige GelMA-Stammlösung verdünnt und die Unterschiede zwischen verschiedenen GelMA-Verdünnungen bewertet wurden. Der bei jedem Konzentrationsschritt gemessene Absorptionswert war signifikant unterschiedlich und die lineare Regression zeigte eine hohe Anpassung, die die Fähigkeit zur Erzeugung unterschiedlicher Konzentrationsschritte bestätigte. Zusätzlich wurde der Einfluss des Tip Touch für Doppelnetzwerk-Hydrogele mit 5%GelMA, 2%Alginat und 0,15%LAP bewertet, die mit dem Setup automatisch generiert wurden.Die Integration des Tip Touch führt zu einer signifikanten Verringerung der Standardabweichung, was die Generierung eines reproduzierbaren Datensatzes unterstützt. Die Visualisierung der Absorptionswerte und Heatmaps bestätigte die reduzierte Abweichung bei der Verwendung von Tip Touch, um überschüssiges Material aus der Spitze zu entfernen. Unsere Technologie ermöglicht die Automatisierung der Hydrogelherstellung für 3D-Zellkulturen und Tissue Engineering.Es ist eine kostengünstige Lösung, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit technisch anspruchsvoller Arbeitsabläufe zu erhöhen. Durch die Bereitstellung eines anpassbaren Open-Source-Ansatzes ebnet diese Technologie den Weg für die weit verbreitete Anpassung der Prozessautomatisierung in der Tissue-Engineering-Forschung.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Forschung

Biotechnik

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

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Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Zusatzstoff Herstellungstechnik für die einfache und schnelle Herstellung von Hydrogel-basierte Micromachines mit magnetisch reagieren Komponenten

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

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Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

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Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

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Screening und Identifizierung von kleinen Peptiden Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 mit einem Phage Display Peptid Bibliothek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...