Name: an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

המחברים מודים לחברי המרכז לרפואה רגנרטיבית ב- QUT, בפרט, אנטוניה הורסט ופאבל מייזצ'נק על ההצעות והמשוב המועילים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר לתואר שני של QUT עבור SE, ועל ידי מועצת המחקר האוסטרלית (ARC) תחת הסכם מענקים IC160100026 (מרכז ההכשרה לטרנספורמציה תעשייתית ARC ב- Additive Biomanufacturing). NB נתמך על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) פיטר דוהרטי מלגת מחקר קריירה מוקדמת (APP1091734).

CM ו- DWH הם מייסדים ובעלי מניות של Gelomics Pty בע"מ. CM הוא גם דירקטור של Gelomics Pty בע"מ. המחברים מצהירים על שום ניגוד אינטרסים רלוונטי לנושא מאמר זה. למחברים אין זיקות רלוונטיות אחרות או מעורבות פיננסית עם כל ארגון או גוף בעל אינטרס כספי או סכסוך כספי עם הנושא או החומרים הנדונים במאמר מלבד אלה שנחשפו.

צנרת של חומרים צמיגים, במיוחד הידרוג'לים עבור יישומים ביו-רפואיים19,20,21,33,47, הן משימות שגרתיות במעבדות מחקר רבות להכנת ריכוז מוגדר על ידי המשתמש או סדרת דילול עם ריכוזים שונים. למרות שזה חוזר על עצמו ואת הביצוע הוא פשוט למדי, זה מבוצע בעיקר באופן ידני עם תפוקת מדגם נמוכה18. מדריך זה מציג את הפעולה של תחנת עבודה בקוד פתוח, אשר תוכנן במיוחד עבור חומרים צמיגים, כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של חומרים צמיגים עבור הדור לשחזור של ריכוזים הרצויים. תחנת עבודה זו ממוטבת עבור צנרת של הידרוג'לים כדי לאפשר טיפול אוטומטי ואמין מאוד על ידי שילוב של רציפי טמפרטורה עבור חומרים תרמוספונזיים, פיפטות תזוזה חיוביות לחומרים צמיגים, ומעגן מגע קצה אופציונלי כדי להסיר חומר עודף מהקצה. מודול הצינורות עבר אופטימיזציה ספציפית כדי לאפשר עיבוד של חומר צמיג באופן סטנדרטי ואוטומטי. בהשוואה לפיפטות כרית אוויר (איור 5a), פיפטות עקירה חיוביות (איור 5b) מחלקות חומרים צמיגים מבלי להשאיר שאריות חומר שנותר בקצה, וכתוצאה מכך שאיפות מדויקות וחלוקת כמויות. תחנת המגע האופציונלית מסירה עודפי חומר לדוגמה מהקצה (איור 5c,d), שהוא שימושי לחומרים דביקים (לדוגמה, 4% (w/v) alginate).
יישום מעצב הפרוטוקול מתוכנת במיוחד עבור הידרוג'לים ומאפשר דילול של עד ארבעה ריאגנטים עם ריכוזים שונים ועד שני דילונטים. הסיכון של שגיאות בחישוב של דילול סופי נמנע ביישום זה, כמו משתמשים רק לבחור את הריכוז הרצוי או את שלבי דילול סדרתי. אמצעי אחסון נדרשים של שאיפה וחלוקה מחושבים באופן אוטומטי, נשמרים בקובץ טקסט נפרד של תיעוד ולאחר מכן מתמלאים בקובץ ה- Script של הפרוטוקול. יישום עיצוב פרוטוקול זה מעניק למשתמש שליטה מלאה על כל הפרמטרים הניסיוניים (למשל, מהירות צנרת) ומבטיח תיעוד פנימי של הפרמטרים החשובים. אפליקציית עיצוב הפרוטוקול לוקחת בחשבון את רמת המילוי של המאגר (למשל, ובכן) ומשנה את גובה השאיפה/חלוקה כדי למנוע טבילה מיותרת בחומרים הצמיגיים. תכונה משולבת זו מונעת הצטברות חומר על הקיר החיצוני של הקצה, ובכך, מבטיחה שאיפה אמינה וחלוקת משימות לאורך הפרוטוקול. למרות יישום מעצב הפרוטוקול פותח עבור שלבי דילול הידרוג'ל, זה יכול לשמש גם עבור דילול של נוזלים nonviscous, כגון צבעי אורנג 'G. יישום מעצב הפרוטוקול, הנגיש באמצעות המאגר תחת '/דוגמאות/פרסום-JoVE', הוא הגרסה המוסברת בסעיף הפרוטוקול ומודגשת בסרטון הווידאו. גירסה זו לא תעודכן. עם זאת, גירסה מעודכנת של יישום מעצב הפרוטוקול זמינה דרך דף המאגר הראשי. מסוף הכיול פותח בתחילה על ידי Sanderson48 והוא עבר אופטימיזציה לכיול של פיפטות עקירה חיוביות.
כמתואר בפרוטוקול סעיף 4, פיפטות כמו גם מכולות חייב להיות מכויל בתחילה. תהליך כיול זה חיוני כדי להגדיר ולשמור את העמדות המשמשות לאחר מכן לחישוב מרווחי התנועה. לכן, ביצוע פרוטוקול מוצלח מסתמך על עמדות כיול מוגדרות היטב, כמו נקודות כיול שגויות עלול לגרום לקריסת הקצה לתוך מיכל. מכיוון שמיקום הבוכנה של הפיפטות חייב להיות מכויל באופן ידני, דיוק ודיוק הצינורות תלויים במידה רבה בכיול המבוצע. הליכי כיול אלה תלויים מאוד בחוויית המשתמש עם מודול הצינורות, ולכן, הדרכה עם צוות מנוסה מומלץ בהתחלה כדי להבטיח הליכי כיול נאותים. בנוסף לכיול הידני במודול הצינורות, יש לכייל את הפיפטה עצמה כדי להבטיח צנרת מדויקת. מומלץ לכייל את הפיפטות לפחות כל 12 חודשים כדי לעמוד בקריטריוני הקבלה כמפורט ב- ISO 8655. כדי להעריך את כיול פיפטה באופן פנימי, אימות ואימות זמינים כמתואר על ידי Stangegaard et al.16.
עבור הדור של ערכת נתונים אמינה, זה חיוני כדי להתחיל עם ריאגנטים באיכות גבוהה. הדבר חשוב במיוחד עבור משימות עיבוד הידרוג'ל, שכן וריאציות אצווה לאצווה עשויות להשפיע על התוצאות שנוצרו בפרוטוקול זה. בנוסף לווריאציות של אצווה לאצווה, שינויים עדינים בהכנת אמצעי אחסון קטנים עשויים גם לתרום להבדלים במאפיינים. כדי למנוע זאת, מומלץ להכין כרכים גדולים יותר, אשר ניתן להשתמש בהם עבור הניסויים המלאים.
הליכי האימות והאימות מסתמכים על שימוש בצבע כדי לזהות תערובות אמינות. הפרוטוקול המוצג מתאר את היישום של אורנג ' G, אך ניתן להתאים את זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול והניתוח לצבעים פלואורסצנטיים49,50. השימוש של אורנג 'G מפחית את הדרישות הטכניות של spectrophotometer ומבטל אמצעי זהירות שננקטו כדי למנוע הלבנה של צבעי פלורסנט לאחר חשיפה לאור. בעיות בהתנהגות המסה או היווצרות אשכול של הצבע לא נצפו עם החומרים המוצגים במהלך ניסויים, אבל עשוי להופיע עם חומרים אחרים. היווצרות אשכול פוטנציאלית, ולכן, האינטראקציה בין צבע וחומר ניתן לזהות בקלות עם מיקרוסקופ.
ההליכים והטכניקות המוצגים במדריך זה מוסיפים יכולת אוטומציה לזרימות עבודה נוכחיות עבור חומרים צמיגים כדי להשיג משימות אמינות ביותר עם עבודה אנושית מינימלית. טבלת פתרון הבעיות שסופקה (טבלה 2) כוללת בעיות שזוהו ומציגה סיבות אפשריות וכן פתרונות לפתרון הבעיות. תחנת העבודה שהוצגה הוחלה בהצלחה על חומרים פולימריים טבעיים (ג'לטין, ג'לן גאם, מטריג'ל) וסינתטיים (למשל פולי(אתילן גליקול) [PEG], פלורוני F127, לוטרול F127) חומרים פולימריים למשימות צנרת אוטומטיות. בפרט, השילוב של תחנת עבודה בקוד פתוח ויישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח המיועד לחומרים צמיגים יהיה שימושי מאוד עבור חוקרים העובדים בתחומי ההנדסה הביו-רפואית, מדעי החומר והמיקרוביולוגיה.

רבייה ושכפול הם בעלי חשיבות עליונה בעבודה המדעית 1,2,3,4. עם זאת, עדויות אחרונות הדגישו אתגרים משמעותיים חוזרים על מחקרים ביו-רפואיים בעלי השפעה גבוהה במדעי היסוד, כמו גם במחקר תרגומי4,5,6,7. גורמים התורמים לתוצאות בלתי ניתנות להפרכה הם מורכבים וסעיפים, כגון תכנון מחקר גרוע או מוטה6,8, הספק סטטיסטי לא מספיק3,9, חוסר תאימות לתקני דיווח7,10,11, לחץ לפרסם6, או שיטות לא זמינות או קוד תוכנה6,9 . ביניהם, שינויים עדינים בפרוטוקול וטעויות אנוש בביצוע ניסויים זוהו כאלמנטים נוספים המהווים את חוסר ההתאמה4. לדוגמה, משימות צינור ידניות מציגות חוסר דיוק פנים-אישי ובין-אישי12,13 ומגדילות את ההסתברות לטעויות אנוש14. בעוד רובוטים לטיפול בנוזלים מסחריים מסוגלים להתגבר על חסרונות אלה והפגינו אמינות מוגברת עבור נוזלים15,16,17, טיפול אוטומטי בחומרים עם תכונות צמיגות משמעותיות עדיין מאתגר.
רובוטים מסחריים לטיפול בנוזלים משתמשים בדרך כלל בפיפטות כרית אוויר, הידועות גם בשם בוכנות אוויר או פיפטות תזוזת אוויר. הריאגנט והבוכנה מופרדים על ידי כרית אוויר המתכווצת במהלך חלוקת צעדים ומתרחבת במהלך צעדי השאיפה. באמצעות פיפטות כרית אוויר, חומרים צמיגים "לזרום" רק לאט לתוך ומחוץ לקצה, ונסיגה מוקדמת של פיפטה מהמאגר עלולה לגרום לשאיפה של בועות אוויר. במהלך חלוקת משימות, החומר הצמיג משאיר סרט על קיר הקצה הפנימי אשר "זורם" רק לאט או בכלל לא כאשר נאלץ על ידי אוויר. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיפטות עקירה חיוביות הוצגו מסחרית כדי להפריש באופן פעיל את החומר צמיג מתוך הקצה באמצעות בוכנה מוצקה. למרות שפיפטות עקירה חיוביות אלה מאפשרות טיפול מדויק ואמין בחומרים צמיגיים, פתרונות אוטומטיים עם פיפטות עקירה חיוביות עדיין יקרים מדי עבור הגדרות מעבדה אקדמיות, ולכן, רוב זרימות העבודה עם חומרים צמיגים מסתמכות אך ורק על משימות צינור ידניות18.
באופן כללי, צמיגות מוגדרת כהתנגדות של נוזל לזרום, וחומרים צמיגים מוגדרים עוד יותר כחומרים עם צמיגות גדולה יותר של מים (0.89 mPa·s ב 25 °C (65 °F). בתחום היישומים הביו-רפואיים, תצורות ניסיוניות מכילות לעתים קרובות חומרים מרובים עם צמיגות גדולה יותר מאשר מים, כגון דימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1.99 mPa·s ב-25 °C ), גליצרול (208.1 mPa·s ב-25 °C ב-25 °C עבור 90% גליצרול [v/v]), טריטון X-100 (240 mPa·s ב-25 °C), ופולימרים נפוחים במים, המכונים הידרוג'לים19, 20. הידרוג'לים הם רשתות פולימר הידרופיליות המסודרות במצב פיזי או/כימי המשמש ליישומים שונים, כולל אנקפסולציה של תאים, אספקת תרופות ומפעילים רכים19,20,21,22. הצמיגות של הידרוג'לים תלויה בריכוז הפולימר ובמשקל המולקולרי19. הידרוג'לים המשמשים באופן שגרתי עבור יישומים ביו-רפואיים מציגים ערכי צמיגות בין 1 ל-1000 mPa·s, בעוד שמערכות הידרוג'ל ספציפיות דווחו עם ערכים של עד 6 x 107 mPa·s19,23,24. עם זאת, מדידות צמיגות של הידרוג'לים אינן מתוקננות במונחים של פרוטוקול מדידה והכנה מדגם, ולכן, ערכי צמיגות בין מחקרים שונים קשה להשוות.
מאחר שפתרונות אוטומטיים זמינים מסחרית שתוכננו במיוחד עבור הידרוג'לים חסרים או יקרים מדי, זרימות העבודה הנוכחיות עבור הידרוג'ל תלויות בטיפול ידני18. כדי להבין את המגבלות של זרימת העבודה הידנית הנוכחית עבור צנרת של הידרוג'לים, חשוב להבין משימות טיפול חיוניות18. לדוגמה, לאחר חומר הידרוג'ל רומן כבר מסונתט, ריכוז הרצוי או סדרת דילול עם ריכוזים שונים נוצר כדי לזהות פרוטוקולי סינתזה אמינים ומאפייני crosslinking עם ניתוח עוקב של המאפיינים המכניים25,26,27,28 . באופן כללי, פתרון מלאי מוכן או נרכש, ולאחר מכן מעורבב עם דילול ו /או ריאגנטים אחרים כדי לקבל תערובת. משימות הערבוב לרוב אינן מבוצעות ישירות בצלחת באר (או בכל תבנית פלט), והן מבוצעות דווקא בצינור תגובה נפרד, המכונה בדרך כלל תערובת ראשית. במהלך משימות הכנה אלה, נדרשים צעדי שאיפה וחלוקה שונים כדי להעביר את החומרים הצמיגים, לערבב את הריאגנטים ולהעביר את התערובת לפורמט פלט (למשל, צלחת באר 96). משימות אלה דורשות כמות גבוהה של עבודה אנושית18, שעות ניסוי ארוכות, ולהגדיל את ההסתברות לטעויות אנוש שעלולות להתבטא כתוצאות לא מדויקות. יתר על כן, טיפול ידני מונע הכנה יעילה של מספרי מדגם גבוהים כדי לסנן שילובי פרמטרים שונים לאפיון מפורט. העיבוד הידני גם מעכב את השימוש הידרוג'לים עבור יישומי סינון תפוקה גבוהה, כגון זיהוי של תרכובות מבטיחות במהלך פיתוח תרופות. שלבי ההכנה הידניים הנוכחיים אינם אפשריים לסינון ספריות סמים המורכבות מאלפי תרופות. מסיבות אלה, נדרשים פתרונות אוטומטיים כדי לספק תהליך פיתוח יעיל ולאפשר תרגום מוצלח של הידרוג'לים ליישומי סינון תרופות.
כדי לעבור מזרימות עבודה ידניות לתהליכים אוטומטיים, מיטבנו רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי לטיפול בחומרים צמיגיים על ידי שילוב רציפי טמפרטורה לחומרים תרמו-רספונזיים, שימוש בפיפטות עקירה חיוביות מחוץ למדף באמצעות טיפים של בוכנה נימית, ומעגן מגע קצה אופציונלי לניקוי קצה פיפטה. רובוט צנרת זה שולב עוד יותר כמודול צנרת לתחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, המורכבת ממודולים מוכנים להתקנה הניתנים להתאמה אישית18,29. הוראות הרכבה מפורטות עבור תחנת העבודה שפותחה כולל קבצי חומרה ותוכנה נגישות באופן חופשי מ- GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) ומאגר Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). בנוסף לפיתוח החומרה, יישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח תוכנת ושוחרר כדי להנחות את המשתמש בתהליך בחירת הפרמטר וליצור קוד פרוטוקול מוכן לשימוש (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). קוד זה פועל על רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי, כמו גם על תחנת העבודה קוד פתוח שפותחה.
להלן, הדרכה מקיפה מסופקת על פעולת תחנת העבודה בקוד פתוח כדי להפוך משימות ערבוב לאוטומטיות עבור חומרים צמיגיים (איור 1). ניתן לבצע את שלבי הפרוטוקול הספציפיים להדרכה עם תחנת העבודה שפותחה בקוד פתוח, כמו גם עם רובוט צנרת הקוד הפתוח המסחרי. נתמך על ידי יישום עיצוב פרוטוקול קוד פתוח שפותח בתוך הבית, ערבוב אוטומטי והכנה של ריכוזים נדרשים עבור גליצרול, מתקרילויל ג'לטין (GelMA) ו alginate הוא הודגם. גליצרול נבחר במדריך זה, שכן הוא מאופיין היטב 30,31, הוא זול וזמין, ולכן, הוא משמש בדרך כלל כחומר התייחסות צמיג עבור משימות צינור אוטומטיות. כדוגמאות להידרוג'לים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים, פתרונות מבשרים של GelMA ו- alginate hydrogel יושמו לניסויי ערבוב אוטומטיים. GelMA מציגה את אחד ההידרו-ג'לים הנפוצים ביותר למחקרי אנקפסולציה של תאים32,33, ואלגינט נבחר במחקר זה כדי להדגים את היכולת לייצר הידרוג'לים ברשת כפולה34,35. באמצעות אורנג 'G כצבע, הליך מהיר וזול יושם כדי לאמת ולאמת את תוצאות הערבוב עם spectrophotometer16.
רובוט צנרת קוד פתוח מסחרי שולב כמודול צנרת בתחנת העבודה שפותחה בקוד פתוח (איור 2a), ולכן השם 'מודול צנרת' משמש עוד יותר לתיאור רובוט הצינורות. תיאור מפורט של החומרה המותקנת חורג מהיקף הפרוטוקול וזמין באמצעות המאגרים שסופקו הכוללים גם הוראות שלב אחר שלב לאסיפה הכללית של פלטפורמת הקוד הפתוח. מודול הצינורות יכול להיות מצויד בשתי פיפטות (פיפטה חד-ערוצית או 8 ערוצים) המותקנות על ציר A (מימין) וציר B (משמאל) (איור 2b). מודול הצינורות מציע קיבולת של 10 סיפון על פי תקני מכון התקנים הלאומי האמריקאי /האגודה לאוטומציית מעבדה וסינון (ANSI/SLAS), ועמדות המיקום הבאות מוגדרות על הסיפון: A1, A2, B1, B2, B2, C1, C2, D1, D1, D2, E1, E2 (איור 2c). כדי ליזום פילמור המושרה בצילום של פתרונות הידרוג'ל, נדרש מודול crosslinker נפרד ונוסף לתחנת העבודה. מודול crosslinker מצויד נורות LED עם אורך גל של 400 ננומטר, ולכן, חומרים המרגשים באורך גל אור גלוי ניתן להשתמש עם המערכות הנוכחיות, כגון ליתיום פניל-2,4,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. ניתן לטפל בעוצמת (ב- mW/cm2) של נוריות ה- LED על-ידי המשתמש ביישום עיצוב הפרוטוקול כדי ללמוד את אופן הפעולה של קישור צולב38. תחנת העבודה כוללת גם מודול אחסון המאפשר מחקרי תפוקה מוגברת; עם זאת, מודול זה אינו משמש בתוך מחקר זה, ולכן, לא מתואר עוד יותר. באופן כללי, מומלץ להפעיל את מודול הצינורות בארון בטיחות ביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם. מעגל החשמל הראשי להפעלת מודול הצינורות הוא מעגל V 12, הנחשב ליישום מתח נמוך ברוב המדינות. כל הרכיבים החשמליים ממוקמים בתיבת בקרה ייעודית המונעת ממשתמשים לבוא במגע עם מקור הסכנה החשמלית.
על ידי ביצוע פרוטוקולי ערבוב מתוקננים אלה, חוקרים מסוגלים להשיג תערובות אמינות עבור חומרים צמיגים, כמו גם לא צמיגים בצורה אוטומטית. גישת הקוד הפתוח מאפשרת למשתמשים למטב רצפי ערבוב ולשתף פרוטוקולים שפותחו לאחרונה עם הקהילה. בסופו של דבר, גישה זו תאפשר סינון של שילובי פרמטרים מרובים כדי לחקור את התלות ההדדית בין גורמים שונים, ובכך, להאיץ את היישום והפיתוח האמין של חומרים צמיגים עבור יישומים ביו-רפואיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-959-53A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:260px;">5 mL tubes</td>
			<td style="width:301px;">Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SCT-5ML</td>
			<td style="width:301px;">size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14-432-22</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;70% w/w Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">LabChem, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">aja726-5Lpl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">96-well plate</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Alginate</td>
			<td style="width:301px;">NovaMatrix</td>
			<td align="right" style="width:203px;">4200001</td>
			<td>https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Demineralized or ultrapure (MilliQ) water</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:260px;">Gelatin methacryloyl (GelMA)</td>
			<td style="width:301px;">Synthetized in-house</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:301px;">detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich, Inc. (USA)</td>
			<td align="right" style="width:203px;">900889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">M4 and M5 Allen key</td>
			<td style="width:301px;">OpenBuilds, inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">179, 190</td>
			<td>also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">OrangeG</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific (USA)</td>
			<td style="width:203px;">O267-25</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">&#65279;Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:301px;">Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">14190-144</td>
			<td style="width:301px;">alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Equipment</td>
			<td style="width:301px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Aluminium blocks for temperature dock</td>
			<td style="width:301px;">Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia)</td>
			<td style="width:203px;">SB16</td>
			<td>blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">&#65279;Analytical balance</td>
			<td style="width:301px;">Sartorius AG (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">ED224S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Open source liquid handling robot: commercial product</td>
			<td style="width:301px;">Opentrons Laboratories, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">OT-One S Pro</td>
			<td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td>Open source liquid handling robot: open source hardware</td>
			<td>Assembled in-house following an open source approach</td>
			<td></td>
			<td>hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:260px;">Positive displacement pipette: MicromanE</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">FD10006</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">BMG LABTECH GmbH (Germany)</td>
			<td style="width:203px;">CLARIOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Tips: capillary pistons</td>
			<td style="width:301px;">Gilson, Inc. (USA)</td>
			<td style="width:203px;">F148180</td>
			<td>depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an open source technology platform to manufacture hydrogel-based 3d culture models in an automated and standardized fashion

שלבי הערבוב הנוכחיים של חומרים צמיגים מסתמכים על משימות שחוזרות על עצמן וגוזלות זמן רב, המבוצעות בעיקר באופן ידני במצב תפוקה נמוכה. בעיות אלה מייצגות חסרונות בזרימות עבודה שעלולות בסופו של דבר לגרום ליחס הדדי של ממצאי מחקר. זרימות עבודה ידניות מגבילות עוד יותר את ההתקדמות והאימוץ הנרחב של חומרים צמיגיים, כגון הידרוג'לים המשמשים ליישומים ביו-רפואיים. ניתן להתגבר על אתגרים אלה באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות עם תהליכי ערבוב סטנדרטיים כדי להגביר את יכולת הרבייה. במחקר זה, אנו מציגים הוראות שלב אחר שלב לשימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח, להפעלת תחנת עבודה בקוד פתוח ולזיהוי תערובות הניתנות לשחזור. באופן ספציפי, מעצב פרוטוקול הקוד הפתוח מנחה את המשתמש באמצעות בחירת הפרמטרים הניסיונית ויוצר קוד פרוטוקול מוכן לשימוש כדי להפעיל את תחנת העבודה. תחנת עבודה זו ממוטבת להזרמת חומרים צמיגיים כדי לאפשר טיפול אוטומטי ואמין ביותר על ידי שילוב של רציפי טמפרטורה עבור חומרים תרמו-רזפונזיים, פיפטות תזוזה חיוביות לחומרים צמיגיים, ומעגן מגע קצה אופציונלי להסרת חומר עודף מקצה הפיפטה. האימות והאימות של תערובות מבוצעים על ידי מדידת ספיגה מהירה וזולה של אורנג 'G. פרוטוקול זה מציג תוצאות כדי להשיג 80% (v/v) תערובות גליצרול, סדרת דילול עבור ג'לטין methacryloyl (GelMA), הידרוג'לים רשת כפולה של 5% (w / v) GelMA ו 2% (w / v) אלגינט. מדריך לפתרון בעיות כלול כדי לתמוך במשתמשים עם אימוץ פרוטוקול. זרימת העבודה המתוארת יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על מספר חומרים צמיגים כדי ליצור ריכוזים המוגדרים על ידי המשתמש באופן אוטומטי.

Watch this Scientific Journal Video about An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion at JoVE.com

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

פרוטוקול זה משמש כמדריך מקיף לערבוב סטנדרטי וניתן לשחזור של חומרים צמיגים עם טכנולוגיית אוטומציה חדשנית בקוד פתוח. הוראות מפורטות ניתנות על פעולתה של תחנת עבודה בקוד פתוח שפותחה לאחרונה, על השימוש במעצב פרוטוקול קוד פתוח ועל האימות והאימות לזיהוי תערובות הניתנות לשחזור.

פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח לייצור דגמי תרבות תלת-ממדית מבוססי הידרוג'ל באופן אוטומטי ומתוקנן

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

מחקר ביו-רפואי עומד בפני משבר רבייה בכך שממצאי מחקר חדשים מתורגמים לעתים רחוקות ליישומים טיפוליים. פרוטוקול זה מפחית את הגורם האנושי ומכניס אוטומציה ותקינה לייצור. שיטה זו מתמקדת במיוחד על הידרוג'לים צולבים תמונה עבור יישומי תרבית תאים 3D כמו הידרוג'לים הפכו לפלטפורמה הנפוצה ביותר בסרטן ומודלים אחרים של רקמת מחלה בעשור האחרון.טיפלנו בהצלחה במגבלות החומרה והתוכנה הנוכחיות עם פיתוח פלטפורמת טכנולוגיית קוד פתוח. פלטפורמה זו תוכננה במיוחד עבור הידרוג'לים ומאפשרת זרימות עבודה אוטומטיות לייצור למחקר הנדסת רקמות. כדי להתקין את ה- API, פתח את ממשק שורת הפקודה.כדי להתקין את ה- API של העבודה, הזן תחנת עבודה פתוחה של התקנת pip והקש Enter. כדי להפעיל את מודול הייצור הביולוגי של pipetting, הזן את הפקודה כדי להתקין את ה- API של opentrons. לאחר מכן השתמש בשורת הפקודה כדי לפתוח קובץ Script של Python ולוודא אם שני ממשקי ה- API הותקנו בהצלחה.כדי ליצור את קוד הפרוטוקול, פתח את יישום עיצוב הפרוטוקול כדי ליצור קובץ Script של פרוטוקול מותאם אישית שיבוצע על-ידי הפלטפורמה. הממשק פועל בכל דפדפן אינטרנט נפוץ. הזן את שם הפרוטוקול בדף ההתקנה ולחץ על המשך.בהגדרת מגש הקלט, בחר בלוק חימום של שלושה על ארבעה כדי להגדיר את מגש הקלט. כדי להגדיר את החומרים וריכוזי המלאי, בחר ג'ל 1 מתפריט הגדרת תשומות והזן את GelMA כשם. הגדר את ריכוז המלאי ל- 20% ואת מספר הדגימות לשלוש ולחץ על הוסף כדי לשמור את הערכים וכדי למלא את העמודה הראשונה.בחר ג'ל 2 מתפריט הגדרת קלט והזן Alginate כשם. הגדר את ריכוז המניות ל- 4% ואת מספר הדגימות לשלוש ולחץ על הוסף כדי לשמור את הערכים וכדי למלא את העמודה השניה. לאחר הגדרת הפרמטרים הפוטוטו-initiator והדילול כפי שהודגמו, בחר קישור צולב של תמונות, הגדר את השעה ל- 30 שניות ואת העוצמה לשתיים ולחץ על אישור. לאחר מכן, הגדר את סוג צלחת הבאר לצלחת באר 96 ולחץ על קבוצה 1 כדי לאפשר את הפרמטרים ליצירת הידרוג'ל רשת כפולה להיות מצוין.לאחר מכן סמן את התיבה החל פרוטוקול ערבוב מתקדם במידת הצורך, הגדר את מספר הדגימות ל- 96 ולחץ על המשך. כדי להגדיר את פריסת הסיפון, בחר את סוג המגש המתאים עבור כל חריץ. כאשר כל סוגי המגשים נבחרו, לחץ על התיבה הימנית של פיפטה ובחר תזוזה חיובית של 10 עד 100 מיקרוליטר מהתפריט הנפתח.הגדר את מהירות השאיפה ל-600 ואת מהירות החלוקה ל-800. לאחר מכן הגדר את הפרמטרים הנכונים של פיפטה באותו אופן. לאחר מכן לחץ על צור פרוטוקול כדי ליצור ולשמור את קובץ ה- Script של הפרוטוקול.לפני ביצוע הפרוטוקול, לרסס את החומרים המתכלים עם 70% אתנול ולמקם אותם על פי ההתקנה המוגדרת בהגדרת המשתמש. הנח את צינורות התגובה עם החומרים בבלוק האלומיניום על רציפי הטמפרטורה על פי ההתקנה שנבחרה. לאחר מכן, לרסס את הכפפות שלך עם 70% אתנול ולפתוח את צינורות התגובה בזהירות מבלי לגעת צינורות פתוחים.כאשר החומרים הגיעו לטמפרטורת הניסוי המתאימה, הפעל את הפרוטוקול שנוצר באמצעות ממשק המשתמש. תחנת העבודה תתחיל בתהליך הביות, ולאחר מכן תקבל צלחת באר ריקה ממודול האחסון. לאחר הסרת המכסה מלוחית הבאר, הצלחת מועברת למודול הבא.הפרוטוקול מציין את אמצעי האחסון המועבר מכל פתרון מלאי ומשנה באופן אוטומטי את העצות לאחר כל חומר כדי למנוע זיהום צולב. כדי לערבב פתרונות צמיגים באופן ניתן לשחזור, תחנת העבודה מבצעת פרוטוקול ערבוב ספציפי שעבר אופטימיזציה להידרו-ג'לים צמיגים. אפליקציית עיצוב הפרוטוקול לוקחת בחשבון את רמת המילוי של המאגר ומתאימה באופן אוטומטי את גובה הערבוב כדי למנוע טבילה מיותרת בחומרים הצמיגיים.לאחר יצירה אוטומטית של דגמי תלת-ממד ולוחות היטב, תחנת העבודה סוגרת שוב את צלחת הבאר עם המכסה ומאחסנת את צלחת הבאר במיקום המתוכנת במודול האחסון. לאחר סיום הפרוטוקול, הסר את הצלחת ממודול האחסון. לצורך אימות ואימות של הפרוטוקול שנערך, לטעון את הצלחת על spectrophotometer ולקרוא את הספיגה פעמיים ב 450 ננומטר.לאחר שמירת ערכי הספיגה, פתח את קובץ הגיליון האלקטרוני של הניתוח המסופק כחומר משלים בפרסום והעתק את קריאות הספיגה לטבלה בגליון הנתונים הגולמי. לאחר מכן לחץ על גיליון הניתוח כדי להציג את הערכים הממוצעים, את סטיית התקן ואת מקדם ערכי השונות, אשר מחושבים באופן אוטומטי ומוצגים עבור התפלגות מדגם אחידה עבור שורות ספציפיות עבור עמודות ספציפיות עבור לוח 96 היטב. כדי למצוא את ההתקנה המבטיחה רבייה גבוהה עבור פתרונות גליצרול, פרוטוקולים נוצרו ללא בקרת טמפרטורה וללא מגע קצה, עם בקרת טמפרטורה וללא מגע קצה, או עם בקרת טמפרטורה עם מגע קצה.המקדם המחושב של ערכי וריאציה עבור שלוש ההגדרות חשף השפעה משמעותית של עגינה בטמפרטורה ופונקציית מגע קצה, המדגיש את היכולת של הפרוטוקול להפיק תוצאות ניתנות לשחזור גבוהות בעת שימוש בשתי התכונות. באמצעות פונקציית מגע קצה עם רציף הטמפרטורה, סטיית התקן צומצמה באופן משמעותי בהתקנה שלוש. התוויית ערכי ספיגת המדגם עבור ההתקנה השלישית לא הניבה ערכים עולים או יורדים לאורך הניסוי ולכן לא הצביעה על השפעה של מיקום המדגם על ערכי הספיגה.לאחר מכן, סדרת דילול של GelMA הוכנה על ידי דילול פתרון מניית GelMA של 20% והערכת ההבדלים בין דילולים שונים של GelMA. ערך הספיגה שנמדד בכל שלב ריכוז היה שונה באופן משמעותי ורגרסיה ליניארית הפגינה התאמה גבוהה המאשרת את היכולת של צעדי ריכוז ברורים להיווצר. בנוסף, ההשפעה של מגע קצה הוערך עבור הידרוג'לים רשת כפולה עם 5%GelMA, 2%alginate, ו 0.15%LAP, אשר נוצרו באופן אוטומטי עם ההתקנה.השילוב של מגע קצה מביא לירידה משמעותית של סטיית התקן התומכת ביצירת ערכת נתונים הניתנת לשחזור. הדמיה של ערכי הספיגה ומפות החום אישרה את הסטייה המופחתת בעת שימוש במגע קצה כדי להסיר חומר עודף מהקצה. הטכנולוגיה שלנו מאפשרת אוטומציה של ייצור הידרוג'ל לתרבות תאים תלת-ממדית והנדסת רקמות.זהו פתרון בעלות נמוכה להגדלת התפוקה והשחזור של זרימות עבודה מאתגרות מבחינה טכנית. על ידי מתן גישת קוד פתוח הניתנת להתאמה אישית, טכנולוגיה זו סוללת את הדרך להתאמה נרחבת של אוטומציה של תהליכים במחקר הנדסת רקמות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Ocular כדי לבדוק עדשות מגע

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

תוסף טכניקת הייצור עבור הזיוף נתיישב ומהירה של מבוססי הידרוג Micromachines עם רכיבים תגובה מגנטית

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

עיצוב של מקור פתוח, ביודיו בעלות נמוכה ומזון נמס ההבלטה מדפסת תלת-ממד

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

יישומים ללוחות תאורה בקוד פתוח מיקרופלייט

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

הקרנה וזיהוי של פפטידים קטנים פילוח הצמיחה פיברוהפיצוץ מקדם Receptor2 באמצעות ספריית Phage התצוגה פפטיד

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

פרוטוקולים של 3D ביוריטינג ג'לטין הידרוג'ל מבוסס-דיו

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...